上清以不同百分比添加到接種了陰道加德菌2%的新鮮MRS中。加德菌 在新鮮MRS中單獨(dú)生長（陽性對(duì)照）以及含有0. 5%至4%的量的中和上清的情況下生長 24小時(shí)和48小時(shí)。只顯示了與菌株發(fā)酵乳桿菌LF15(24小時(shí)的表1，和48小時(shí)的表2)相 關(guān)的結(jié)果，這是因?yàn)閷?duì)于菌株發(fā)酵乳桿菌LF16也獲得了相似結(jié)果。
[0053]表1
[0054]
[0057] 表1和表2中列出的所有菌株由申請人進(jìn)行了保藏，并根據(jù)布達(dá)佩斯條約規(guī)定的 要求可被公眾獲得。如同預(yù)期，陰道加徳菌單獨(dú)在新鮮MRS培養(yǎng)基中的生長直接與該菌能 夠獲得的培養(yǎng)基本身的百分比成比例。當(dāng)提高中和的上清的百分比（即，達(dá)到中性pH以消 除乳酸桿菌產(chǎn)生的有機(jī)酸介導(dǎo)的非特異性抑制效果）時(shí)，主要在能夠介導(dǎo)完全特異性抑制 作用的發(fā)酵乳桿菌LF15的情況下，所得陰道加徳菌的生長降低。另一方面，通過副干酪乳 桿菌LPC08和副干酪乳桿菌ID1608得到的陰道加徳菌的生長值基本與在新鮮MRS中相 似，表明這兩種乳酸桿菌不發(fā)揮抑制作用。其余5株介導(dǎo)了拮抗作用，主要是卷曲乳桿菌 ID1605和發(fā)酵乳桿菌ID1459,不過拮抗程度小于發(fā)酵乳桿菌LF15。對(duì)于菌株發(fā)酵乳桿菌 LF16也是如此。
[0058] 除了以上特異性抑制機(jī)制，兩種乳酸桿菌都由于其兼異型發(fā)酵機(jī)制能夠產(chǎn)生大量 乳酸，有助于快速大幅降低陰道內(nèi)pH。
[0059] 此外，兩種纖維例如阿拉伯半乳聚糖和短鏈低聚果糖（F0S)的存在為"陰道乳酸 桿菌復(fù)合體"的微生物和本制劑中存在的乳酸桿菌提供了選擇性營養(yǎng)，從而促進(jìn)了陰道生 態(tài)系統(tǒng)中定殖的能力和后續(xù)的發(fā)展。
[0060] 源自將這些特定碳源發(fā)酵的能力的競爭優(yōu)勢使得發(fā)酵乳桿菌LF15、植物乳桿菌 LP01、發(fā)酵乳桿菌LF16和植物乳桿菌LP02以及其他原有乳酸桿菌群快速增加，并隨后合成 了大量具有抗微生物活性的肽、和能夠?qū)㈥幍纏H降低至與大多數(shù)治病物種不相容的值的 有機(jī)酸。
[0061] 有利的是，陰道局部使用的本發(fā)明的組合物僅包含：
[0062]-高菌群，用于對(duì)整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)進(jìn)行快速定殖，
[0063]-處于良好生理狀態(tài)的菌株，用于快速擴(kuò)增，
[0064]-在最終產(chǎn)品儲(chǔ)存條件下的適當(dāng)穩(wěn)定性，從而確保保存期結(jié)束之前的有效性。
[0065] 本發(fā)明的組合物可有效應(yīng)用于治療復(fù)發(fā)或反復(fù)的陰道病。
[0066] 具有免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子
[0067] 該研究評(píng)價(jià)了對(duì)代表具有免疫調(diào)節(jié)作用的主要細(xì)胞因子的細(xì)胞因子IL-4和 IL-10的誘導(dǎo)。如圖A所示，所測試的菌株植物乳桿菌LMGP-21021-LP01和植物乳桿菌LMG P-21020-LP02與基礎(chǔ)情況相比能夠誘導(dǎo)兩種細(xì)胞因子的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的生成。
[0068] 圖A.細(xì)胞因子圖。10次獨(dú)立試驗(yàn)的平均值土S.E.M.。利用學(xué)生t檢驗(yàn)計(jì)算統(tǒng)計(jì) 學(xué)意義。當(dāng)相對(duì)于基礎(chǔ)情況（未刺激的PBMC)進(jìn)行計(jì)算時(shí)，值p〈0. 05被視為在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯 著。在刺激后1天后在培養(yǎng)物上清中評(píng)價(jià)IL-10的產(chǎn)生。在刺激后5天后在培養(yǎng)物上清中 評(píng)價(jià)IL-4的產(chǎn)生。以植物乳桿菌菌株LMGP-21020-LP02獲得了相似結(jié)果。
[0069] 圖1涉及植物乳桿菌菌株LMGP-21021-LP01對(duì)大腸桿菌（ATCC8739、ATCC 10536、ATCC35218、ATCC25922)抑制的定量。
[0070] 圖B涉及植物乳桿菌菌株LMGP-21020-LP02對(duì)大腸桿菌（ATCC8739、ATCC 10536、ATCC35218、ATCC25922)抑制的定量。
[0071] 本發(fā)明的一個(gè)目的是一種組合物，所述組合物包含以下物質(zhì)或由其組成：
[0072] -細(xì)菌菌株植物乳桿菌LMGP-21021 (LP01)，和/或
[0073] -細(xì)菌菌株發(fā)酵乳桿菌DSM26955 (LF15)，和
[0074]-塔拉膠，和
[0075]-阿拉伯半乳聚糖纖維，和
[0076]-低聚果糖纖維，
[0077] 所述組合物用于預(yù)防和/或治愈細(xì)菌性陰道病、陰道炎和與大腸菌群病原體和/ 或加德菌相關(guān)的陰道感染；并用于對(duì)抗復(fù)發(fā)或反復(fù)陰道病。
[0078] 菌株植物乳桿菌LMGP-21021(LP01)和菌株發(fā)酵乳桿菌DSM26955(LF15)各自的 存在濃度為1\1〇7至1\1〇1°、優(yōu)選1\1〇 8至1\1〇1?1]/^(在任何情況下不少于400\106 活細(xì)胞/株/片或珠）。組合物中這兩株乳酸桿菌的重量比為1:3至3:1、優(yōu)選1:2至2:1， 例如1:1。
[0079] 塔拉膠相對(duì)于所述組合物重量的量為1重量％至10重量％，優(yōu)選3重量％至8重 量％，例如5重量％。
[0080] 阿拉伯半乳聚糖纖維相對(duì)于所述組合物重量的量為10重量％至45重量％，優(yōu)選 25重量％至40重量％，例如35重量％。
[0081] 低聚果糖纖維相對(duì)于所述組合物重量的量為10重量％至40重量％，優(yōu)選15重 量％至35重量％，例如25重量％。
[0082] 阿拉伯半乳聚糖纖維和低聚果糖纖維的重量比為1:2至2:1，優(yōu)選1:1. 5至 1. 5:1〇
[0083] 例如，1克組合物可含有濃度各自為4X106CFU/g的所述兩株乳酸桿菌（重 370mg)、50mg塔拉膠、阿拉伯半乳聚糖340mg和低聚果糖240mg;所述組合物可以為緩釋陰 道片的形式（組合物）。
[0084] 申請人在體外測試了這兩株乳酸桿菌，并在體內(nèi)測試了組合物（研究）。
[0085] i)體外測試所述乳酸桿菌菌株對(duì)在含有2 % (w/w)明膠、0. 5 %酵母提取物、0. 1 % 淀粉和〇. 1 %葡萄糖的BHI(腦心浸液肉湯）中生長的陰道加徳菌ATCC10231的抗擊。各 菌株在MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)。所有皿在無氧條件下在37°C溫育48小時(shí)（GasPak系統(tǒng)）。
[0086] 各菌株的中和上清以不同百分比添加到新鮮BHI中，并接種陰道加徳菌ATCC 10231。通過微量需氧生長條件下37°C溫育24小時(shí)和48小時(shí)后在600nm波長的光密度 (〇D_)，定量了單獨(dú)的陰道加徳菌株和添加了 0.5%至4%不同濃度中和上清的陰道加徳菌 的生長。
[0087] ii)在分為24名受試者的A組和11名受試者的B組（安慰劑）的35名患者中體 內(nèi)測試了所述組合物。安慰劑由僅含微晶纖維素和無水磷酸氫鈣（無活性成分）的等重量 陰道片構(gòu)成。在連續(xù)7晚臨睡前，對(duì)A組和B組（安慰劑）的受試者每天一次施用所述組 合物和安慰劑的陰道片。然后，在3周中每3天一片。對(duì)于兩組，完整的治療均持續(xù)4周。
[0088] 進(jìn)行該研究首先是為評(píng)價(jià)所選乳酸桿菌拮抗體外陰道加德菌的能力，并進(jìn)而與能 夠抑制大腸桿菌的菌株結(jié)合，從而即使在需氧陰道炎（AV)中也展示出可能的潛在用途。該 研究的第二步是通過使用最有前景的活性菌的組合對(duì)患有BV的女性進(jìn)行人體先導(dǎo)測試。
[0089] 方法：對(duì)于該目的，評(píng)價(jià)了百分比為0. 5%至4%的各乳酸桿菌的中和上清阻礙陰 道加徳菌ATCC10231生長的能力。
[0090] 然后，將發(fā)揮最大抑制的菌通過人干預(yù)在以安慰劑為對(duì)照的先導(dǎo)測試中，與植物 乳桿菌LP01 -同進(jìn)行測試，該測試涉及34名診斷患有BV的女性受試者（年齡為18至50 歲、平均為34. 7 ±8. 9歲的未停經(jīng)女性）。兩種微生物發(fā)酵乳桿菌LF15(DSM26955)和植物 乳桿菌LP01(LMGP-21021)通過緩釋陰道片施用在陰道中，該緩釋陰道片還包含50mg塔拉 膠。各菌株的量為4億活細(xì)胞/劑。指示這些女性連續(xù)7晚每天一次施用陰道片，然后每3 晚一片，另外應(yīng)用3周（急性階段），并最終每周1片以維持長期陰道定殖以防止可能的復(fù) 發(fā)。在開始（d0)、28天后（d28)和用于預(yù)防復(fù)發(fā)的第二個(gè)月結(jié)束時(shí)（d56)，進(jìn)行臨床檢查， 并對(duì)每名患者定量紐金特得分（Nugentscore)。進(jìn)行d28或d56和d0之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較、 以及d56和d28之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較，從而將對(duì)抗可能復(fù)發(fā)的效果進(jìn)行定量。
[0091] 結(jié)果：24小時(shí)和48小時(shí)后發(fā)酵乳桿菌LF15顯示出體外對(duì)抗陰道加徳菌ATCC 10231的最大抑制活性。
[0092] 在人體測試中，所需的兩株乳酸桿菌，即發(fā)酵乳桿菌LF15和植物乳桿菌LP01在采 用活性劑的組中將24名患者中的22名（91. 7%，p〈0. 001)的紐金特得分顯著降低到低于 閾值7。8名女性（33. 3% )記錄到4至6的紐金特得分，這是中間狀態(tài)的證據(jù)，而其余14 名（58. 3% )顯示出小于4的評(píng)價(jià)值，因此表明生理學(xué)陰道微生物的恢復(fù)。在第二個(gè)月結(jié)束 時(shí)，僅有4名女性記錄到大