06個PC3-con或PC3-shPar3細(xì)胞（以此為例，但不限于此）與等 體積的matrigel(終濃度為50%，BD公司）于冰上混勾，在6周齡雄性裸鼠的左、右大腿外 偵吩別皮下植瘤，待腫瘤長到較合適的體積lcm3,約4周時間）后取出腫瘤塊。在超凈 臺中使用組織剪將腫瘤塊剪碎，加入4毫升IV型膠原酶，終濃度為1毫克/毫升（購于Life Technology公司），于37°C水搖床中消化20分鐘，再加入1毫升0.05%胰酶（含0.02% EDTA)繼續(xù)消化5分鐘。使用DMEM完全培養(yǎng)基終止消化后使用水平離心機(jī)在lOOOrpm轉(zhuǎn)速 下離心5分鐘。將收集的細(xì)胞沉淀用10毫升PBS重懸，再次在相同條件下離心用以去除殘 余的酶及培養(yǎng)基成分。再次將細(xì)胞沉淀用1毫升PBS重懸，使用40微米孔徑細(xì)胞篩過濾除 去脂肪組織和結(jié)締組織成分，將實施例1中的構(gòu)建的人源前列腺癌亞克隆細(xì)胞系PC3-con、 PC3-shPar3細(xì)胞，在37°C培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)24小時。將已培養(yǎng)24小時的上述細(xì)胞進(jìn)行常 規(guī)的細(xì)胞消化并制備細(xì)胞懸液，終濃度為2. 5x107個細(xì)胞/毫升。使用異氟烷與空氣混合 氣體對手術(shù)小鼠進(jìn)行麻醉并固定于小動物手術(shù)板上。手術(shù)前先將8周齡雄性裸小鼠（已性 成熟）腹部分別用碘伏和酒精消毒皮膚，使用組織剪在小鼠下腹部中線處分別將皮膚及肌 肉剪開約1厘米，使用眼科鑷小心分離小鼠儲精囊并暴露于體外。在20微升細(xì)胞懸液（約 0· 5x106個細(xì)胞）中于冰上加入8. 6微升matrigel(終濃度為30%)充分混勻。使用31G 針頭的胰島素注射器（購于BD公司）將細(xì)胞接種于前列腺左前腹葉（緊貼于左側(cè)儲精囊 下方的透明囊狀器官），勻速緩慢注射防止細(xì)胞外滲至腹腔。注射后1~2分鐘，用眼科鑷 輕觸注射部位，確認(rèn)細(xì)胞-matrigel混合液已凝固后將儲精囊推回腹腔中復(fù)位。使用4號 縫合線縫合腹部肌肉，6號縫合線縫合皮膚。術(shù)后小鼠飼養(yǎng)時在飲用水中加入1/1000廣譜 抗生素防止傷口感染。在術(shù)后8周時處死小鼠，觀察并摘取相關(guān)器官。結(jié)果顯示，穩(wěn)定敲降 Par3后，人源前列腺癌細(xì)胞在其他前列腺葉中的器官內(nèi)原位生長、器官內(nèi)侵襲/轉(zhuǎn)移、前列 腺旁淋巴結(jié)的近處轉(zhuǎn)移以及肝臟的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均顯著下降（附圖4b)，提示了穩(wěn)定敲降Par3 可以有效地抑制人的前列腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。
[0055] 實施例5
[0056] 鑒定Par3是Hippo-YAP通路的上游調(diào)控分子（以PC3細(xì)胞，PC3-shPar3及對照 PC3-con細(xì)胞為例，但不限于此）。
[0057] 將貼壁培養(yǎng)的PC3細(xì)胞（約lxlO7個細(xì)胞）去除培養(yǎng)基后用PBS清洗2次。去 除PBS后將培養(yǎng)皿置于冰上加入5毫升RIPA裂解液（購于碧云天生物技術(shù)有限公司）裂 解10分鐘，將細(xì)胞裂解液收集于離心管中。每1毫升細(xì)胞裂解液中加入50微升protein Gagarose微球（購于Thermofisher公司），置于4°C水平搖床搖動1小時。充分混勾 后將混合液離心取上清分出1/10體積作為input，剩下的部分分別使用Par3的抗體（購 于millipore公司），aPKC的抗體（購于SantaCruz公司），MST1的抗體和Latsl的抗體 (兩者均購于CellSignalingTechnology公司）各1微克為誘t耳進(jìn)行coIP，對于獲得的 蛋白復(fù)合物，使用KIBRA的抗體（購于SantaCruz公司）檢驗。另一方面，以KIBRA的抗 體為誘餌進(jìn)行coIP，對于獲得的蛋白復(fù)合物，使用上述四種蛋白的抗體分別檢驗。結(jié)果發(fā) 現(xiàn)，Par3、aPKC與KIBRA可相互作用，KIBRA與MST1，Latsl同樣可以相互作用（附圖5a)。 暗示了Par3的表達(dá)和（或）定位的改變通過Par3-aPKC-KIBRA復(fù)合體將信號傳導(dǎo)至Hippo 通路上。將lxl06PC3-con、PC3_shPar3細(xì)胞進(jìn)行WesternBlot實驗，發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定敲降Par3 后上調(diào)了磷酸化aPKC的表達(dá)水平，同時下調(diào)了KIBRA的表達(dá)，暗示了在體外穩(wěn)定敲降Par3 可以破壞Par3-aPKC-KIBRA復(fù)合體的形成（附圖5b)。將lxl06PC3-con、PC3-shPar3細(xì)胞 使用Trizol常規(guī)方法分別提取總RNA并進(jìn)行常規(guī)的mRNA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后使用TOYOBO公司的SYBR-Green試劑進(jìn)行qRT-PCR實驗（引物序列見表1)。結(jié)果顯示穩(wěn)定敲降Par3后MST1/2 和Latsl的mRNA表達(dá)水平均顯著上升。使用核質(zhì)分離試劑盒（購于Thermofisher公司） 分別提取細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)蛋白進(jìn)行相應(yīng)蛋白的WesternBlot實驗。結(jié)果顯示，穩(wěn)定敲降 Par3后MST1/2和Latsl的總蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，同時磷酸化MST1/2和磷酸化Latsl 的表達(dá)水平也有所上調(diào)（附圖5c)。提示穩(wěn)定敲降Par3可以通過Par3-aPKC-KIBRA復(fù)合體 的介導(dǎo)有效激活Hippo通路。
[0058] 實施例6
[0059] 穩(wěn)定敲降Par3抑制了YAP的活性（以PC3細(xì)胞，PC3-shPar3及對照PC3-con細(xì) 胞為例，但不限于此）。
[0060] 將PC3-con和PC3-shPar3細(xì)胞使用Trizol常規(guī)方法分別提取RNA并進(jìn)行常規(guī)的 mRNA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后使用TOYOBO公司的SYBR-Green試劑進(jìn)行qRT-PCR實驗（引物序列見 表1)。結(jié)果顯示穩(wěn)定敲降Par3后YAP的mRNA表達(dá)水平下調(diào)（附圖6a)。使用核質(zhì)分離試 劑盒（購于Thermofisher公司）分別提取細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)蛋白進(jìn)行相應(yīng)蛋白的Western Blot實驗。結(jié)果顯示穩(wěn)定敲降Par3后細(xì)胞質(zhì)中磷酸化YAP蛋白水平顯著上調(diào)而細(xì)胞核中 非磷酸化的YAP蛋白水平則顯著下調(diào)（附圖6a)。IF實驗發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定敲降Par3后入核的 YAP表達(dá)量顯著下調(diào)，而細(xì)胞質(zhì)中的YAP(與Tublin共染）表達(dá)顯著上升（附圖6b)。這些 結(jié)果提示在前列腺癌細(xì)胞系中穩(wěn)定敲降Par3可以通過激活Hippo-YAP通路，導(dǎo)致下游原癌 基因YAP的磷酸化增強(qiáng)并將其滯留在細(xì)胞質(zhì)中，從而減少非磷酸化YAP蛋白的入核。
[0061] 實施例7
[0062] 穩(wěn)定敲降Par3抑制了轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄（以PC3_shPar3及對照PC3-con細(xì)胞 為例，但不限于此）。
[0063] 本發(fā)明中首先通過生物信息學(xué)方法使用PR0M0軟件(http： //algeen.lsi.upc. 軟件使用方法詳見網(wǎng)站說明）預(yù)測了TEAD轉(zhuǎn)錄因子在促侵潤/轉(zhuǎn)移基因MMP1、MMP9、 Zebl、Snaill及Twistl的啟動子區(qū)域中可能的結(jié)合位點（附圖7a)。使用常規(guī)ChIP(試劑 盒購于CellSignalingTechnology公司，實驗方法詳見試劑盒說明書，引物序列見表2) 實驗結(jié)合qRT-PCR及測序，證實了TEAD轉(zhuǎn)錄因子（此處以TEAD1為例）在相關(guān)基因啟動 子區(qū)域的富集（附圖7b)。通過WesternBlot實驗發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定敲降Par3后上述促轉(zhuǎn)移基因 的蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)（附圖7c)。該實驗結(jié)果提示了穩(wěn)定敲降Par3后減少了非磷酸 化YAP進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)。從而抑制了其與已知的TEAD轉(zhuǎn)錄因子家族（主要是TEAD1，TEAD2， TEAD4)互作，最終抑制了促侵潤/轉(zhuǎn)移基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。
[0064] 上述這些結(jié)果表明，在前列腺癌細(xì)胞系中穩(wěn)定敲降Par3后，通過破壞 Par3-aPKC-KIBRA三元復(fù)合物的形成，激活了Hippo通路并阻滯了原癌基因YAP蛋白的入 核，最終導(dǎo)致促侵潤/轉(zhuǎn)移基因的轉(zhuǎn)錄被削弱，在分子水平上實現(xiàn)了抑制前列腺癌細(xì)胞侵 潤及轉(zhuǎn)移的功能（附圖8)。
[0065] 表1 :qRT_PCR引物序列
[0066]

【主權(quán)項】
1. Par3作為藥物靶點在制備抑制前列腺癌轉(zhuǎn)移的藥物中的應(yīng)用。 2. Par3作為藥物靶點在制備抑制前列腺癌侵潤的藥物中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及靶向極性分子Par3抑制前列腺癌侵潤及轉(zhuǎn)移。本發(fā)明通過構(gòu)建穩(wěn)定敲降Par3的前列腺癌細(xì)胞亞克隆細(xì)胞系，并建立相應(yīng)的裸小鼠前列腺原位植瘤動物模型，在體外及體內(nèi)驗證了穩(wěn)定敲降Par3抑制前列腺癌侵潤及轉(zhuǎn)移的作用。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定敲降Par3后，通過破壞Par3-aPKC-KIBRA三元復(fù)合物的形成，增強(qiáng)了Hippo通路中重要成員MST1/2及Lats1的磷酸化，從而激活了Hippo通路并磷酸化其下游的原癌基因YAP，導(dǎo)致YAP蛋白的細(xì)胞質(zhì)滯留并減少非磷酸化YAP蛋白的入核，最終削弱了YAP在細(xì)胞核內(nèi)與TEAD轉(zhuǎn)錄因子的互作并抑制一系列促侵潤/轉(zhuǎn)移基因的轉(zhuǎn)錄。本發(fā)明在體內(nèi)體外、表型及分子機(jī)制上均驗證了穩(wěn)定敲降極性分子Par3具有抑制前列腺癌細(xì)胞侵潤及轉(zhuǎn)移的作用。
【IPC分類】A61P35/00, A61P35/04, A61K48/00
【公開號】CN105251019
【申請?zhí)枴緾N201510573909
【發(fā)明人】高維強(qiáng), 方煜翔, 周培杰
【申請人】上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院
【公開日】2016年1月20日
【申請日】2015年9月10日