A-3J (序列ID編號 7)和反向引物 3_-PBP2a-XhoI,Hindlll(5_-AAGCTTCTCGAGTTATTCATCTA TATCGTA-3_)(序列ID編號8)。設(shè)計引物使得N端的前23個氨基酸缺失。凝膠純化所產(chǎn) 生的DNA片段（_2kb)，然后根據(jù)制造商的方案通過使用凝膠純化試劑盒（Invitrogen)進(jìn) 行純化。使用T4連接酶將基因連接到pGEM-T載體（Promega，Madison，WI)上，并轉(zhuǎn)化到感 受態(tài)XLl-Blue細(xì)胞中。通過使用T7和SP6啟動子引物對pGEM-T載體上的mecA基因進(jìn)行 測序。使用相同的限制性酶（EcoRI和Xhol)酶切經(jīng)驗證的插入DNA和pGEX-4Tl載體（GE Healthcare,Piscataway,NJ)，然后連接在一起以生成表達(dá)載體pGEX_PBP2a。
[0137] PBP2a表達(dá)。將重組載體pGEX_PBP2a轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 (DE3)細(xì)胞 (Invitrogen)中用于蛋白質(zhì)表達(dá)。使細(xì)胞在37°C下，在包含100_g/ml氨節(jié)青霉素的 Luria-Bertani肉湯中生長，直到培養(yǎng)物達(dá)到600nm下0. 6的最佳密度。在冰浴中冷卻培養(yǎng) 物lOmin，然后將其置于18°C下的振蕩器中，并通過添加0. 5mMIPTG(異丙基-_-D-硫代半 乳糖苷）來誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)。然后，使細(xì)胞在18°C下，在震蕩下生長過夜（16h)，之后通過 在4°C下離心收獲細(xì)胞。對于大規(guī)模生產(chǎn)，使用各自包含350ml培養(yǎng)物的三個1-升燒瓶。
[0138] GST_PBP2a純化。所有的純化步驟均在4°C下進(jìn)行。將細(xì)菌細(xì)胞沉淀物（pellet) 重懸浮在60ml冰冷裂解緩沖液（40mM Na2HP04、10mM KH2P04、300mM NaCl[pH 7.4])中。使 用微流化器（型號M100L ;Microf luidics，Newton, ΜΑ)裂解細(xì)菌細(xì)胞。以30, 000_g離心細(xì) 菌提取物30min，收集上清液并再旋轉(zhuǎn)20min，再次收集上清液并在-80°C下冷凍儲存。按照 制造商的說明將GST-PBP2a融合蛋白在GST樹脂（GenScript目錄號L00206)上進(jìn)行純化。
[0139] GST標(biāo)記的裂解。使用磷酸鹽緩沖鹽水（PBS)重構(gòu)凝血酶（GEHealthcare,目錄號 27-0846-01)以得到1U/_1的終溶液。將小份儲存在-80°C下。為了從純化的GST-PBP2a裂 解谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶（GST)標(biāo)記，使用70U的凝血酶，在4°C下處理5mgGST-PBP2a過夜。 使用SDS-PAGE證實裂解。通過使游離GST標(biāo)記和未裂解的GST-PBP2a通過如上所述的GST 樹脂而將其從裂解產(chǎn)物PBP2a中去除。經(jīng)純化的無標(biāo)記PBP2a通過溢流道（flowthrough) 中的柱，而保留GST和GST-PBP2a。收集小部分，通過SDS-PAGE分析純度并通過Bradford 測定分析蛋白濃度，然后濃縮。
[0140] 可選地，PBP2a蛋白可以購自Sunny實驗室，目錄號P555。
[0141] 抑制PBP2a的表征。對于抑制劑篩選，使用親和標(biāo)記將重組表達(dá)和純化的PBP2a 固定到微滴定板孔的表面。然后使孔與肽適體或事實上任何可能的PBP2a抑制劑的系列稀 釋溶液，加PBP2a底物如BI〇-AMP(Bobbaetal.2011)，在PBS中的固定濃度下孵育。在大 約15min之后，停止結(jié)合反應(yīng)，并如上所述（Bobbaetal.2011)使板顯色。從對照反應(yīng)減 去熒光的背景水平，然后計算抑制劑結(jié)合數(shù)據(jù)并繪圖以確定結(jié)合的Kiapp。
[0142] 參考文獻(xiàn)-SudheerBobba,V.Κ·ChaithanyaPonnaluri,MridulMukherji andWilliamG.Gutheil*MicrotiterPlate-BasedAssayforInhibitorsof Penicillin-BindingProtein2afromMethici11in-ResistantStaphylococcus aureus.Antimicrob.AgentsChemother.June2011vol.55no.6 2783-2787
[0143] 用于篩選靶分子（如PBP2a)結(jié)合配偶體的適合的噬菌體展示方案。
[0144] 材料
[0145] ·EZ-Lillk?(ThermoScientificPierce,目錄號 21441)
[0146] ·DMS0(二甲亞諷）（Sigma-Aldrich,目錄號D8418)
[0147] ·PBS(磷酸鹽緩沖鹽水）（137mMNaCl;10mM磷酸鹽；2. 7mMKC1;pH7· 4)
[0148] ·PBST(PBS+0. 1%Tween-20)
[0149] ?自旋脫鹽柱，7KMffCO(ThermoScientificPierce,目錄號 89882/89883)
[0150] ·Nunc-ImmunoTMMaxiSorp?條（ThermoScientific,目錄號 469949)
[0151] ·lOx封閉緩沖液（Sigma,目錄號B6429)
[0152] ?高靈敏度鏈霉親和素-HRP(ThermoScientificPierce,目錄號 21130)
[0153] ·TMB(Seramun，目錄號S-001-TMB)
[0154] ·ER2738大腸桿菌細(xì)胞
[0155] · 2TY培養(yǎng)基（每升：10g酵母提取物；16g胰蛋白胨；5gNaCl)
[0156] ?鹽酸四環(huán)素（12mg/ml，在70%乙醇溶液中）
[0157] ?涂覆的鏈霉親和素（HBC) 8-孔條（ThermoScientificPierce,目錄號 15501)
[0158] · 0· 2M甘氨酸，pH2· 2
[0159] · 1ΜTris-HCl，pH9· 1
[0160] ?三乙胺（Sigma-Aldrich,目錄號T0886)
[0161] · 1MTris-HCl，pH7
[0162] ?含有100μg/ml羧芐青霉素的LB瓊脂平板
[0163] ?羧芐青霉素（500x儲備液：50mg/ml，在ddH20溶液中）
[0164] ·Μ13Κ07輔助噬菌體
[0165] ?卡那霉素（500χ儲備液：25mg/ml，在ddH20溶液中）
[0166] ·PEG-NaCl沉淀溶液（20% (w/v)PEG8000,2· 5MNaCl)
[0167] ·TE(10mMTris；lmMEDTA；pH8. 0)
[0168] ?甘油（Sigma-Aldrich,目錄號G6279)
[0169] ·Eppendorf管（Eppendorf,目錄號 0030 108. 116)
[0170] ?鏈霉親和素珠（Dynabeads?MyOne?鏈霉親和素Tl，lOmg/ml)(Invitrogen目 錄號 656. 01/656. 02)
[0171] ?深孔 96 平板（ThermoScientific,目錄號 95040450)
[0172] ·KingFisher(200ul) 96 平板（ThermoScientific,目錄號 97002540)
[0173] ?中和親和素涂覆的（HBC) 8_ 孔條（ThermoScientificPierce,目錄號 15508)
[0174] ·?ΤΤ(二硫蘇糖醇）
[0175] 方法
[0176] 第一輪淘選
[0177] 步驟1 :使靶蛋白與生物素交聯(lián)
[0178] 1.在打開之前將EZ-Link_SiNHS-SS-生物素（ThermoScientificPierce,目錄 號21441)的小瓶平衡至室溫。使用前即刻制備5mg/mlNHS-SS-生物素的DMS0溶液（如 100μ1 的DMS0 中 0· 5mg的NHS-SS-生物素）。
[0179] 2.將適當(dāng)體積的NHS-SS-生物素溶液加入到蛋白質(zhì)中-如對于12KDa蛋白質(zhì)， 將5μ1的lmg/ml溶液加入到總體積為50μ1的PBS(或?qū)τ谑杷缘鞍踪|(zhì)為PBST)中的 0· 4μ1的NHS-SS-生物素中。調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的體積以根據(jù)其分子量（MW)加入一艮Ρ具有較低 MW的蛋白質(zhì)加入較少，而具有較高M(jìn)W的蛋白質(zhì)加入較多。
[0180] 3.在室溫下孵育1小時。
[0181] 4.使用Zeba自旋脫鹽柱，7ΚMWCO(ThermoScientificPierce,目錄號 89882/89883)，按照制造商的說明脫鹽以去除任何剩余的生物素。
[0182] 5.等分并儲存在4°C下。
[0183] 步驟2 :ELISA以檢查生物素化
[0184] 1.將 50μ1 每孔的PBS等份分到Nunc-ImmunoTMMaxiSorp?條（Thermo Scientific,目錄號 469949)。
[0185] 2.加入1、0. 1和0. 01μ1的生物素化蛋白質(zhì)-即對于0. 1μ1加入1μ1的1:10 稀釋液，對于〇· 01μ1加入1μ1的1:100稀釋液。
[0186] 3.在4°C下孵育過夜。
[0187] 4.在平板洗滌器上用300μ1每孔的PBST清洗3次
[0188] 5.等分250μ1每孔的10χ封閉緩沖液（Sigma,目錄號Β6429)并在37°C下孵育 3小時。
[0189] 6.在平板洗滌器上用300μ1每孔的PBST清洗3次。
[0190] 7.將高靈敏度鏈霉親和素-HRP(ThermoScientificPierce,目錄號21130)用 2x封閉緩沖液（Sigma10x封閉緩沖液dilutedinPBST)以1:1000稀釋并等分至50μ1 每孔。
[0191] 8.在振動臺振蕩器（HeidolphVIBRAMAX100 ;速度設(shè)定3)上室溫下孵育1小時。
[0192] 9.在平板洗滌器上用300μ1每孔的PBST清洗6次。
[0193] 10.等分 50μ1 每孔的TMB(SeramunBlau? 快速TMB/ 底物溶液，Seramun,目錄 號S-001-TMB)并允許顯色。（注意，允許平板顯色的時間量。）
[0194] 11.測量620nm下的吸光度。
[0195] 步驟3 :設(shè)置鏈霉親和素平板和ER2738大腸桿菌細(xì)胞，并進(jìn)行噬菌體展示
[0196] 1.將ER2738大腸桿菌細(xì)胞菌落挑選到5ml的具有12μg/ml四環(huán)素的2TY培養(yǎng)基 中并在37°C，225rpm的轉(zhuǎn)式培養(yǎng)箱中孵育過夜。
[0197] 2.將300μ1每孔的2x封閉緩沖液等分到鏈霉親和素涂覆的（HBC) 8-孔條 (ThermoScientificPierce,目錄號15501)中并在37°C下（在不攪拌的情況下）孵育過 夜-每種靶蛋白總共設(shè)置4個孔（3個孔用于預(yù)淘選噬菌體，1個孔用于結(jié)合靶蛋白和淘選 噬菌體）。
[0198] 3.在平板洗滌器上用300μ1每孔的PBST清洗3次。
[0199] 4.等分100μ1每孔的2χ封閉緩沖液并將2. 5μ1的生物素化蛋白質(zhì)加入到待用 于淘選的孔中。
[0200] 5.在振動臺振蕩器（HeidolphVIBRAMAX100 ;速度設(shè)定3)上室溫下孵育2小 時-同時開始預(yù)淘選噬菌體。
[0201] 6.從第一預(yù)淘選孔中去除緩沖液并加入100μ1的2x封閉緩沖液。向該孔中加入 5μ1的表達(dá)選擇的支架肽的優(yōu)選肽展示菌體文庫，即DARPIn、Affimer、線性（linear)。 混合并在振動臺振蕩器（HeidolphVIBRAMAX100 ;速度設(shè)定3)上孵育40min。
[0202] 7.從第二預(yù)淘選孔中去除緩沖液并將含有噬菌體的緩沖液從第一預(yù)淘選孔轉(zhuǎn)移 到第二預(yù)淘選孔中。孵育40min，然后針對第三預(yù)淘選孔重復(fù)此過程。
[0203] 8.使用多通道移液器，用200μ1每孔的PBST清洗6次，孔含有靶蛋白。
[0204] 9.將噬菌體從預(yù)淘選孔轉(zhuǎn)移到含有靶蛋白的孔中并在振動臺振蕩器（Heidolph VIBRAMAX100 ;速度設(shè)定3)上室溫下孵育2小時。
[0205] 10.同時，通過將培養(yǎng)物以大約1:15稀釋并在37°C、225rpm下孵育大約1小時以 得到0. 6的A6。。來設(shè)置ER2738細(xì)胞的新鮮培養(yǎng)物。
[0206] 11.在平板洗滌器上，用300μ1每孔的PBST清洗淘選孔6次
[0207] 12.通過加入100μ1的0. 2M甘氨酸，pH2. 2和室溫下孵育lOmin來洗脫噬菌體。
[0208] 13.通過加入15μ1的1MTris-HCl，pH9. 1中和?；旌喜⒘⒓醇尤氲?0mlfalcon 管中的ER2738細(xì)胞的8ml等分小份中。
[0209] 14.使用 986μ1PBS稀釋 14μ1 的三乙胺（Sigma-Aldrich,目錄號T0886)。
[0210] 15.通過加入100μ1經(jīng)稀釋的三乙胺并在室溫下孵育6min洗脫任何剩余的噬菌 體。
[0211] 16.通過加入50μ1的1MTris-HCl，pH7下中和?；旌喜⒘⒓醇尤氲紼R2738細(xì) 胞中。
[0212] 17.在37°C下孵育細(xì)胞（無振動或以低速振動，最大90rpm)。
[0213] 18.將1μ1噬菌體感染的大腸桿菌K12ER2738細(xì)胞平鋪在含有100μg/ml羧芐青 霉素的LB瓊脂平板上-在37°C下孵育過夜。
[0214] 19.以3, 000xg離心剩余的細(xì)胞5min從而以更小的體積重懸浮并平鋪在含有 100μg/ml羧芐青霉素的LB瓊脂平板上-在室溫下孵育過夜。
[0215] 20.第二天，計數(shù)包含1μ1細(xì)胞的平板上的菌落-乘以8, 000以確定每8ml細(xì)胞 的總數(shù)（應(yīng)為〇· 5 - 2xl06)。
[0216] 21.從剩余的平板上刮掉細(xì)胞。為此，將5ml的2TY培養(yǎng)基+100μg/ml羧芐青霉 素加入平板，使用一次性塑料分離