[0163] 將2. 73g在Iwt. %化OH溶液中被稀釋至1:5的1，4-下二醇二縮水甘油酸度孤巧 溶液添加至反應(yīng)混合物中，然后使用小伊進(jìn)行手動(dòng)均化15min。
[0164] 將由此得到的凝膠分為=個(gè)相等質(zhì)量W制備下面的=個(gè)段：
[016引-段1引入30°C恒溫槽比，然后用含肥1的憐酸鹽緩沖液稀釋W(xué)得到濃度為20mg/ml的NaHA和中性pH(=相B'）。機(jī)械均化相B'IOmin(=凝膠B'）。
[0166]-段2引入50°C恒溫槽化，然后用含肥1的憐酸鹽緩沖液稀釋W(xué)得到濃度為20mg/ ml的NaHA和中性抑（=相B")。機(jī)械均化相B"IOmin(=凝膠B")。
[0167]-段3引入30°C恒溫槽比。
[016引用B表示所述得到的部分交聯(lián)的相。
[0169]C)結(jié)合部分交聯(lián)的相A和B并繼續(xù)交聯(lián)
[0170] 將9.Og部分交聯(lián)的相A添加至13.Og部分交聯(lián)的相B中，在室溫下實(shí)施機(jī)械混合 15min后浸入50°C恒溫槽中化。
[017。 在含肥1的憐酸鹽緩沖液中中和交聯(lián)的產(chǎn)物至抑=7.0,其中使其溶脹24h然后 用憐酸鹽緩沖液對其透析24hW移除未反應(yīng)的抓DE。
[017引在機(jī)械均化IOmin后，得到透明質(zhì)酸鋼濃度為20mg/ml的凝膠1。 陽17引連施倆I2
[0174]實(shí)施例1的凝膠1的表征
[017引將凝膠1、A'、A"、B'和B"引入Iml的玻璃注射器中且下表中示出了通過27G1/2 針W12. 5mm/min的速率擠出凝膠所需的力。
[0176]
陽w]
陽17引可W看出：
[0179]-相A和相B的交聯(lián)反應(yīng)是部分的。確實(shí)，A"和B"的推頂力分別大于A'和B'， 說明了凝膠A"和B"比A'和B'更多地交聯(lián)，和
[0180]-根據(jù)本發(fā)明的凝膠1的推頂力低于B"的推動(dòng)力并因此比未經(jīng)受本發(fā)明交聯(lián)方法 的凝膠具有更好的注射能力。
[0181] 也測量了凝膠1在1. 0化下的流變粘彈性性能G'和G"。
[0182] 陽18引連施倆I3
[0184] 制備根據(jù)本發(fā)明的凝膠2
[0185]a)制備部分交聯(lián)的相C
[0186] 稱重4. 2g分子量約為2.OMDa且濕度水平為6. 3%的透明質(zhì)酸鋼（NaHA)粉末，向 其添加0. 3g濕度水平為2. 0%的簇甲基纖維素鋼（42mPa?S，在水中2%，20°C)和33. 6g 水性Iwt. %化OH溶液。
[0187] 實(shí)施粉末的水合作用Ih20min，具有使用小伊的規(guī)則的手動(dòng)均化作用。
[018引用H表示所得到的水合相。
[0189] 將1. 80g在Iwt. %化OH溶液中被稀釋至1:5的1，4-下二醇二縮水甘油酸度孤巧 溶液添加至反應(yīng)混合物中，然后使用小伊進(jìn)行手動(dòng)均化15min，然后將反應(yīng)混合物引入 50°C恒溫槽比30min。
[0190] b)制備部分交聯(lián)的相D
[01W] 將0.IOg在Iwt. %化OH溶液中被稀釋至1:5的1，4-下二醇二縮水甘油酸度孤巧 溶液添加至上述相H中，然后使用小伊進(jìn)行手動(dòng)均化15min，然后將反應(yīng)混合物引入50°C恒 溫槽化。
[0192] C)結(jié)合部分交聯(lián)的相C和D并繼續(xù)交聯(lián)
[0193] 將部分交聯(lián)的相D添加至部分交聯(lián)的相C中，在室溫下實(shí)施機(jī)械混合15min后浸 入50°C恒溫槽中化30min。
[0194] 在含肥1的憐酸鹽緩沖液中中和交聯(lián)的產(chǎn)物至抑=7. 0,其中使其溶脹24h然后 用憐酸鹽緩沖液對其透析24hW移除未反應(yīng)的抓DE。
[0195] 在機(jī)械均化IOmin后，得到透明質(zhì)酸鋼濃度為20mg/ml的凝膠2。
[019引連施倆I4
[0197] 制備根據(jù)本發(fā)明的可注射制劑1
[019引在25%的實(shí)施例3中得到的凝膠2質(zhì)量中，加入0. 3wt. %的鹽酸利多卡因粉末并 實(shí)施機(jī)械均化15min。
[0199]將由此得到的凝膠引入Iml玻璃注射器中，然后將所述注射器在高壓蓋中在 12rC下滅菌20min。
[0200] 連施倆I5
[0201] 制備根據(jù)本發(fā)明的可注射制劑2
[0202] 在25%的實(shí)施例3中得到的凝膠質(zhì)量2中，加入30wt. %粒度為30-50ym的含憐 巧徑憐灰石粉末并實(shí)施機(jī)械均化15min。
[0203] 將由此得到的凝膠引入Iml玻璃注射器中，然后將運(yùn)些注射器在高壓蓋中在 12rC下滅菌20min。 。204] 連施倆I6
[0205] 表征實(shí)施例4的可注射制劑
[0206] 發(fā)現(xiàn)實(shí)施例4中得到的無菌制劑是通過薄的27G1/2針可輕易注射的；在12. 5mm/ min的速率下測定的注射力是21. 3N。
[0207] 該制劑的抑和重量克分子滲透濃度是生理性的：
[020引-pH= 6. 9
[0209] 重量克分子滲透濃度=290m0sm/kg&0
[0210] 1. 0化下的流變特性導(dǎo)致74化的彈性模量G'和0. 25的Tan5。
[0211] 重要的是注意運(yùn)些流變特性與至真皮或皮下的注射是相適應(yīng)的。
[0212] 在兩個(gè)含8ml凈化水的IOml燒瓶中引入如下物質(zhì)：
[0引引-將ml的Restylane底（GaldermaQ-Med,Uppsala,Sweden)凝膠引入Fl; 艮estylane(霞是美學(xué)醫(yī)學(xué)中已知超過10年的基于W20mg/ml交聯(lián)的透明質(zhì)酸的產(chǎn)品，和[0214]-將Iml的可注射制劑引入F2。
[0引引手動(dòng)攬拌Fl和F25秒。在另一個(gè)10秒后，發(fā)現(xiàn)民estylane嚴(yán)產(chǎn)品完全在水中離解 (交聯(lián)透明質(zhì)酸顆粒在水中懸浮），運(yùn)不是總是為在水中凝膠形式的制劑1的情況?？勺⑸?制劑1的內(nèi)聚性水平因此比於瞬皆1抑e猿產(chǎn)品高很多。
[021引 連施倆I7
[0217] 將根據(jù)本發(fā)明的凝膠與現(xiàn)有技術(shù)扣S2010/0028435)對比 郵1引a)制備根據(jù)本發(fā)明的凝膠2 [0引引參見實(shí)施例3
[0220]b)根據(jù)US申請2010/0028435的實(shí)施例4制備現(xiàn)有技術(shù)凝膠X
[022。 稱重3. 50g分子量約為2.OMDa且濕度水平為6. 3 %的透明質(zhì)酸鋼（NaHA)粉末，向 其添加24.Og水性Iwt. %化OH溶液。
[0222] 實(shí)施所述粉末的水合作用比，然后使用小伊手動(dòng)均化lOmin。
[022引將700y1的抓DE添加至反應(yīng)介質(zhì)中，然后使用小伊進(jìn)行手動(dòng)均化lOmin，之后將 其浸入50°C恒溫槽化。
[0224] 在含肥1的憐酸鹽緩沖液中中和交聯(lián)的產(chǎn)物至抑=7. 0,其中使其溶脹2地（最終 體積=92ml)。
[0225] 使由此得到的凝膠經(jīng)過250ym網(wǎng)格通過連續(xù)通道從而將其磨成顆粒。
[0226] 用Xp表示得到的顆粒。
[0227] 稱重3. 50g分子量約為2.OMDa且濕度水平為6. 3 %的透明質(zhì)酸鋼（NaHA)粉末，向 其添加30. 5g水性Iwt. %化OH溶液。
[022引實(shí)施所述粉末的水合作用比，然后使用小伊手動(dòng)均化lOmin。
[022引將263y1的抓DE添加至反應(yīng)介質(zhì)中，然后使用小伊進(jìn)行手動(dòng)均化lOmin，之后將 其浸入50°C恒溫槽化。
[0230] 用Xg表示得到的交聯(lián)的產(chǎn)物。
[023。 將58g顆粒Xp和24g水性Iwt. %化OH溶液添加至交聯(lián)的產(chǎn)物Xg中，然后使用小 伊手動(dòng)均化IOmin并在25°C下繼續(xù)交聯(lián)反應(yīng)化。
[023引在含肥1的憐酸鹽緩沖液中中和交聯(lián)的產(chǎn)物至抑=7. 0,其中使其溶脹2地，然后 用憐酸鹽緩沖液對其透析24hW移除未反應(yīng)的抓DE。
[0233] 在機(jī)械均化30min后得到凝膠X。
[0234] C)對比凝膠2和凝膠X的制備過程
[0235] 將凝膠2和凝膠Y填充入Iml的玻璃注射器中并通過27G1/2針將其擠出（各凝膠 進(jìn)行6次試驗(yàn)/由操作者手動(dòng)注射）。凝膠2和凝膠X易于通過所述針注射，然而，值得注 意的是，發(fā)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的凝膠2在所述注射器內(nèi)具有好得多的均勻性。實(shí)際上，在注射過 程中，使用X凝膠實(shí)施所述測試的操作者對于必須應(yīng)用至所述注射器柱塞的力觀察到許多 不規(guī)則性（本發(fā)明的凝膠2不是運(yùn)種情況）；操作者將不規(guī)則性表征為"推"。另一方面，在 6個(gè)測試凝膠X的注射器中，2個(gè)注射器不能完全排出，因?yàn)獒樛耆荒z堵塞/阻塞（根 據(jù)本發(fā)明的凝膠2不是運(yùn)種情況）。
[0236] 如上所述，現(xiàn)有技術(shù)教導(dǎo)交聯(lián)的凝膠轉(zhuǎn)化為顆粒能夠降低產(chǎn)品的推頂力并因此能 夠增強(qiáng)其通過針的注射能力（強(qiáng)交聯(lián)的凝膠被研磨成可可能通過針孔的小尺寸的顆粒）。 令人驚奇的是，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的凝膠2-一其未經(jīng)過任何對部分交聯(lián)的相（一個(gè)是高度交聯(lián) 的另一個(gè)是較少交聯(lián)的）研磨的步驟且具有通過將所述兩種部分交聯(lián)的相結(jié)合和交聯(lián)而 得到的交聯(lián)的相一一也易于注射且更均勻。根據(jù)本發(fā)明的復(fù)雜的"多結(jié)構(gòu)化"（且沒有共交 聯(lián)的）結(jié)構(gòu)因此使其可能解決現(xiàn)有技術(shù)中描述的注射能力的問題而不必須研磨產(chǎn)品W將 其轉(zhuǎn)化為顆粒。
[0237] 對在制備凝膠2和凝膠X的過程中取出的凝膠樣品實(shí)施甲苯胺藍(lán)染色試驗(yàn)W評估 所述凝膠是否為顆粒。為此，將約0.Ig的被測試凝膠配置在載玻片上并添加五滴甲苯胺藍(lán) 水溶液（每100克去離子水中有0.Ig甲苯胺藍(lán)），然后將第二個(gè)載玻片放在第一個(gè)載玻片 上。然后使用顯微鏡在40X放大率下觀察結(jié)果并拍攝圖片。
[023引實(shí)施下面的顯色試驗(yàn)：
[0239] -對凝膠2 :對部分交聯(lián)的相C和D(參見圖1和圖2)和對由部分交聯(lián)的相C和D 得到的交聯(lián)的產(chǎn)物（參見圖3)，在將所述S個(gè)樣品中和至中性抑后；
[0240] -對凝膠X:對顆粒Xp(參見圖4)和對通過顆粒Xp的共交聯(lián)得到的交聯(lián)的產(chǎn)物 (參見圖5)，在將運(yùn)兩個(gè)樣品中和至中性抑后。
[0241] 與其中NaHA交聯(lián)的顆粒清楚顯示的圖4(也與圖5)相反，設(shè)及根據(jù)本發(fā)明的凝膠 2的圖1-3的凝膠結(jié)構(gòu)不是顆粒狀的。在本發(fā)明的交聯(lián)方法中部分交聯(lián)相的不轉(zhuǎn)化允許得 到不含共交聯(lián)NaHA的水凝膠。
[0242] 運(yùn)代表了相對于現(xiàn)有技術(shù)產(chǎn)品特別相對于在US2010/0028435和在EP2011816 中描述產(chǎn)品的一個(gè)顯著優(yōu)勢。確實(shí)，正如在文獻(xiàn)中也在申請US2010/0028435和EP2011816 中描述的，交聯(lián)的顆粒在短期和長期內(nèi)產(chǎn)生副作用和并發(fā)癥（在EP2011816中，交聯(lián)的顆 粒明確描述為產(chǎn)生或多或少強(qiáng)的對外來物質(zhì)的反應(yīng)）。在本發(fā)明中，不存在共交聯(lián)顆粒因此 代表了相對于US2010/0028435和EP2011816關(guān)于更好的產(chǎn)品安全性同時(shí)保持易注射性 的主要的改進(jìn)。
[0243] 另一方面，同樣重要的是要注意US2010/0028435和EP2011816聲稱限制體內(nèi)高 度交聯(lián)的顆粒的遷移，因?yàn)檫\(yùn)些顆粒與弱交聯(lián)的NaHA基質(zhì)共交聯(lián)。運(yùn)在短期內(nèi)是真實(shí)的， 但當(dāng)交聯(lián)的弱交聯(lián)的NaHA被再吸收時(shí)，在長期內(nèi)高度交聯(lián)顆粒的遷移再次變得可能。后一 點(diǎn)進(jìn)一步證實(shí)了根據(jù)本發(fā)明的可注射水凝膠安全性