與細(xì)胞對照組OD值相比計算細(xì)胞存活率，用Reed-Muench方法計算藥物半數(shù)細(xì)胞中 毒濃度燈DJ。
[0056] (4)抑毒試驗：
[0057] 參照文獻(xiàn)（汪受傳，王霖，陳超等，清肺口服液含藥血清對呼吸道合胞病毒抑制 作用的實驗研究，南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2008 ;24(1) :25~27)的方法，將樣品按稀釋順序 (2 ")橫向接種于96板孔中的單層細(xì)胞上，每孔IOOuL每稀釋度縱向重復(fù)4孔，微孔板 的A、B、C行加含100個TCIDw的病毒IOOuL作為試驗組，D行補(bǔ)充等容量細(xì)胞維持液為不 同濃度藥物對照，平行設(shè)F行作為病毒對照，E行的1~12作為細(xì)胞對照。37°C、5%C〇2培 養(yǎng)，每日觀察CPE，連續(xù)觀察4d。病毒對照出現(xiàn)90%W上C陽時，加1%中性紅染色，用酶標(biāo) 儀在波長540皿波長讀取A值，各組A值去除病毒對照組A值，將各試驗組與細(xì)胞對照組A 值相比，獲得細(xì)胞存活率，用Reed-Muench方法計算半數(shù)抑毒濃度（ICJ，最終將TDw和IC5。 相比獲得抑毒指數(shù)（TI)。 陽05引 妨結(jié)果：
[0059] ①樣品TDw的測定：對照組細(xì)胞顯微鏡下觀察貼壁生長致密、形態(tài)良好。組合物 31091302050629、化合物III和化合物IV對肥K293的TDsd分別為2 2'3s、2 2'16、2 2'59。
[0060] ②抑毒實驗：對照組細(xì)胞貼壁致密、形態(tài)良好。鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，RSV病毒對照組在 第2d出現(xiàn)90%W上的CPE，RSV在肥K293CPEW折光性增強(qiáng)、變圓、脫落、破碎為主要特征。
[0061] 而組合物31091302050629抑毒試驗各組細(xì)胞，按照樣品稀釋梯度，梯度規(guī)律出現(xiàn) C陽：
[0062] RSV-HEK293試驗組細(xì)胞在第9稀釋度之前，細(xì)胞完全被保護(hù)，之后出現(xiàn)CPE，C陽隨 樣品濃度減少逐漸加重。
[0063] 而化合物HI和化合物IV處理組在2 6濃度范圍內(nèi)才觀察到抑制病毒的效應(yīng)。
[0064] 將上述實驗板用1 %中性紅染色、用酶標(biāo)儀測450nmA值，各組A值減掉病毒對照 組A值后，各實驗組A值與細(xì)胞對照組A值相比獲得ICw,ICw與TDW相比獲得TI:組合物 31091302050629 抑制RSV在肥K293 細(xì)胞發(fā)生CPE，ICs。為 2 12'°6,TI為 820. 3 ;化合物III 的ICw為 2 4'44,TI為 4. 9 ;化合物IV的ICw為 2 "9,TI為 4. 6 ;。 陽0化]結(jié)論：組合物31091302050629具有顯著的抗副粘科病毒呼吸道合胞病毒RSV的 作用，可W用來制備抗副粘科病毒呼吸道合胞病毒RSV藥物?；衔颕II和化合物IV無顯 著的抗副粘科病毒呼吸道合胞病毒RSV的作用，不可W用來制備抗副粘科病毒呼吸道合胞 病毒RSV藥物。
[0066] (S)實驗例：組合物對甲型流感病毒的作用研究：
[0067] (1)細(xì)胞株與病毒株：狗腎細(xì)胞（MDCK，流感病毒敏感細(xì)胞）引自中國CDC病毒病 研究所；流感病毒甲型（FluA) 1995.AII:32094地方株引自中國CDC病毒病研究所。 W側(cè) 似細(xì)胞毒性測定： W例參照文獻(xiàn)（汪受傳，王霖，陳超等，清肺口服液含藥血清對病毒抑制作用的實驗研 究，南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2008 ;24(1) :25~27)的方法，將各樣品W2倍比做系列稀釋 (2 1 一 5)，然后按稀釋順序橫向接種于96板孔中的MDCK上，每孔100祉，每稀釋度縱向重復(fù) 3孔（A、B、C行），平行設(shè)微孔板D的1~6孔為細(xì)胞對照，7~12孔不接種細(xì)胞為空白對 照，顯微鏡下每日觀察CPE，連續(xù)觀察7山中性紅染色，在540nm波長測定OD值，將實驗組 與細(xì)胞對照組OD值相比計算細(xì)胞存活率，用Reed-Muench方法計算藥物半數(shù)細(xì)胞中毒濃度 (TDso)O
[0070] 做抑毒試驗：
[0071] 參照文獻(xiàn)（汪受傳，王霖，陳超等，清肺口服液含藥血清對病毒抑制作用的實驗研 究，南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2008 ;24(1) :25~27)的方法，將樣品按稀釋順序橫向接種于96 板孔中的單層細(xì)胞上，每孔IOOuL每稀釋度縱向重復(fù)4孔，微孔板的A、B、C行加含100個 TCIDw的病毒IOOuL作為試驗組，D行補(bǔ)充等容量細(xì)胞維持液為不同濃度藥物對照，平行設(shè) F行作為病毒對照，E行的1~12作為細(xì)胞對照。37°C、5%C〇2培養(yǎng)，每日觀察CPE，連續(xù)觀 察4d。病毒對照出現(xiàn)90%W上C陽時，加1 %中性紅染色，用酶標(biāo)儀在波長540nm波長讀取 A值，各組A值去除病毒對照組A值，將各試驗組與細(xì)胞對照組A值相比，獲得細(xì)胞存活率， 用Reed-Muench方法計算半數(shù)抑毒濃度（ICJ，最終將TDw和IC5。相比獲得抑毒指數(shù)燈I)。 陽072] (4)結(jié)果：
[0073] ①樣品TDs。的測定：對照組細(xì)胞顯微鏡下觀察貼壁生長致密、形態(tài)良好。組合物 31091302050629、化合物III和化合物IV對的TDsd在MDCK分別為2 1'"、22'°3、22'18。
[0074] ②抑毒實驗：對照組細(xì)胞貼壁致密、形態(tài)良好。鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)luA在MDCKCPE W折光性增強(qiáng)、壞死、破碎為主要特征。 陽0巧]而組合物31091302050629抑毒試驗各組細(xì)胞，按照樣品稀釋梯度，梯度規(guī)律出現(xiàn)CPE=FIuA-MDCK組細(xì)胞在第8稀釋度之前細(xì)胞完全被保護(hù)，之后出現(xiàn)CPE，CPE隨樣品濃度 減少逐漸加重。
[0076] 而化合物HI和化合物IV處理組在2 6濃度范圍內(nèi)才觀察到抑制病毒的效應(yīng)。
[0077] 將上述實驗板用1 %中性紅染色、用酶標(biāo)儀測450nm的A值，各組A值減掉病毒對 照組A值后，各實驗組A值與細(xì)胞對照組A值相比獲得ICw,ICw與TDW相比獲得TI:組合 物 31091302050629 抑制FluA在MDCK細(xì)胞發(fā)生CPE，ICs。為 2 12'?，TI為 3236. 0 ;化合物 III的IC加為2 5'11，TI為8. 5 ;化合物IV的IC加為2 5'°4,TI為7. 3。
[0078] 結(jié)論：組合物31091302050629對甲型流感病毒具有很強(qiáng)的抑制作用，而且安全， 因此組合物31091302050629在治療甲型流感病毒感染疾病中具有廣泛的應(yīng)用背景。化合 物HI和化合物IV對甲型流感病毒沒有顯著的抑制作用，而且安全性極低，因此化合物III 和化合物IV在治療甲型流感病毒感染疾病中沒有應(yīng)用背景。
[0079] 實施例6本發(fā)明所設(shè)及組合物31091302050629片劑的制備
[0080] 取2克組合物31091302050629,加入制備片劑的常規(guī)輔料18克，混勻，常規(guī)壓片機(jī) 制成100片。
[0081] 實施例7本發(fā)明所設(shè)及組合物31091302050629膠囊的制備
[0082] 取2克組合物31091302050629,加入制備膠囊劑的常規(guī)輔料如淀粉18克，混勻，裝 膠囊制成100粒。
【主權(quán)項】
1. 一種組合物31091302050629,其特征為該組合物由化合物III和化合物IV組成，該 組合物中化合物III和化合物IV的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)分別為45%和55%，2. 如權(quán)利要求1所述的組合物31091302050629的制備方法，其特征為：將化合物III 的粉末和化合物IV的粉末按照質(zhì)量百分?jǐn)?shù)分別為45 %和55 %充分混合。3. -種如權(quán)利要求1所述的組合物31091302050629在抗病毒藥物中的應(yīng)用。4. 如權(quán)利要求3所述的組合物31091302050629在抗病毒藥物中的應(yīng)用，其特征在于： 所述病毒為甲型流感病毒。5. 如權(quán)利要求3所述的組合物31091302050629在抗病毒藥物中的應(yīng)用，其特征在于： 所述病毒為單純皰疹病毒。6. 如權(quán)利要求3所述的組合物31091302050629在抗病毒藥物中的應(yīng)用，其特征在于： 所述病毒為呼吸道合胞病毒。7. 如權(quán)利要求5所述的組合物31091302050629在抗病毒藥物中的應(yīng)用，其特征在于： 所述單純皰疹病毒為單純皰疹病毒1型或者單純皰癥病毒2型。8. 如權(quán)利要求7所述的組合物31091302050629在抗病毒藥物中的應(yīng)用，其特征在于： 所述單純皰疹病毒1型為單純皰疹病毒1型的Sm44株。9. 如權(quán)利要求7所述的組合物31091302050629在抗病毒藥物中的應(yīng)用，其特征在于： 所述單純皰疹病毒2型為單純皰癥病毒2型333株。
【專利摘要】本發(fā)明涉及有機(jī)合成和藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及組合物31091302050629及其在制備抗病毒藥物上的用途。公開了一種組合物31091302050629及其制備方法。藥理學(xué)實驗表明，本發(fā)明的組合物31091302050629具有抗病毒作用，具有開發(fā)抗病毒藥物的價值。
【IPC分類】C07D295/088, A61K31/4025, A61P31/16, A61P31/22, A61K31/496
【公開號】CN105343087
【申請?zhí)枴緾N201510662596
【發(fā)明人】吳俊華, 黃蓉, 王慧
【申請人】南京大學(xué)
【公開日】2016年2月24日
【申請日】2015年10月14日