用于對(duì)抗抗菌劑抗性細(xì)菌的組合物和方法
【專利說(shuō)明】用于對(duì)抗抗菌劑抗性細(xì)菌的組合物和方法
[0001] 本發(fā)明涉及用于對(duì)抗抗菌劑抗性細(xì)菌的組合物和方法。特別地，其涉及用于使細(xì) 菌對(duì)抗菌劑敏感并將該細(xì)菌暴露于已經(jīng)使其敏感的抗菌劑中從而將其殺滅。
[0002] 細(xì)菌引起一些最嚴(yán)重的人和動(dòng)物感染性疾病并且仍然是全世界死亡的主要原因。 抗菌劑抗性的發(fā)展是醫(yī)院和社區(qū)中治療細(xì)菌感染中的主要問(wèn)題。對(duì)抗微生物劑存在不同的 抗性機(jī)制，如固有抗藥性，其是不必與給定類型的抗微生物劑關(guān)聯(lián)的一般適應(yīng)性過(guò)程的結(jié) 果。這樣的抗藥性的實(shí)例可見(jiàn)于綠膿桿菌（Pseudomonasaeruginosa)，其低膜滲透性很可 能是其對(duì)許多抗菌劑先天抗藥的主要原因。后天抗藥性是主動(dòng)抗菌劑抗性的主要機(jī)制并且 是特定進(jìn)化壓力的結(jié)果，以允許細(xì)菌預(yù)先對(duì)抗菌劑敏感從而變得有抗性。這樣的抗藥性包 括滲透屏障的改變，包括外排栗的過(guò)表達(dá)；抗微生物藥物靶標(biāo)的改變；以及抗菌劑的失活， 例如通過(guò)酶修飾。在Bockstael&VanAerschot(2009)Eur.J.Med.4(2)，141_155 中綜述了 細(xì)菌的抗微生物劑抗性。
[0003] 仍舊需要對(duì)抗細(xì)菌感染的另外的方法，并且本發(fā)明涉及使抗菌劑抗性細(xì)菌對(duì)抗菌 劑的作用敏感，從而有助于克服抗菌劑抗性的方法。抑制抗菌劑抗性決定因子的試劑是已 知的，但并不都證實(shí)用于使細(xì)菌對(duì)抗菌劑敏感，原因是其不能進(jìn)入抗菌劑抗性細(xì)菌并到達(dá) 靶位點(diǎn)。本發(fā)明的目的旨在克服這些困難中的一些。
[0004] 本發(fā)明的第一方面提供了一種組合物，該組合物包含細(xì)菌進(jìn)入促進(jìn)劑和抑制抗菌 劑抗性的試劑。
[0005] 所述組合物還可以包含抗菌劑。
[0006] 本發(fā)明的再一方面提供了用于使細(xì)菌對(duì)抗菌劑敏感的方法，所述方法包括以下步 驟：在進(jìn)入促進(jìn)劑存在的情況下，使細(xì)菌暴露于抑制抗菌劑抗性的試劑中。
[0007] 本發(fā)明的另一方面提供了用于殺滅抗菌劑抗性細(xì)菌的方法，所述方法包括以下步 驟：在進(jìn)入促進(jìn)劑存在的情況下，使細(xì)菌暴露于抑制抗菌劑抗性的試劑中并使細(xì)菌暴露于 抗囷劑中。
[0008] 本發(fā)明實(shí)施方案的任何方面中的進(jìn)入促進(jìn)劑優(yōu)選地如在2012年10月11日提交 的PCT/GB2012/052526中所述的進(jìn)入促進(jìn)劑，通過(guò)引用將其并入本文中。
[0009] 術(shù)語(yǔ)"進(jìn)入促進(jìn)劑"意指能夠進(jìn)入細(xì)菌的莢膜和/或細(xì)胞壁的化合物或組合物。優(yōu) 選地，所述試劑還能夠使抑制抗菌劑抗性的試劑也通過(guò)細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)膜。
[0010] 進(jìn)入促進(jìn)劑
[0011] 本發(fā)明的任意方面或?qū)嵤┓桨傅倪M(jìn)入促進(jìn)劑典型地為聚合物，其中所述聚合物包 括直鏈和/或支鏈聚單胍/聚胍、聚雙胍或其類似物或衍生物，例如根據(jù)下式la或式lb的， 并在下表1和2中給出實(shí)例：
[0012] 式la
[0013]
[0016]其中：
[0017] "η"是指聚合物中重復(fù)單元的數(shù)量，并且η可以從2到1000變化，例如從2或5到 10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800 或 900變化；
[0018]GJPG2獨(dú)立地表示包含雙胍或胍的陽(yáng)離子基團(tuán)，其中LJPL2直接連接到胍的氮原 子上。因此，雙胍或胍基與聚合物骨架是成一體的。雙胍或胍基在式la中不是側(cè)鏈部分。
[0019] 陽(yáng)離子基團(tuán)的實(shí)例：
[0023] 在本發(fā)明中，LdPL2是聚合物中G 62陽(yáng)離子基團(tuán)之間的連接基團(tuán)。L1^可 以獨(dú)立地表不含有。碳原子的脂肪族基團(tuán)，例如烷基基團(tuán)如亞甲基、亞乙基、亞丙基、C4、C5、C6、C7、C8、。9或C10;C「C10、_C20、_C30、_C40、_C50、_C60、_C70、_C80、_C90、_C100、_C110、_C120、 -C13?；?c14。，烷基；或LJPL2可以（獨(dú)立地）為C「C14。（例如CpC2、C3、C4、C5、C6、C7、Cs、C9 或C1Q;C「C1Q、_C2。、_C3。、_C4。、_C5。、_C6。、_C7。、_C8。、-C9。、_C1Q。、-Cn。、_C12。、_C13?；騙c14。）、月曰環(huán) 族基團(tuán)、雜環(huán)基團(tuán)、芳香族基團(tuán)、芳基、烷基芳基、芳基烷基、氧基亞烷基，或LdPL2可以（獨(dú) 立地）為任選地被一個(gè)或多個(gè)，優(yōu)選地一個(gè)氧、氮或硫原子、官能團(tuán)以及飽和或不飽和的環(huán) 部分中斷的聚亞烷基。適合的LdPL2的實(shí)例是表1中列出的基團(tuán)。
[0024]LpL2、GjPG2可能已使用脂肪族基團(tuán)、脂環(huán)族基團(tuán)、雜環(huán)基、芳基、燒芳基、和氧基 亞烷基修飾。
[0025] ~和63優(yōu)選地為端基。典型地，用于本發(fā)明的聚合物具有末端的氨基（N)和氰基 狐（G3)或狐（G3)端基。這樣的端基可以通過(guò)與脂肪族基團(tuán)、脂環(huán)族基團(tuán)、雜環(huán)基、芳基、烷基 芳基、芳基烷基、氧基亞烷基連接（例如使用1，6-二氨基己烷、1，6-雙（氰基胍基）己烷、 1，6-二胍基己烷、4-胍基丁酸）來(lái)修飾。此外，可以通過(guò)與受體配體、右旋糖酐、環(huán)糊精、月旨 肪酸或脂肪酸衍生物、膽固醇或膽固醇衍生物或聚乙二醇（PEG)連接來(lái)修飾端基。任選地， 聚合物可以在N和G3位置處以胍或雙胍或氰基胺或胺或氰基胍結(jié)束，或在N處以氰基胺結(jié) 束而在G3位置處以氰基胍結(jié)束，或在N處以胍結(jié)束而在G3位置處以氰基胍結(jié)束，或在G3處 以L1胺結(jié)束和在N處以氰基胍結(jié)束。G3可以是h-胺、L2-氰基胍或1^2-胍。根據(jù)聚合（η) 或聚合物鏈斷裂的數(shù)量和在合成過(guò)程中的副作用，端基的不均勻混合物可以作為實(shí)例如上 所述出現(xiàn)。因此，如上所記載的，Ν和G3基團(tuán)可以互換/作為不均勻混合物存在?？蛇x地 Ν和63可以不存在并且聚合物可以是環(huán)狀的，在這種情況下各個(gè)末端的LJPG2基團(tuán)彼此直 接連接。
[0026] 在式lb中，X可以存在或不存在。L3、LjPX如以上針對(duì)"1^或1^2 "所述的。。和 L4以及X是聚合物中G4和G5陽(yáng)離子基團(tuán)之間的連接基團(tuán)。L3和L4以及X可以獨(dú)立地表示 含有。碳原子的脂肪族基團(tuán)，例如烷基基團(tuán)如亞甲基、亞乙基、亞丙基、C4、C5、C6、C7、CS、 09或C10;C「C10、_C2。、_C3。、_C4。、_C5。、_C6。、_C7。、_C8。、_C9。、_C10。、_Cn。、_C12。、_C13?；騙Cμ。， 基；或LjpL4以及X可以獨(dú)立地為C「C14。（例如CpC2、C3、C4、C5、C6、C7、Cs、(：9或C1Q;C「C1Q 、_C2。、_C3。、_C4。、_C5。、_C6。、_C7。、_C8。、-C9。、_C1Q。、-Cn。、_C12。、_C13?；騙c14。）、月曰環(huán)族基團(tuán)、雜環(huán)基 團(tuán)、芳香族基團(tuán)、芳基、烷基芳基、芳基烷基、氧基亞烷基，或1<5和L4以及X可以獨(dú)立地為任 選地被一個(gè)或多個(gè)，優(yōu)選一個(gè)氧、氮或硫原子、官能團(tuán)以及飽和或不飽和的環(huán)部分中斷的聚 亞烷基。適合的LjpL4以及X的實(shí)例是表2中列出的基團(tuán)。
[0027] "G/'和"G5"是陽(yáng)離子部分并且可以相同或不同。它們中的至少一個(gè)是雙胍部分 或氨基甲?；遥渌糠挚梢匀缟纤觯p胍或氨基甲?；遥┗虬?。為了避免疑問(wèn)，在 式lb中，陽(yáng)離子部分64和65僅不含單胍基團(tuán)。例如，GjPG5典型地不含單胍基團(tuán)。這樣 的化合物的實(shí)例是如表2中列出的聚烯丙基雙胍、聚（烯丙基二胍基-共（co)-烯丙胺）、 聚（烯丙基氨基甲?；一?共-烯丙胺）、聚乙烯基雙胍。
[0028] 聚烯丙基雙胍的實(shí)例如下所示
[0029]
[0030] 在聚烯丙基雙胍的情況下，L#PL4相同，G4和G5類似，因此聚烯丙基雙胍可以簡(jiǎn) 化如下。
[0031]
[0032] 聚（烯丙基氨基甲酰基胍基-共-烯丙胺）的實(shí)例如下所示
[0033]
[0034] 用于本發(fā)明的聚合物一般會(huì)有與其相關(guān)的抗衡離子。適合的抗衡離子包括但不限 于以下：鹵化物（例如氯化物）、磷酸鹽、乳酸鹽、膦酸鹽、磺酸鹽、氨基羧酸鹽、羧酸鹽、羥基 羧酸鹽、有機(jī)磷酸鹽、有機(jī)膦酸鹽、有機(jī)磺酸鹽和有機(jī)硫酸鹽。
[0035] 用于本發(fā)明的聚合物可以是不同"η"數(shù)目的聚合物的不均勻混合物或通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)純 化方法純化的包含指定"η"數(shù)目的均勻部分。如上面所表明，聚合物也可以是環(huán)狀的，另外 可以是分支的。
[0036] "η" 的優(yōu)選數(shù)目包括 2-250、2-100、2-80 和 2-50。
[0037] 表1.由式la產(chǎn)生的聚合物類似物的實(shí)例
[0043] 表2.由式lb產(chǎn)生的聚合物類似物的實(shí)例。
[0044]
[0045] 用于本發(fā)明的方法、組合物、制劑、用途和試劑盒的進(jìn)入促進(jìn)劑可以包含線性、分 支或樹(shù)狀分子。進(jìn)入促進(jìn)劑可以包含線性、分支或樹(shù)狀分子的組合。進(jìn)入促進(jìn)劑可以包含 式la或式lb的分子的一個(gè)或任意組合，例如如上所述。
[0046] 例如，進(jìn)入促進(jìn)劑可以包含聚六亞甲基雙胍（PHMB)、聚六亞甲基單胍（PHMG)、聚 亞乙基雙胍（PEB)、聚四亞甲基雙胍（PTMB)或聚亞乙基六亞甲基雙胍（PEHMB)中的一種或 多種。一些實(shí)例列于表1和2。本發(fā)明的任意方面的進(jìn)入促進(jìn)劑優(yōu)選為PHMB或PHMG或兩 者中任一個(gè)的類似物或衍生物。
[0047] 進(jìn)入促進(jìn)劑可以包含聚六亞甲基雙胍（PHMB)、聚六亞甲基單胍（PHMG)、聚亞乙 基雙胍（PEB)、聚四亞甲基雙胍（PTMB)、聚亞乙基六亞甲基雙胍（PEHMB)、聚亞甲基雙胍 (PMB)、聚（烯丙基二胍基-共-烯丙胺）、聚（N-乙烯基雙胍）、聚烯丙基雙胍中的一種或 多種的均勻或不均勻混合物。
[0048] 如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員眾所周知的，化合物可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)程序在實(shí)驗(yàn)室合成或可 以得自商業(yè)供應(yīng)商。
[0049] 例如，PHMB還具有同義詞聚（六亞甲基）雙胍鹽酸鹽；聚合雙胍鹽酸鹽；聚鹽酸 己雙胍；雙胍；CAS號(hào)27083-27-8 ;32289-58-0 ;IUPAC名稱聚（亞氨基酰亞胺羰基）亞 氨基六亞甲基鹽酸鹽。PHMB可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)程序在實(shí)驗(yàn)室合成或可以得自供應(yīng)商，例如 Arch(http://www.archchemicals.com/Fed/BIO/Products/phmb.htm) 〇 典型地n= 2 至 40,平均值n為11，平均分子量為3025。PHMB作為殺蟲(chóng)劑出售，例如用于衛(wèi)生產(chǎn)品、游泳池 水處理和傷口敷料。
[0050] 聚六亞甲基單胍（PHMG)可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)程序在實(shí)驗(yàn)室合成或可以得自供應(yīng)商， 例如得自ShanghaiSounderIndustryCo. ,Ltd,http://sounder,en.busytrade.com/ products/info/683633/PHMG·html〇
[0051] 如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解的，進(jìn)入促進(jìn)聚合物可以是共聚物或雜聚物，即單 體可以不是相同的。然而，通常單體單元相同。
[0052] 抑制抗菌劑抗性的試劑和進(jìn)入促進(jìn)劑可以共價(jià)連接?？蛇x地，抑制抗菌劑抗性的 試劑和進(jìn)入促進(jìn)劑可以提供為制劑，例如非共價(jià)絡(luò)合絡(luò)合物?？梢酝ㄟ^(guò)將進(jìn)入促進(jìn)劑和抑 制抗菌劑抗性的試劑以適當(dāng)?shù)谋嚷什⒃谶m當(dāng)?shù)臈l件下，例如pH和鹽濃度適當(dāng)?shù)臈l件下混 合來(lái)制備制劑?？梢岳缤ㄟ^(guò)使用等摩爾濃度的載體和貨物（cargo)分子，從抑制抗菌劑 抗性的試劑比進(jìn)入促進(jìn)劑摩爾過(guò)量高達(dá)1〇〇倍開(kāi)始，到進(jìn)入促進(jìn)劑比抑制抗菌劑抗性的試 劑摩爾過(guò)量高達(dá)1000倍來(lái)進(jìn)行該方法。例如，抑制抗菌劑抗性的試劑和進(jìn)入促進(jìn)劑的適當(dāng) 的摩爾比可以為1:0. 1至1:50或1:0. 5至1:1000,例如1:1至1:10或1:5,例如1:1. 5左 右。抑制抗菌劑抗性的試劑和進(jìn)入促進(jìn)劑的適當(dāng)?shù)闹亓浚褐亓勘瓤梢詾?:0. 1至1:50或 1:0. 5至1:1000,例如1:1至1:10或1:5,例如1:1. 5左右。以下進(jìn)一步討論絡(luò)合物的形 成。
[0053] 混合/孵育進(jìn)入促進(jìn)劑和抑制抗菌劑抗性的試劑的pH可以是高pH，例如 10-13. 5,如以下進(jìn)一步討論的。特別優(yōu)選的是，當(dāng)抑制抗菌劑抗性的試劑是核酸時(shí)，在高pH 下混合/孵育所述試劑。
[0054] 可選地，混合/孵育進(jìn)入促進(jìn)劑和抑制抗菌劑抗性的試劑的pH可以是中性pH，例 如6. 5至8. 6。特別優(yōu)選的是，當(dāng)抑制抗菌劑抗性的試劑是肽時(shí)，在中性pH下混合所述試 劑。適當(dāng)?shù)姆跤龡l件將由本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)確定并且可以根據(jù)使用的試劑的確切性質(zhì)來(lái)優(yōu) 化。將選擇向細(xì)菌細(xì)胞提供最有效的遞送的條件。在適當(dāng)?shù)那闆r下，pH可以是低pH，即小 于6〇
[0055] 在一個(gè)實(shí)施方案中，可以在具有尚pH的緩沖液中一起提供進(jìn)入促進(jìn)劑和抑制抗 菌劑抗性的試劑。因此，用于促進(jìn)抑制抗菌劑抗性的試劑進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞的方法可以包括以 下步驟：在進(jìn)入促進(jìn)劑的存在下將細(xì)菌細(xì)胞暴露于抑制抗菌劑抗性的試劑中（均如上所 述），其中所述抑制抗菌劑抗性的試劑和進(jìn)入促進(jìn)劑已經(jīng)在高pH下混合或孵育，例如在具 有高pH的緩沖液中混合或孵育。術(shù)語(yǔ)"高pH"對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是眾所周知的并且 典型地指9以上的pH，例如9. 5以上或10以上，例如10至13. 5的pH。典型地，在高pH下 混合抑制抗菌劑抗性的試劑和進(jìn)入促進(jìn)劑以形成納米粒子，然后在進(jìn)入促進(jìn)劑的存在下將 細(xì)菌細(xì)胞暴露于抑制抗菌劑抗性的試劑中。
[0056] 在再一個(gè)實(shí)施方案中，可以在具有中性pH的緩沖液中一起提供進(jìn)入促進(jìn)劑和抑 制抗菌劑抗性的試劑。因此，用于促進(jìn)抑制抗菌劑抗性的試劑進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞的方法可以包 括以下步驟：在進(jìn)入促進(jìn)劑的存在下將細(xì)菌細(xì)胞暴露于抑制抗菌劑抗性的試劑中（均如上 所述），其中所述抑制抗菌劑抗性的試劑和進(jìn)入促進(jìn)劑已經(jīng)在中性pH下混合或孵育，例如 在具有中性pH的緩沖液中混合或孵育。術(shù)語(yǔ)"中性pH"對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是眾所周 知的并且典型地指7左右的pH，例如6以上或9以下，例如6. 5至8. 6的pH?？梢栽谥行?pH下混合抑制抗菌劑抗性的試劑和進(jìn)入促進(jìn)劑以形成納米粒子，然后在進(jìn)入促進(jìn)劑的存在 下將細(xì)菌細(xì)胞暴露于抑制抗菌劑抗性的試劑中。
[0057] 具體地，如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，認(rèn)為pH6 - 13. 5的緩沖液（有或沒(méi)有添加的 鹽，如在分子生物學(xué)緩沖液，例如例如PBS、NaCl或許多其他中常用的）提供具有改進(jìn)的 遞送效率的制劑，根據(jù)待遞送的試劑的性質(zhì)改變pH?？梢杂眠m合的生長(zhǎng)培養(yǎng)基以1:1至 1:1000稀釋所生產(chǎn)的絡(luò)合物，甚