知母中添加2L 80%的甲醇溶液，在水浴條件下提取2小時后過濾。并且，在 剩余的殘渣中添加 IL相同的溶劑，并在相同條件下再提取后過濾。在減壓條件下對濾出的 提取液進行濃縮、冷凍干燥得到了 189g的知母提取物。
[0058] 制備例2 :從知母提取物制備丁醇可溶性分離物
[0059] 將通過制備例1中得到的189g知母提取物懸浮在I. 5L的水中后，向其中添加 1. 5L正丁醇，振蕩放置后正丁醇可溶性分離物層和水溶性分離物層相分離。取正丁醇可溶 性分離物層后在減壓條件下進行濃縮、凍結(jié)干燥得到了 41g正丁醇可溶性分離物。正丁醇 可溶性分離物的產(chǎn)率以知母為基準時為8. 2%以上，正丁醇可溶性分離物所含有的芒果苷 (Mangiferin)的含量為10%以上。
[0060] 制備例3 :從知母提取物的丁醇可溶性分離物中分離化合物
[0061] 對通過制備例2得到的IOg正丁醇可溶性分離物，用洗脫溶劑（氯仿：甲醇：水 = 65:35:10)實施硅膠柱色譜法（默克（Merck)，10 cm X 30 cm，70~230目）并得到了 9個初分離物。對于9個初分離物中的、在大腸炎動物模型實驗中效果最優(yōu)異的初分離 物Fr. W，用25%的甲醇作為洗脫溶劑實施了中壓液相色譜（Medium pressure liquid 〇111'〇1]1&1:〇8抑口117，]\03]^;(]18反向默克（(]18代￥6186]\161^10,3〇11\20〇11)并得到了2個分 離物。將2個分離物濃縮后分別用甲醇再結(jié)晶得到了 2個白色粉末形態(tài)的化合物，通過質(zhì) 量分析和13C-NMR(布魯克，AVANCE digital 400)確認其結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)是芒果苷和新芒果 苷。圖1為示出了芒果苷和新芒果苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)式的圖。芒果苷和新芒果苷的產(chǎn)率以知母 為基準時分別為0. 5%以上和0.1 %以上。
[0062] 〈芒果苷〉
[0063] ESI(-)-MS/MS 421，301[M-Na]
[0064] 13C NMR(lOOMHz)峰值：162. 254 (01)，108. 04 (02)，164. 295 (03)， 93. 813 (C-4)，103. 088(C-5)，154. 606(C-6)，144. 228(C-7)，108. 489(C-8)，179. 551 (C-9)， 156. 697(C-4a)，151. 286(C-4b)，112. 128(C-8a)，101. 772(C-8b)，82. 025(2-glc C-Γ )， 73.564(02'），71. 103 (C-3,），70. 724 (C-4,），79. 449 (C-5,），61. 961 (C-6,）。
[0065] 〈新芒果苷〉
[0066] ESI (-) -MS/MS 421，301 [M-Na]
[0067] 13C 匪R(IOOMHz)峰值：162. 5 (C-I)，108. 3 (C-2)，164. 5 (C-3)，94. 0 (C-4)， 103. 3 (C-5)，156. 9 (C-6)，144. 4 (C-7)，112. 4 (C-8)，179. 8 (C-9)，154. 7 (C-4a)， 151. 5 (C-4b)，108. 8 (C-8a)，102. 0 (C-8b)，73. 8 (2-glc C-Γ )，71. 3 (C-2'）， 79. 7(C-3,），71. 0(C-4,），82. 2(C-5,），61. 4(C-6,），103. 4(7-glc C-l"），73. 5(C-2"）， 76. I (C-3，，），69. 6 (C-4，，），77. 3 (C-5，，），60. 7 (C-6，，）。
[0068] 2.五倍子提取物、其分離物及從中分離出的化合物的制備
[0069] 制備例4 :五倍子提取物的制備
[0070] 500g五倍子中添加2L 80%的甲醇溶液，在水浴條件下提取2個小時后過濾。并 且，在剩余的殘渣中添加 IL相同的溶劑，并在相同條件下再提取后過濾。在減壓條件下對 濾出的提取液進行濃縮、冷凍干燥得到了 190g的五倍子提取物。
[0071] 制備例5 :從五倍子提取物制備丁醇可溶性分離物
[0072] 將通過制備例4得到的190g五倍子提取物懸浮在I. 5L的水中后，向其中添加 I. 5L正丁醇，振蕩放置后正丁醇可溶性分離物層和水溶性分離物層相分離。取正丁醇可 溶性分離物層后在減壓條件下濃縮、凍結(jié)干燥得到了 l〇2g正丁醇可溶性分離物。正丁 醇可溶性分離物的產(chǎn)率以五倍子為基準時為21 %以上，正丁醇可溶性分離物所含有的 1，2,3,4,6-五沒食子酰葡萄糖&111(：〇86 1，2,3,4,6-卩611七&-〇-區(qū)&11〇71-0-〇-區(qū)111(3〇86)的 含量為30%以上。
[0073] 3.輪葉黨參提取物、其分離物及從中分離出的化合物的制備
[0074] 制備例6 :輪葉黨參提取物的制備
[0075] 2kg干燥的輪葉黨參（Codonopsis lanceolata Trautv)根部（韓國首爾京東市 場）中添加4L 80%的甲醇溶液，在水浴條件下提取2個小時后過濾。并且，在剩余的殘渣 中添加2L相同的溶劑，并在相同條件下再提取后過濾。在減壓條件下對濾出的提取液進行 濃縮、冷凍干燥得到了 185g的輪葉黨參提取物。
[0076] 制備例7 :從輪葉黨參提取物制備丁醇可溶性分離物
[0077] 將通過制備例6得到的185g輪葉黨參提取物懸浮在I. 5L的水中后，向其中添加 I. 5L正丁醇，振蕩放置后正丁醇可溶性分離物層和水溶性分離物層相分離。取正丁醇可溶 性分離物層后在減壓條件下濃縮、凍結(jié)干燥得到了 112g正丁醇可溶性分離物。正丁醇可溶 性分離物的產(chǎn)率以輪葉黨參為基準時為5. 5%以上，正丁醇可溶性分離物所含有的黨參皂 苷A (Lancemaside A)的含量為4%以上。
[0078] 4.川黃連提取物及其分離物的制備
[0079] 制備例8 :川黃連提取物的制備
[0080] 500g干燥的川黃連（Coptis chinensis)根部（韓國首爾京東市場）中添加2L 80%的甲醇溶液，水浴條件下提取2個小時后過濾。并且，在剩余的殘渣中添加 IL相同的 溶劑，并在相同條件下再提取后過濾。在減壓條件下對濾出的提取液進行濃縮、冷凍干燥得 到了 123g的川黃連提取物。
[0081] 制備例9 :從川黃連提取物制備丁醇可溶性分離物
[0082] 將通過制備例8得到的123g川黃連提取物懸浮在1.5L的水中后，向其中添加 I. 5L正丁醇，振蕩放置后正丁醇可溶性分離物層和水溶性分離物層相分離。取正丁醇可 溶性分離物層后在減壓條件下濃縮、凍結(jié)干燥得到了 63g正丁醇可溶性分離物。正丁醇 可溶性分離物的產(chǎn)率以川黃連為基準時為12. 5%以上，利用高效液相色譜（HLPC ;沃特 斯（Waters)Alliance 2695型號）分析了正丁醇可溶性分離物的成分。色譜柱使用YCM Hydrosphere Cls(S-5ym，120nm，4.6X250mm I.D)，樣品溫度為 25°C ±1，且維持柱溫為 30°C±1。樣品濃度制備成lmg/mL并注入10yL，流速以1.0mL/min進行分析。并且從西 格瑪（Sigma)公司購買黃連堿、黃藤素、黃連堿等常用物質(zhì)作為標(biāo)準物質(zhì)，而非洲防已堿和 藥根堿則從黃連分離、精制后使用。流動相用〇. 2%磷酸溶液（溶劑A)和甲醇（溶劑B) 的梯度（gradient)條件，以0分鐘~60分鐘（A:B = 9:1~6:4)、60分鐘~70分鐘（A:B =6:4~5:5)、70分鐘~90分鐘（A:B = 5:5~0:10)進行分析。對于活性成分的含量計 算，將相對于各標(biāo)準物質(zhì)的面積比用重量百分比表示。分析結(jié)果，川黃連提取物的正丁醇 可溶性分離物含有黃連素27~30%、黃藤素7~8%、黃連堿5~6%、非洲防已堿0. 8~ 1. 2%、藥根堿0. 8~1. 2%左右。
[0083] 5.制備復(fù)合提取物
[0084] 制備例10
[0085] 將50重量份的通過制備例2得到的知母提取物的丁醇可溶性分離物和50重量份 的通過制備例5得到的五倍子提取物的丁醇可溶性分離物混合制備了復(fù)合提取物。
[0086] 制備例11
[0087] 將50重量份的通過制備例2得到的知母提取物的丁醇可溶性分離物和50重量份 的通過制備例7得到的輪葉黨參提取物的丁醇可溶性分離物混合制備了復(fù)合提取物。
[0088] 制備例12
[0089] 將50重量份的通過制備例2得到的知母提取物的丁醇可溶性分離物、50重量份的 通過制備例5得到的五倍子提取物的丁醇可溶性分離物以及50重量份的通過制備例7得 到的輪葉黨參提取物的丁醇可溶性分離物混合制備了復(fù)合提取物。
[0090] 制備例13
[0091 ] 將50重量份的通過制備例2得到的知母提取物的丁醇可溶性分離物和50重量份 的通過制備例9得到的川黃連提取物的丁醇可溶性分離物混合制備了復(fù)合提取物。
[0092] 6.通過TNBS誘導(dǎo)急性大腸炎的模型動物實驗測定大腸炎治療效果
[0093] (1)實驗動物的準備
[0094] 從東方生物株式會社（Orientbio Inc.)購買了 6周齡的雄性小鼠（C57BL/6， 18-22g)。所有小鼠均在濕度50± 10%、溫度20~22°C的調(diào)節(jié)好的環(huán)境條件下飼養(yǎng)，照明打 開12小時后關(guān)閉12小時，如此反復(fù)。飼料使用標(biāo)準實驗用飼料（三養(yǎng)（Samyang)，韓國）， 且飲用水采取自由攝取的方式。所有實驗中每組是6只小鼠。
[0095] (2)由TNBS引發(fā)急性大腸炎及樣品給藥
[0096] 實驗動物中，一組作為正常組，對剩余組的實驗動物用2, 4, 6-三硝基苯磺酸 (2, 4, 6-trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS)引發(fā)急性大腸炎。具體地，用醚輕微地 麻醉實驗動物后，用末端圓潤的ImL容量的注射器將2. 5g TNBS (2, 4, 6-Trinitrobenzene sulfonic acid)溶液混合到50%乙醇中的溶液通過肛門向大腸內(nèi)注射0. lmL，垂直拿起并 維持30秒來引發(fā)炎癥。另一方面，正常組中口服給藥0.1 mL生理鹽水。之后，第二天開始將 藥物樣品溶在生理鹽水并按預(yù)設(shè)容量口服給藥，共服用3天，每天一次。樣品給藥結(jié)束后的 第二天用二氧化碳使實驗動物室息死亡，并取大腸部位中的闌尾至肛門前部位的大腸。此 時，使用知母提取物的丁醇分離物、芒果苷以及復(fù)合提取物作為藥物樣品的實驗，分別以一 定的時間間隔進行了不同的實驗。且在各實驗中，以用生理鹽水代替其他藥物樣品來供應(yīng) 給未用TNBS處理的實驗動物的正常組為基準分析藥物樣品的大腸炎預(yù)防或治療效果較為 合理的。
[0097] (3)模型動物的體重變化、大腸的外觀以及髓過氧化物酶（Myeloperoxidase， ΜΡ0)活性的測定
[0098] 1)體重變化量分析
[0099] 停止TNBS引發(fā)大腸炎的模型動物的樣品給藥，第二天測定實驗動物的體重后，通 過與最初體重進行比較來計算體重變化量。
[0100] 2)外觀分析
[0101] 觀察取的大腸的長度和外觀，按照下述表1的基準（Hollenbach等，2005對大腸炎 程度的基準）進行評分。這時，將使用美沙拉嗪（Mesalazine ;Sigma)的給藥組作為陽性對 照組。另外，為了分析腸內(nèi)微生物，取部分大腸內(nèi)容物在零下80°C條件下冷凍保管。將大 腸組織的大腸內(nèi)容物全部去除，用生理鹽水洗滌后，對部分大腸組織利用4%甲醛固定液固 定，從而作為病理組織用樣品，而剩余部分用作分子生物學(xué)分析，并在零下80°C條件下冷凍 保管。
[0104] 3)髓過氧化物酶（Myeloperoxidase，ΜΡ0)活性的測定
[0105] 在IOOmg大腸組織中加入20 μ L裂解液（lysis buffer)并進行均質(zhì)化 (homogenization)。之后在4°C和13000rpm條件下離心分離15分鐘得到上清液，接著使 用小鼠 MPO檢測ELISA試劑盒（美國Hbt HK210)測定MPO活性。將100 μ L上清液放入 96孔板（96well plate)后在室溫下反應(yīng)1小時。反應(yīng)結(jié)束后，將板（plate)倒過來清空， 接著使用200 μ L清洗緩沖液反復(fù)清洗3次，之后添加100以1^稀釋好的示蹤劑（廿&〇6〇并 在室溫下反應(yīng)1小時。反應(yīng)結(jié)束后，將板倒過來清空后，用200 μ L清洗緩沖液清洗各個孔 (well)。使用200 μ L清洗緩沖液反復(fù)清洗3次后，添加100 μ L稀釋好的鏈霉親合素-過 氧化物酶結(jié)合物（streptavidin-peroxidase conjugate)并在室溫下反應(yīng)1小時。反應(yīng)結(jié) 束后，將板倒過來清空后，用200 μ L清洗緩沖液清洗各個孔（-11)。使用200以1^清洗緩沖 液反復(fù)清洗3次后，添加 IOOyL TMB底物溶液（ΤΜΒ substrate solution)，并為了擋光而 用鋁箱裹住板，在室溫下反應(yīng)30分鐘。之后添加100 μ L靜置溶液來停止反應(yīng)，利用ELISA 酶標(biāo)儀（ELISA reader)測定450nm下的吸光度。
[0106] 4)體重變化量、大腸外觀、大腸長度及MPO活性測定結(jié)果
[0107] 圖2為示出了使用制備例2中得到的知母提取物的正丁醇可溶性分離物作為藥物 樣品時，由TNBS引發(fā)急性大腸炎的模型動物的體重變化和大腸外觀評分的圖，圖3為示出 了使用制備例2中得到的知母提取物的正丁醇可溶性分離物作為藥物樣品時，由TNBS引發(fā) 急性大腸炎的模型動物的大腸長度和MPO活性測定結(jié)果的圖。圖2和圖3中，"N"或"N0R" 表示正常組，"TNBS"意味著用生理鹽水代替其他藥物樣品供應(yīng)給由TNBS引發(fā)急性大腸炎 的模型動物的組，"A"或"AJ"意味著知母提取物的正丁醇可溶性分離物。另外，"A10"和 "A20"意味著藥物樣品"A"的一次給藥量分別為10mg/kg(鼠）和20mg/kg(鼠）。另外， 圖2和圖3中，"M"意味著作為陽性對照藥物使用的美沙拉嗪（mesalazine)。如圖2和圖 3所示，知母提取物的正丁醇可溶性分離物顯示出了緩解或改善TNBS誘導(dǎo)的急性大腸炎的 效果，且該效果呈濃度依賴性。
[0108] 圖4為示出了使用制備例3得到的芒果苷作為藥物樣品時，由TNBS引發(fā)急性大腸 炎的模型動物的體重變化和大腸外觀評分、大腸長度和MPO活性測定結(jié)果的圖。圖4中， "N0R"表示正常組，"MF"意味著芒果苷（Mangiferin)。另外，"MF10"和"MF20"意味著藥物 樣品"MF"的一次給藥量分別為10mg/kg(鼠）和20mg/kg(鼠）。另外，圖4中，"MS"意味 著作為陽性對照藥物而使用的美沙拉嗪。如圖4所示，芒果苷顯示出了緩解或改善TNBS誘 導(dǎo)的急性大腸炎的效果，且該效果呈濃度依賴性。
[0109] 圖5為示出了使用復(fù)合提取物作為藥用樣本時，由TNBS引發(fā)急性大腸炎的模型 動物的體重變化和大腸的外觀評分的圖，圖6為示出了使用復(fù)合提取物作為藥用樣本時， 由TNBS引發(fā)急性大腸炎的模型動物的大腸長度和MPO活性測定結(jié)果的圖。圖5和圖6中， "N0R"表示正常組，"AC"意味著制備例13中制備的復(fù)合提取物，"ALG"意味著制備例12中 制備的復(fù)合提取物。另外，"AC10"和"AC20"意味著藥物樣品"AC"的一次給藥量分別為 10mg/kg(鼠）和20mg/kg(鼠）。另外，圖5和圖6中，"M"意味著作為陽性對照藥物而使 用的美沙拉嗪（mesalazine)。如圖5和圖6所示，由知母提取物的分離物和川黃連提取物 的分離物形成的復(fù)合提取物和由知母提取物的分離物、五倍子提取物的分離物以及輪葉黨 參提取物的分離物形成的復(fù)合提取物顯示出了與作為陽性對照藥物使用的美沙拉嗪相似 水平的抑制急性大腸炎的效果，尤其是，由知母提取物的分離物和川黃連提取物的分離物 形成的復(fù)合提取物的效果與由知母提取物的分離物、五倍子提取物的分離物以及輪葉黨參 提取物的分離物形成的復(fù)合提取物相比更加優(yōu)秀。
[0110] (4)分析對炎性反應(yīng)指標(biāo)物質(zhì)的表達的影響
[0111] 1)對促炎細胞因子（proinflammatory cytokine)和抗炎細胞因子 (anti-inflammatory cytokine)白勺^:達白勺影口向
[0112] IOOmg模型動物的大腸組織中添加250 μ L的含蛋白酶抑制劑混合物（protease inhibitor cocktail)的RIPA緩沖液（RIPA buffer)并進行均質(zhì)化。之后在4°C和 13000rpm 條件下離心分離15分鐘得到上清液，并在零下80°C條件下保管，利用96孔ELISA酶標(biāo)板 (96-well ELISA plate kits)(美國伊利諾伊州羅克福德市皮爾斯生物技術(shù)公司）測定了 與促炎細胞因子相關(guān)的IL-I β、IL-6和TCF-α的表達量和與抗炎細胞因子相關(guān)的IL-10 的表達量。
[0113] 圖7為示出了使用制備例2得到的知母提取物的正丁醇可溶性分