因子、底物與一種或多種促分泌素的組合也被包括在本發(fā)明內(nèi)。
[0025] 本文中還公開了通過腸消除來除去外源和/或內(nèi)源草酸鹽的方法，所述方法包括 將促分泌素自身或與草酸鹽降解酶、草酸鹽降解細菌、草酸鹽代謝中所設(shè)及的酶、輔助因 子、底物一起施用于需要除去草酸鹽的哺乳動物對象。
[0026] 一種或多種促分泌素與草酸鹽降解細菌、草酸鹽降解酶、草酸鹽代謝中所設(shè)及的 酶、輔助因子、底物的組合施用，確保了刺激草酸鹽通量W提高草酸鹽在腸腔方向上的轉(zhuǎn)運 W及草酸鹽在整個胃腸道內(nèi)更多的降解兩方面。
[0027] 因此，本發(fā)明設(shè)及包含一種或多種鑒定到的組分或促分泌素的藥物組合物，所述 組分或促分泌素源自重組表達的或從調(diào)節(jié)的介質(zhì)提取的草酸鹽降解細菌，與或不與一種或 多種草酸鹽降解細菌、草酸鹽降解酶、草酸鹽代謝中所設(shè)及的酶、輔助因子、底物或其組合 一起施用于患者。
[0028] 所述藥物組合物包含有效量的促分泌素。促分泌素的有效量包括通過分泌到腸道 中來降低全身存在的草酸鹽的比例的量?？蒞單獨或W與草酸鹽降解細菌和/或酶組合的 方式用于單劑量組合物中的量可W在約10 y g~1000, 000 y g、約100 y g~100, 000 y g、 約Img~IOOmg的范圍內(nèi)W及在其中所涵蓋的所有范圍內(nèi)。
[0029] 運種藥物組合物可W耐受胃酸的降解。所述組合物可W為例如片劑、膠囊或球的 形式，任選地具有腸溶包衣或?qū)υ谖负蜕喜啃∧c中的降解提供耐受性的其他機構(gòu)。
[0030] 本發(fā)明還設(shè)及一種對需要的對象進行治療的方法，其中所述方法包括施用有效量 的源自于草酸鹽降解細菌或由草酸鹽降解細菌產(chǎn)生的促分泌素化合物或包含所述促分泌 素化合物的藥物組合物，W降低對象中存在的草酸鹽，所述促分泌素化合物與或不與一種 或多種草酸鹽降解細菌、草酸鹽降解酶、草酸鹽代謝中所設(shè)及的酶、輔助因子、底物或其組 合一起施用。促分泌素的有效量包括通過分泌到腸道中來降低全身存在的草酸鹽的比例的 量。可W單獨或W與草酸鹽降解細菌和/或酶組合的方式用于單劑量組合物中的量可W在 約 10 Ji g ~1000, OOO Ji g、約 100 Ji g ~100, OOO Ji g、約 Img ~IOOmg 的范圍內(nèi) W及在其中 所涵蓋的所有范圍內(nèi)。
[0031]由此，本發(fā)明提供一種源自草酸鹽降解細菌例如源自產(chǎn)甲酸草酸桿菌的促分泌素 (下文中將更詳細地定義），用于治療對象中草酸鹽相關(guān)的疾病和/或草酸鹽相關(guān)的失衡 (下文中將更詳細地定義），其中促分泌素的施用導(dǎo)致對象中尿草酸鹽和/或血漿草酸鹽減 少。
[0032]根據(jù)本發(fā)明，草酸鹽相關(guān)疾病可W選自：原發(fā)性高草酸尿、高草酸尿、吸收性高草 酸尿、腸源性高草酸尿、特發(fā)性草酸巧腎結(jié)石疾?。蚴。⑼怅幫?、與終末期腎病相關(guān)的 尿酸鹽沉積癥、屯、臟傳導(dǎo)障礙、炎性腸病、克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎W及由胃腸道手術(shù)、減肥 手術(shù)（用于肥胖癥的手術(shù)）和/或抗生素治療造成的/與它們相關(guān)的障礙/病癥。
[0033]根據(jù)本發(fā)明，所述促分泌素可W包含氨基酸序列，其具有促分泌素活性并與SEQ ID NO: 1~19中任一項的氨基酸序列具有至少85 %如90 %、95 %、96 %、97 %、98 %、99 %或 100%的同一性。
[0034]所述促分泌素可W被重組表達在合適的有機體中或提取自調(diào)節(jié)的介質(zhì)。
[0035]本發(fā)明還提供一種藥物組合物，所述藥物組合物包含一種或多種如上所述的促 分泌素，任選地還包含一種或多種草酸鹽降解細菌、草酸鹽降解酶（下文中將更詳細地定 義）、草酸鹽代謝中所設(shè)及的酶（下文中將更詳細地定義）、輔助因子（下文中將更詳細地 定義）、底物（下文中將更詳細地定義）或其組合。
[0036]所述藥物組合物可W被配制成具有經(jīng)腸、腸胃外或局部施用途徑。
[0037] 本發(fā)明還提供一種對患有草酸鹽相關(guān)疾病的對象進行治療的方法，所述方法包括 將源自草酸鹽降解細菌的促分泌素施用于所述對象，其中所述促分泌素的施用導(dǎo)致對象中 尿和/或血漿草酸鹽減少。
[0038]在所述方法中，所述促分泌素可W包含氨基酸序列，其具有促分泌素活性并與SEQ ID NO: 1~19中任一項的氨基酸序列具有至少85 %如90 %、95 %、96 %、97 %、98 %、99 %或 100%的同一性。
[0039]所述方法還包括將一種或多種草酸鹽降解細菌、草酸鹽降解酶、草酸鹽代謝中所 設(shè)及的酶、輔助因子、底物或其組合施用于所述對象。
[0040]在所述方法中，草酸鹽相關(guān)疾病選自：原發(fā)性高草酸尿、高草酸尿、吸收性高草酸 尿、腸源性高草酸尿、特發(fā)性草酸巧腎結(jié)石疾?。蚴。?、外陰痛、與終末期腎病相關(guān)的尿 酸鹽沉積癥、屯、臟傳導(dǎo)障礙、炎性腸病、克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎W及由胃腸道手術(shù)、減肥手 術(shù)（用于肥胖癥的手術(shù)）和/或抗生素治療造成的/與它們相關(guān)的障礙/病癥。
[0041]本發(fā)明還提供一種制備如上所述的促分泌素的方法，所述方法包括：
[0042] i)將草酸鹽降解細菌如產(chǎn)甲酸草酸桿菌接種到溫度平衡的選擇性生長介質(zhì)中，所 述生長介質(zhì)特定地用于利用草酸鹽作為唯一碳源的微生物，所述生長介質(zhì)包括作為碳源的 草酸鹽、必需的痕量金屬W及在厭氧條件下的氨基酸；
[0043] ii)例如通過使用瓶口和無菌氣體的壓力，經(jīng)由不透空氣的管來置換液體，將細胞 培養(yǎng)物在厭氧條件下的容器之間如厭氧瓶之間或厭氧瓶與發(fā)酵罐之間轉(zhuǎn)移；
[0044]iii)收獲細胞懸浮液，并通過使用例如切向流過濾對所述細胞懸浮液進行處理W 從懸浮液分離全細胞和碎片，由此得到不含細胞的滲透物；
[0045] iv)例如通過使用中空纖維對所述不含細胞的滲透物進行過濾W得到滲余物，所 述中空纖維選擇性除去<IOk Da的化合物和希望減少的膚；
[004引V)通過使用例如液相色譜、電泳、沉淀、超離屯、和/或濃縮離屯、柱從所述滲余物分 離一種或多種促分泌素。
[0047] 特別地，本發(fā)明提供一種源自草酸鹽降解細菌例如源自產(chǎn)甲酸草酸桿菌的促分泌 素，其用于治療對象中草酸鹽相關(guān)的疾病和/或草酸鹽相關(guān)的失衡，其中促分泌素的施用 導(dǎo)致對象中尿草酸鹽和/或血漿草酸鹽減少，其中所述促分泌素化合物包含氨基酸序列， 所述氨基酸序列具有促分泌素活性并與SEQ ID NO: 3、4、6、13和19中任一項的氨基酸序列 具有至少85%如90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性。本發(fā)明還提供包含 運種促分泌素的藥物組合物。此外，本發(fā)明提供：一種治療患有草酸鹽相關(guān)疾病的對象的方 法，其包括將如上所述的促分泌素施用于所述對象；W及一種制備運種促分泌素的方法。
【附圖說明】
[0048] 圖IA~E :用于重組表達的產(chǎn)甲酸草酸桿菌的潛在的促分泌素蛋白質(zhì)的SDS-PAGE 凝膠（左）和Western印跡（右）。將牛血清白蛋白（2 y g)用作對照（泳道1)。在SDS-PAGE 凝膠上的祀蛋白在泳道2中示出，且在Western印跡上的祀蛋白在泳道3中示出。梯度重 量被顯示在各自分析圖像的右側(cè)。Ml=蛋白質(zhì)標記物Genscript目錄號M00505。M2=蛋 白質(zhì)標記物Genscript目錄號MM0908。
[0049] 圖IA :SEQ ID No. 3表達的蛋白質(zhì)分析。
[0050] 圖IB:SEQIDNo. 4表達的蛋白質(zhì)分析。
[0051] 圖IC :SEQ ID No. 6表達的蛋白質(zhì)分析。
[0052] 圖ID:SEQIDNo. 13表達的蛋白質(zhì)分析。
[005引圖IE :SEQIDNo:19表達的蛋白質(zhì)分析。
[0054]圖2 :顯示在0~30分鐘的首次通量時間段期間標記的草酸鹽（C14草酸鹽）的通 量的柱形圖。帶條紋的柱描繪了粘膜到漿膜的通量（M-S通量），且填充的柱描繪了漿膜到 粘膜的通量（S-M通量）。在橫軸上，Gl~G3表示S組治療，G =組。誤差柱=+SEM(平 均值的標準誤差）。豎軸顯示了 14C草酸鹽，單位為ymol ? cm2 . h。
[00巧]圖3 :顯示在30~60分鐘的二次通量時間段期間標記的草酸鹽（C14草酸鹽）的 通量的柱形圖。帶條紋的柱描繪了粘膜到漿膜的通量（M-S通量），且填充的柱描繪了漿膜 到粘膜的通量（S-M通量）。在橫軸上，Gl~G3表示S組治療，G=組。誤差柱=+SEM(平 均值的標準誤差）。豎軸顯示了 14C草酸鹽，單位為ymol ? cm2 . h。
[005引定義
[0057] 用于本文中的所有術(shù)語都意欲具有本領(lǐng)域中通常所賦予它們的含義。為了清晰起 見，下面還對一些術(shù)語進行了定義。
[00則促分泌素
[0059] 促分泌素是一種直接或間接促進另一種物質(zhì)、組分或化合物的分泌的物質(zhì)、組分 或化合物。促分泌素可W是膚、激素、蛋白質(zhì)或小分子。本文中的單詞促分泌素被用于鑒定 到的蛋白質(zhì)化合物，其在哺乳動物體內(nèi)具有提出的促分泌素效應(yīng)。
[0060] 本文中所述的促分泌素分離自產(chǎn)甲酸草酸桿菌細胞培養(yǎng)懸浮液的上清液，因此可 W源自分泌過程或細胞死亡和裂解促進的釋放。
[0061] 分泌的化合物和提出的促分泌素被表征為分子量在8. 8~98. SkDa范圍內(nèi)的蛋白 質(zhì)，其中巧0%的化合物在30~SOkDa的跨度內(nèi)。在十九種蛋白質(zhì)中，十=種是酶且剩余的 六種是不具有已知催化功能的蛋白質(zhì)。在運六種蛋白質(zhì)中，一種蛋白質(zhì)被定義為"保守的假 定蛋白質(zhì)"，即運種蛋白質(zhì)存在于來自幾種系統(tǒng)發(fā)育譜系的有機體內(nèi)，但還未在功能上對其 進行表征。將運六種蛋白質(zhì)中的另一種蛋白質(zhì)定義為"預(yù)測的蛋白質(zhì)"。運是出于詞條輸入 (entry)使用的，而沒有在蛋白質(zhì)、轉(zhuǎn)錄或同源性水平的證據(jù)。鑒定到的提出的促分泌素的 氨基酸序列在實施例4中示出，序列ID為：SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4等直至最后一個即沈Q ID NO: 19。
[0062] 與氨基酸序列ID :SEQ ID NO:3、4、6、13和19相對應(yīng)的五種蛋白質(zhì)被重組表達在 大腸桿菌中并在尤斯扣SSing)室內(nèi)在大鼠腸道組織上對標記的草酸鹽的促分泌素活性進 行了篩選。表達的所有重組蛋白質(zhì)都顯示出比對照物更低的總體草酸鹽通量。特別地，一 種蛋白質(zhì)即SEQ ID NO. 3具有增加標記的草酸鹽在大鼠末梢腸道組織上的凈分泌的效應(yīng)。
[0063]本文中還從穩(wěn)定性（不穩(wěn)定性指數(shù)II)、熱穩(wěn)定性（對于球狀蛋白質(zhì)：脂族指數(shù)） 和溶解度（GRAVY,總平均疏水性（Grand AverageOfHy化opathy))角度對分泌的化合物進 行了描述，參見實施例5。根據(jù)指數(shù)（得分MO)，=種蛋白質(zhì)被預(yù)測為不穩(wěn)定的：絲氨酸徑 甲基轉(zhuǎn)移酶、酷基載體蛋白質(zhì)、核黃素合酶P亞基。另外，對促分泌素的氨基酸序列的潛在 的信號膚切割位點進行了研究（參見實施例6)。
[0064] 調(diào)節(jié)的介質(zhì)
[0065] 調(diào)節(jié)的介質(zhì)是用于生長特殊有機體的生長介質(zhì)。術(shù)語"調(diào)節(jié)的"是指有機體已經(jīng) 利用原始介質(zhì)組合物的組分進行生長和代謝并釋放其代謝和基因表達產(chǎn)物運一事實。調(diào)節(jié) 的介質(zhì)還包含且是指在培養(yǎng)物生長所固有的連續(xù)細胞死亡和裂解后所釋放的代謝和基因 表達產(chǎn)物。調(diào)節(jié)的介質(zhì)還被稱為不含細胞的培養(yǎng)懸浮液。本文中所述的調(diào)節(jié)的介質(zhì)源自具 有實施例1中所述組成的未調(diào)節(jié)的介質(zhì)。運種未調(diào)節(jié)的介質(zhì)是出于產(chǎn)甲酸草酸桿菌生長W 及由此伴隨的促分泌素的制備的獨特目的而特別開發(fā)的專用介質(zhì)，且包含草酸鹽作為主要 碳源。
[0066] 草酸鹽降解酶
[0067] 術(shù)語"草酸鹽降解酶"應(yīng)解釋為能夠減少草酸鹽的任意酶，并包括草酸鹽脫簇酶、 草酸鹽氧化酶、甲酯基-CoA轉(zhuǎn)移酶和草酷基-CoA脫簇酶。其本身可減少草酸鹽和/或其 可W在草酸鹽減少通路中發(fā)揮作用。在本文中，術(shù)語"草酸鹽"包括草酸和/或其任意鹽。
[0068] 草酸鹽代謝中所設(shè)及的酶
[0069] 術(shù)語"草酸鹽代謝中所設(shè)及的酶"應(yīng)解釋為在與草酸鹽代謝相關(guān)的通路中發(fā)揮作 用的任意酶，并包括丙氨酸-乙醒酸轉(zhuǎn)氨酶（AGT)、乙醒酸還原酶（GR)和4-徑基-2-酬戊 二酸醒縮酶（HOGA)。
[0070] 輔助因子
[0071] 術(shù)語"輔助因子"應(yīng)解釋為酶的活性所需要的非酶化合物，且包括維生素Be、NAD\ NADP\ FAD、CoA、ATP 和 ADP。
[007引底物
[0073] 術(shù)語"底物"應(yīng)解釋為酶催化反應(yīng)的進入化合物，并包括草酸鹽、乙醒酸和4-徑 基-2-酬戊二酸等。
[0074