轉(zhuǎn)移的藥物可以通過靶向敲降Par3，激活抑癌信號通路 Hippo-YAP的表達，并最終抑制原癌基因YAP入核，從而阻滯下游促轉(zhuǎn)移基因的轉(zhuǎn)錄，抑制 前列腺癌的轉(zhuǎn)移。
[0023] 所述的抑制前列腺癌的侵潤的藥物可以通過靶向敲降Par3,激活抑癌信號通路 Hippo-YAP的表達，并最終抑制原癌基因YAP入核，從而阻滯下游促侵潤基因的轉(zhuǎn)錄，抑制 前列腺癌的侵潤。
[0024] 本發(fā)明首次從極性分子表達以及定位改變的角度探討其對前列腺癌轉(zhuǎn)移的調(diào)控 作用。本發(fā)明中首次探討了Par3的表達改變對于前列腺癌轉(zhuǎn)移的影響。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn) 下調(diào)Par3的表達可以有效地抑制前列腺癌的侵潤/轉(zhuǎn)移。通過分子機制研究，本發(fā)明首次 發(fā)現(xiàn)Par3是一條轉(zhuǎn)移相關(guān)重要信號通路Hippo-YAP可能的上游。本發(fā)明的意義之一是首 次在人類的前列腺癌細胞中驗證了極性分子Par3是調(diào)控Hippo-YAP信號通路的上游分子 之一，并且通過這一通路參與了對前列腺癌侵潤/轉(zhuǎn)移的調(diào)控。
[0025] 本發(fā)明通過構(gòu)建穩(wěn)定敲降Par3的前列腺癌亞克隆細胞系并結(jié)合前列腺癌原位植 瘤模型，在體內(nèi)、體外評估了敲降Par3對于前列腺癌侵潤/轉(zhuǎn)移的抑制作用。本發(fā)明發(fā)現(xiàn) 穩(wěn)定敲降Par3可以激活抑癌信號通路Hippo-YAP的表達導(dǎo)致原癌基因YAP無法入核，從而 抑制下游多種促轉(zhuǎn)移基因的轉(zhuǎn)錄，實現(xiàn)了對前列腺癌侵潤/轉(zhuǎn)移的抑制作用。本發(fā)明發(fā)現(xiàn) 穩(wěn)定敲降Par3通過調(diào)控Hippo-YAP信號通路可以有效地抑制前列腺癌的侵潤和轉(zhuǎn)移，提示 了將Par3作為一種潛在的藥物靶點可應(yīng)用于針對前列腺癌侵潤、轉(zhuǎn)移的靶向基因治療中。 該發(fā)明為前列腺癌的診斷和預(yù)后提供了積極的借鑒意義。該發(fā)明涉及的研究方法也為其他 腫瘤侵潤/轉(zhuǎn)移的相關(guān)研究提供方法學(xué)的指導(dǎo)。
[0026] 本發(fā)明評估了Par3作為潛在的治療靶點應(yīng)用于靶向基因治療前列腺癌侵潤/轉(zhuǎn) 移的可行性，為進一步的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。具體是通過在前列腺癌細胞系PC3中（此處 以人的前列腺癌細胞系PC3為例，但不限于此，詳見實施例1，附圖1)構(gòu)建穩(wěn)定敲降Par3 的亞克隆細胞系PC3_shPar3(相應(yīng)對照為PC3_con)。在體外，通過transwell實驗（詳見 實施例2)及劃痕實驗（詳見實施例3)評估穩(wěn)定敲降Par3抑制前列腺癌細胞迀移的能力。 實驗發(fā)現(xiàn)，在體外穩(wěn)定敲降Par3后腫瘤細胞的侵潤能力（侵潤細胞數(shù)量/視野）下降為對 照的80. 5% (附圖2);迀移能力（迀移細胞數(shù)量/視野）下降為對照的66. 6% (附圖2); 同時，相比對照，穩(wěn)定敲降Par3后前列腺癌細胞劃痕愈合的能力（反映細胞貼壁迀移運動 的能力）顯著下降（附圖3)。在體內(nèi)，通過前列腺癌細胞系原位植瘤，發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定敲降Par3 后腫瘤細胞在前列腺原位的生長顯著減小，對于前列腺旁淋巴結(jié)的侵潤以及向遠端器官組 織的轉(zhuǎn)移顯著降低（附圖4)。
[0027] 本發(fā)明首次在前列腺癌細胞系中發(fā)現(xiàn)并鑒定Par3是已知的一條重要抑癌信號通 路Hippo-YAP通路的上游調(diào)控分子。分別通過免疫共沉淀（coIP)，實時定量PCR(qRT-PCR)， 蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot)實驗和免疫熒光染色（IF)實驗（附圖5)，發(fā)現(xiàn)特異性穩(wěn) 定敲降Par3后，抑制了Par3-aPKC-KIBRA三元復(fù)合物的形成，促進Hippo-YAP通路中抑癌 基因MST1/2,Latsl/2的表達顯著上升，同時Latsl蛋白磷酸化水平顯著增高，提示了特異 性敲降Par3后恢復(fù)了Latsl蛋白的活性，激活了該抑癌信號通路。
[0028] 本發(fā)明首次在前列腺癌細胞系中發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定敲降Par3可以通過激活Hippo-YAP通 路，導(dǎo)致下游原癌基因YAP的磷酸化，從而將其滯留在細胞質(zhì)中[14]，阻止該蛋白入核。通 過qRT-PCR，細胞核-質(zhì)分離后WesternBlot和免疫熒光（IF)實驗（附圖6)，發(fā)現(xiàn)特異性 穩(wěn)定敲降Par3后，在細胞質(zhì)中YAP的磷酸化水平顯著上升，在細胞核中非磷酸化的YAP蛋 白量顯著下降，提示了特異性穩(wěn)定敲降Par3后原癌基因YAP的活性受到抑制，阻止其向下 游傳遞促進轉(zhuǎn)移的信號。
[0029] 本發(fā)明首次在前列腺癌細胞系中鑒定并驗證MMPUMMP9、Zebl、Snaill及Twistl 為YAP蛋白調(diào)控的促侵潤/轉(zhuǎn)移基因。通過染色質(zhì)免疫共沉淀（Chip)，qRT-PCR，和Western Blot(附圖7)，發(fā)現(xiàn)非磷酸化的YAP蛋白與已知的TEAD轉(zhuǎn)錄因子家族（主要是TEAD1， TEAD2,TEAD4)互作后，可以結(jié)合在上述基因的啟動子區(qū)域，激活上述基因的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)特異 性穩(wěn)定敲降Par3后，阻滯了非磷酸化的YAP蛋白的入核，抑制了上述基因的轉(zhuǎn)錄，在分子水 平上發(fā)揮抑制前列腺癌細胞侵潤/轉(zhuǎn)移的作用（附圖8)。
[0030] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：
[0031] 本發(fā)明通過構(gòu)建穩(wěn)定敲降Par3的前列腺癌細胞亞克隆細胞系，并建立相應(yīng)的裸 小鼠前列腺原位植瘤動物模型，在體外及體內(nèi)驗證了穩(wěn)定敲降Par3抑制前列腺癌侵潤及 轉(zhuǎn)移的作用。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定敲降Par3后，通過破壞Par3-aPKC-KIBRA三元復(fù)合物的形 成，增強了Hippo通路中重要成員MST1/2及Latsl的磷酸化，從而激活了Hippo通路并磷 酸化其下游的原癌基因YAP，導(dǎo)致YAP蛋白的細胞質(zhì)滯留并減少非磷酸化YAP蛋白的入核， 最終削弱了YAP在細胞核內(nèi)與TEAD轉(zhuǎn)錄因子的互作并抑制一系列促侵潤/轉(zhuǎn)移基因的轉(zhuǎn) 錄。本發(fā)明在體內(nèi)體外、表型及分子機制上均驗證了穩(wěn)定敲降極性分子Par3具有抑制前列 腺癌細胞侵潤及轉(zhuǎn)移的作用。提示了將極性分子Par3作為一種全新的潛在治療靶點應(yīng)用 于前列腺癌的臨床治療具有廣闊的前景。
【附圖說明】
[0032] 圖1:穩(wěn)定敲降Par3的前列腺癌亞克隆細胞系的構(gòu)建和鑒定結(jié)果圖。將分選所得 的EGFP陽性細胞使用Trizol裂解并分別提取總RNA。使用TAKARA公司mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒 進行總RNA反轉(zhuǎn)錄。使用Τ0Υ0Β0公司的SYBR-Green試劑通過qRT-PCR實驗檢測Par3mRNA 的表達水平。結(jié)果顯示穩(wěn)定表達shPar3#l可使Par3表達水平敲降為對照的32%，穩(wěn)定表 達shPar3#2可使Par3表達水平敲降為對照的40%。使用WesternBlot檢測Par3蛋白表 達水平的結(jié)果與qRT-PCR的實驗結(jié)果一致，表明后續(xù)實驗所需的穩(wěn)定敲降Par3的前列腺癌 亞克隆細胞系已成功建立。我們使用穩(wěn)定表達shPar3#l獲得的亞克隆細胞系，將其命名為 PC3-shPar3細胞，相應(yīng)對照命名為PC3-con，用于后續(xù)實驗。* *:p< 0. 01
[0033] 圖2 :體外迀移和侵襲實驗結(jié)果圖。對PC3_con和PC3_shPar3組細胞進行腫瘤細 胞迀移（無基質(zhì)膠包被）和侵襲（有基質(zhì)膠包被）實驗。通過固定、染色、顯微攝影及統(tǒng)計 計數(shù)，發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定敲降Par3之后，PC3細胞的迀移和侵襲能力均處于下調(diào)狀態(tài)，提示在體外穩(wěn) 定敲降Par3對于前列腺癌細胞的迀移和侵襲具有抑制作用。顯微放大倍數(shù)為200倍，* *: p< 0. 01 〇
[0034] 圖3 :體外劃痕實驗結(jié)果圖。將PC3-con和PC3_shPar3細胞進行常規(guī)消化并接種 于6孔板中進行劃痕實驗。劃痕后在含2 %血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)0小時、24小時和48小時 后分別進行顯微攝影。結(jié)果顯示，低血清培養(yǎng)24小時和48小時后PC3-con細胞的劃痕愈 合速度顯著大于PC3-shPar3細胞，提示在體外穩(wěn)定敲降Par3之后抑制了前列腺癌細胞系 貼壁迀移能力。顯微放大倍數(shù)為100倍。
[0035]圖4:體內(nèi)前列腺原位植瘤圖。（a)裸小鼠體內(nèi)前列腺原位植瘤實驗策略。先將 PC3-con和PC3-shPar3細胞分別皮下植瘤，待腫瘤長到較合適的體積（~lcm3,約4周時 間）后取出腫瘤組織。消化腫瘤組織將人源前列腺癌亞克隆細胞接種于裸小鼠前列腺左前 腹葉。（b)原位植瘤8周后處死小鼠，觀察并摘取相關(guān)器官。結(jié)果顯示，穩(wěn)定敲降Par3后， 人源前列腺癌細胞在其他前列腺葉中的器官內(nèi)原位生長、器官內(nèi)侵潤/轉(zhuǎn)移、前列腺旁淋 巴結(jié)的近處轉(zhuǎn)移以及肝臟的遠處轉(zhuǎn)移均顯著下降，提示了穩(wěn)定敲降Par3可以有效地抑制 人的前列腺癌細胞轉(zhuǎn)移。黑色實線箭頭指示前列腺腫瘤的原位生長；黑色虛線箭頭指示腫 瘤在前列腺旁淋巴結(jié)的近處轉(zhuǎn)移；白色箭頭指示膀胱；白色三角形指示腫瘤在肝臟部位的 大型轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)。白色虛線范圍內(nèi)為大量的小型轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)。
[0036] 圖5 :鑒定Par3是Hippo-YAP通路的上游調(diào)控分子圖。（a)使用PC3細胞裂解產(chǎn)物 做co-IP實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Par3、aPKC均可與KIBRA相互結(jié)合，此外KIBRA蛋白還可與MST1， Latsl蛋白相互結(jié)合。（b)穩(wěn)定敲降Par3后，磷酸化aPKC的表達水平顯著上調(diào)，KIBRA的表 達顯著下調(diào)，暗示了在體外穩(wěn)定敲降Par3可能破壞Par3-aPKC-KIBRA復(fù)合體的形成。（c) 將PC3-con、PC3-shPar3細胞使用Trizol常規(guī)方法分別提取總RNA并進行常規(guī)的mRNA反 轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后，使用SYBR-Green試劑進行qR