用于下調(diào)Bcl-xL和/或Bcl-w的活性和/或量的試劑的制作方法
【專利說(shuō)明】用于下調(diào)Be卜xL和/或Bcl-w的活性和/或量的試劑
[0001] 發(fā)明領(lǐng)域和背景 本發(fā)明，在其一些實(shí)施方案中，涉及通過(guò)下調(diào)編碼Bel-2-家族蛋白和/或p21的基因 而殺死衰老細(xì)胞以治療年齡相關(guān)性障礙的方法。
[0002] 細(xì)胞衰老是細(xì)胞周期停滯的一種穩(wěn)定形式，是限制細(xì)胞增殖潛力的一種機(jī)制。衰 老可以在許多細(xì)胞類型中響應(yīng)于多種細(xì)胞應(yīng)激形式而觸發(fā)。它是腫瘤發(fā)生的有效屏障并促 成某些抗癌藥的細(xì)胞毒性。盡管衰老以細(xì)胞自主方式限制腫瘤發(fā)生和組織損傷，但是衰老 細(xì)胞在其存在部位以細(xì)胞非自主方式誘導(dǎo)炎癥、組織老化、組織破壞并促進(jìn)腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn) 移。因此，將其消除可導(dǎo)致對(duì)腫瘤的預(yù)防和對(duì)組織老化的抑制。的確，在動(dòng)物模型中，衰老 細(xì)胞的消除顯示出減緩組織老化（Baker等人，2011)。
[0003] 生物體可發(fā)展出精細(xì)機(jī)制以消除衰老細(xì)胞，以避免其對(duì)微環(huán)境的有害效應(yīng)。然而， 對(duì)它們?cè)诮M織中的命運(yùn)并未充分表征。一方面，良性黑素細(xì)胞性痣（黑痣）高度富集于衰 老細(xì)胞，但可終生都在皮膚中存在，這意味著衰老細(xì)胞可以被穩(wěn)定地并入組織。另一方面， 先前已經(jīng)顯示出先天免疫系統(tǒng)的組分在體外特異性地識(shí)別和消除衰老細(xì)胞并在體內(nèi)靶向 衰老細(xì)胞，導(dǎo)致腫瘤的衰退和肝纖維化的逆轉(zhuǎn)（Krizhanovsky等人，2008b;Sagiv等人， 2012 ;Xue等人，2007)。因此，衰老細(xì)胞可在體內(nèi)周轉(zhuǎn)（turnover)，免疫系統(tǒng)促進(jìn)這樣的 周轉(zhuǎn)。免疫系統(tǒng)所進(jìn)行的對(duì)衰老細(xì)胞的識(shí)別和消除的努力表明（盡管并非直接地）衰老細(xì) 胞對(duì)生物體是有害的，將其消除是有益的。
[0004] 最近十年間，多項(xiàng)研究鑒定了衰老誘導(dǎo)所需的基因和途徑或衰老表型的旁路。由 p53 (TP53)和pl6INK4a(⑶KN2A)所控制的兩種腫瘤抑制基因途徑，調(diào)節(jié)衰老反應(yīng)。p53 通過(guò)反式激活能抑制增殖的基因而促進(jìn)衰老，而pl6INK4a，連同p53革Elp21 (⑶KN1A) -起， 抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK) 2和4,從而阻止pRB磷酸化和促進(jìn)阻遏性異染色質(zhì)形 成，使增殖相關(guān)基因沉默。
[0005]Bel-2-家族蛋白在細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)中起到重要作用并且能夠調(diào)節(jié)多種細(xì)胞死亡機(jī) 制，其包括細(xì)胞凋亡、壞死和自噬（Cory等人，2003 ;Reed，2008)。對(duì)于該家族的創(chuàng)始成員 Bel-2在衰老中的功能仍然有爭(zhēng)議。已經(jīng)提出其在衰老細(xì)胞中上調(diào)或下調(diào)并且與這些細(xì)胞 的細(xì)胞凋亡的陰性或陽(yáng)性調(diào)節(jié)有關(guān)（Uraoka等人，2011 ;Wang，1995)。除了Bel-2之外， 該家族還包括抗凋亡蛋白Bcl-xL、Bcl-w、Mel-Ι和A1，并且集中研究了該家族作為癌癥的 藥理學(xué)干涉的祀標(biāo)（Azmi等人，2011 ;Zeitlin等人，2008)。
[0006] 美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?0120189539教導(dǎo)了下調(diào)Bcl-xL用于癌癥治療的一種化學(xué)物。
[0007] 美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?0040001811教導(dǎo)了用于癌癥治療的包含靶向Bel-2家族成員的 dsRNA的藥物組合物。
[0008] 美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?0070258952教導(dǎo)了靶向包括Bcl-xL和p-21的多種基因的 siRNA的給予。
[0009] 美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?0110301192教導(dǎo)了用于癌癥治療的下調(diào)p-21的化學(xué)試劑的給 予。
[0010] 發(fā)明概沐 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的一方面，提供了在有需要的受試者中治療炎性或纖維化 疾病的方法，其包括給予所述受試者治療有效量的下調(diào)Bcl-xL和/或Bcl-w的活性和/或 量的試劑，從而治療所述炎性或纖維化疾病，條件是所述炎性疾病不是癌癥。
[0011] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的一方面，提供了制品，其包含： (i) 下調(diào)Bcl-xL和/或Bcl-w的活性和/或量的試劑；和 (ii) 下調(diào)p21的活性和/或量的試劑。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的一方面，提供了藥物組合物，其包含藥學(xué)上可接受 的載體和作為活性劑的： (i) 下調(diào)Bcl-xL和/或Bcl-w的活性和/或量的試劑；和 (ii) 下調(diào)p21的活性和/或量的試劑。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的一方面，提供了下調(diào)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制 劑1 (P21)的活性和/或量的試劑，用于治療炎性或纖維化疾病，其中所述疾病不是癌癥。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的一方面，提供了下調(diào)表達(dá)Bcl-xL的內(nèi)源核酸序列 的多核苷酸試劑和下調(diào)表達(dá)Bcl-w的內(nèi)源核酸序列的多核苷酸試劑，用于治療炎性或纖維 化疾病。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的一方面，提供了組合物，其包含載體和下調(diào)p21的 活性和/或量的至少一種活性劑和下調(diào)Bcl-xL和/或Bcl-w的活性和/或量的至少一種 活性劑，其中所述組合物被配制為供局部給藥用。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的一方面，提供了在有需要的受試者中治療炎性或纖 維化疾病的方法，包括給予所述受試者治療有效量的下調(diào)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑 1 (P21)的活性和/或量的試劑，從而治療所述炎性或纖維化疾病，條件是所述疾病不是癌 癥。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的一方面，提供了在有需要的受試者中治療炎性或纖 維化疾病的方法，其包括給予所述受試者治療有效量的下調(diào)表達(dá)Bcl-xL的內(nèi)源核酸序列 的至少一種多核苷酸試劑和下調(diào)表達(dá)Bcl-w的內(nèi)源核酸序列的至少一種多核苷酸試劑，從 而治療所述炎性或纖維化疾病。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的一方面，提供了在有需要的受試者中治療癌前病變 的方法，其包括給予所述受試者治療有效量的下調(diào)Bcl-xL和/或Bcl-w的活性和/或量的 試劑，從而治療所述癌前病變。
[0019] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的一方面，提供了在有需要的受試者中治療癌前病 變的方法，其包括給予所述受試者治療有效量的下調(diào)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1 (P21)的活性和/或量的試劑，從而治療所述癌前病變。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述試劑是化學(xué)試劑。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述試劑是革E1向Bcl-xL和/或Bcl-W的多核苷酸試 劑。
[0022] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述疾病與軟骨變性相關(guān)。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述疾病選自肝纖維化、傷口愈合、皮膚纖維化、肺 病、骨質(zhì)疏松癥、腎纖維化、前列腺炎、動(dòng)脈粥樣硬化、關(guān)節(jié)炎和胰腺炎。
[0024] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述肺病包括慢性阻塞性肺?。–0PD)。
[0025] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述下調(diào)Bcl-xL和/或Bcl-w的活性和/或量的試 劑被包含在與所述下調(diào)P21的活性和/或量的試劑分開(kāi)的包裝中。
[0026] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述下調(diào)Bcl-xL和/或Bcl-w的活性和/或量的試 劑被包含在與所述下調(diào)P21的活性和/或量的試劑相同的包裝中。
[0027] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述制品進(jìn)一步包含選自以下的至少一種試劑：皮 脂調(diào)節(jié)劑、抗菌和/或抗真菌劑、角質(zhì)軟化劑和/或角質(zhì)調(diào)節(jié)劑、收斂劑、抗炎和/或抗刺激 劑、抗氧化劑和/或自由基清除劑、愈合劑、抗老化劑和保濕劑。
[0028] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述至少一種試劑是抗老化劑。
[0029] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述藥物組合物被配制為供局部遞送。
[0030] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述多核苷酸試劑是siRNA試劑。
[0031] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，下調(diào)Bcl-xL和/或Bcl-w的活性和/或量的至少一 種活性劑是ABT-737或ABT-263。
[0032] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述組合物進(jìn)一步包含選自以下的至少一種試劑： 皮脂調(diào)節(jié)劑、抗菌和/或抗真菌劑、角質(zhì)軟化劑和/或角質(zhì)調(diào)節(jié)劑、收斂劑、抗炎和/或抗刺 激劑、抗氧化劑和/或自由基清除劑、愈合劑、抗老化劑和保濕劑。
[0033] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述至少一種試劑是抗老化劑。
[0034] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述試劑是針對(duì)表達(dá)p21的內(nèi)源核酸序列的多核苷 酸。
[0035] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述多核苷酸試劑是siRNA。
[0036] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述方法進(jìn)一步包括給予所述受試者下調(diào)Bcl-xL 和/或Bcl-w的活性和/或量的至少一種試劑。
[0037] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述至少一種試劑是針對(duì)表達(dá)Bcl-xL和/或Bcl-w 的內(nèi)源核酸序列的多核苷酸。
[0038] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述試劑是針對(duì)Bcl-xL和/或Bcl-w的siRNA。
[0039] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述至少一種試劑是化學(xué)試劑。
[0040]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述化學(xué)試劑選自ABT-737、ABT-263、棉酚、AT-101、 TW-37 和Obatoclax。
[0041] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述疾病與軟骨變性相關(guān)。
[0042] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述疾病選自肝纖維化、傷口愈合、皮膚纖維化、肺 病、腎纖維化、前列腺炎、動(dòng)脈粥樣硬化、關(guān)節(jié)炎和胰腺炎。
[0043] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述試劑被配制為局部組合物。
[0044] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述至少一種多核苷酸試劑包含siRNA。
[0045] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述疾病是癌癥。
[0046] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述疾病選自肝纖維化、傷口愈合、皮膚纖維化、肺 病、腎纖維化、前列腺炎、動(dòng)脈粥樣硬化、關(guān)節(jié)炎和胰腺炎。
[0047] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述至少一種試劑被配制為局部組合物。
[0048] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，所述方法進(jìn)一步包括給予所述受試者下調(diào)p21的活 性和/或量的試劑。
[0049] 除非另有定義，否則本文使用的所有技術(shù)和/或科學(xué)術(shù)語(yǔ)都具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域 普通技術(shù)人員公知的相同含義。盡管類似于或等同于本文所述的那些的方法與材料可以用 于本發(fā)明實(shí)施方案的實(shí)踐或試驗(yàn)，但是以下描述了示例性的方法和/或材料。在有矛盾時(shí)， 將以本專利說(shuō)明書(shū)包括定義為準(zhǔn)。另外，材料、方法和實(shí)施例僅僅是說(shuō)明性的和無(wú)意作為必 要限制。
[0050]附圖簡(jiǎn)沐 參考附圖和圖像，僅以實(shí)例的方式在本文中描述了本發(fā)明的一些實(shí)施方案?，F(xiàn)將詳細(xì) 地對(duì)附圖的具體提及，強(qiáng)調(diào)以實(shí)例的方式和為了本發(fā)明實(shí)施方案的說(shuō)明性討論的目的而顯 示了細(xì)節(jié)。在這一點(diǎn)上，【附圖說(shuō)明】使本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚本發(fā)明的實(shí)施方案可以如何實(shí)踐。
[0051] 在附圖中： 圖1A-C說(shuō)明了在衰老細(xì)胞中Bcl-w和Bcl-xL蛋白的升高的表達(dá)。（A)對(duì)應(yīng)于以下細(xì) 胞的細(xì)胞裂解物（頂1?-90和MEF)的免疫印跡：經(jīng)溶媒處理的生長(zhǎng)細(xì)胞（G)、經(jīng)依托泊苷處 理以誘導(dǎo)衰老的細(xì)胞（Eto);用空載體（V)或用表達(dá)H-rasv12的逆轉(zhuǎn)錄病毒（H-rasv12)轉(zhuǎn)導(dǎo) 的細(xì)胞。β-微管蛋白用作上樣對(duì)照。（B)對(duì)如A所述處理的頂R-90細(xì)胞進(jìn)行的SA-β-gal 活性染色。（C)在如A所述處理的頂R-90細(xì)胞中的Bcl-2、Bcl-w和Bcl-xL的mRNA水平 的定量RT-PCR分析。數(shù)值是平均值+SEM。
[0052] 圖2A-B說(shuō)明了Bcl-w和Bcl-xL的組合敲減誘導(dǎo)殺死衰老細(xì)胞。（A)經(jīng)依托泊苷 處理的衰老頂R-90細(xì)胞用指定siRNA轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后4天測(cè)定細(xì)胞活力。（B)經(jīng)依托泊苷處 理的衰老細(xì)胞用指定siRNA轉(zhuǎn)染后4天，Bcl-2、Bcl-w和Bcl-xL表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡分析。 β-微管蛋白用作上樣對(duì)照。
[0053] 圖3A-D說(shuō)明了Bcl-w和Bcl-xL的組合敲減誘導(dǎo)衰老細(xì)胞死亡。（Α)經(jīng)依托泊苷 處理的衰老頂R-90細(xì)胞用指定siRNA轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后4天測(cè)定細(xì)胞活力。（B)經(jīng)依托泊苷處 理的衰老頂R-90細(xì)胞用指定siRNA轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后3天細(xì)胞用10μΜABT-199處理24小時(shí) 或用DMS0 (作為對(duì)照）處理。在孵育期結(jié)束時(shí)測(cè)定細(xì)胞成活力。（C)頂R-90或MEF經(jīng)溶 媒處理的生長(zhǎng)細(xì)胞（G)、衰老的經(jīng)依托泊苷處理的細(xì)胞（Ε)、用空載體（V)或用表達(dá)H-rasV12 的逆轉(zhuǎn)錄病毒（H_rasV12)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞，用ABT-199處理24小時(shí)。在孵育期結(jié)束時(shí)測(cè)定細(xì)胞 成活力。對(duì)Bcl-2抑制敏感的SH-SY5Y細(xì)胞用作處理的陽(yáng)性對(duì)照。
[0054] 圖4A-B說(shuō)明了BH3模擬ABT-737在衰老細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。頂R-90 (圖4A)或 MEF(圖4B)生長(zhǎng)細(xì)胞（G)、經(jīng)依托泊苷處理的細(xì)胞（Eto)、用空載體（V)或用表達(dá)H-rasV12 的逆轉(zhuǎn)錄病毒（H_rasV12)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞用指定劑量的ABT-737或用DMS0 (作為對(duì)照）處理24 小時(shí)。在孵育期結(jié)束時(shí)測(cè)定細(xì)胞成活力。
[0055] 圖5A-B說(shuō)明了頂R-90生長(zhǎng)細(xì)胞（G)、經(jīng)依托泊苷處理的細(xì)胞（Eto)或用表達(dá) H-rasv12的逆轉(zhuǎn)錄病毒（Ras)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞，在z-VAD-fmk存在或不存在時(shí)用ABT-737或 DMS0(作為對(duì)照）處理24小時(shí)。（A)在孵育期結(jié)束時(shí)測(cè)定細(xì)胞成活力。（B)對(duì)應(yīng)于以下細(xì) 胞的細(xì)胞裂解物的免疫印跡：在如所示的DMS0、ABT-737或ABT-737加上z-VAD-fmk存在時(shí) 的生長(zhǎng)細(xì)胞（G)、經(jīng)依托泊苷處理的細(xì)胞（Eto)或用表達(dá)H-rasv12的逆轉(zhuǎn)錄病毒（Ras)轉(zhuǎn)導(dǎo) 的細(xì)胞。微管蛋白用作上樣對(duì)照。
[0056] 圖6Α-Ε說(shuō)明了p21影響衰老細(xì)胞的成活力。（A-D)生長(zhǎng)（G)和經(jīng)依托泊苷（Eto) 處理的原代人（MR-90，BJ)和小鼠（MEF)成纖維細(xì)胞以及人肺癌細(xì)胞（H1299)用針對(duì)p21 的siRNA或?qū)φ誷iRNA轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后4天（A-D)或在指定時(shí)間點(diǎn)（E)測(cè)定細(xì)胞成活力。
[0057] 圖7A-C說(shuō)明了p21以p53和pRB非依賴性方式維持衰老細(xì)胞成活力。㈧在BJ 生長(zhǎng)細(xì)胞（G)和經(jīng)依托泊苷處理的BJ細(xì)胞（Eto)用針對(duì)p21的siRNA或?qū)φ誷iRNA轉(zhuǎn)染 后4天的指定蛋白的蛋白質(zhì)印跡分析。β-微管蛋白用作上樣對(duì)照。（B-C)經(jīng)依托泊苷處 理的BJ細(xì)胞用指定siRNA轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后4天測(cè)定細(xì)胞成活力。在同一時(shí)間，收集細(xì)胞裂解 物并通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析，證實(shí)指定蛋白的有效敲減。
[0058] 圖8是圖，說(shuō)明了對(duì)胱天蛋白酶活性的抑制部分地營(yíng)救了衰老細(xì)胞免于細(xì)胞凋 亡。經(jīng)依托泊苷處理的BJ細(xì)胞用sip21或?qū)φ誷iRNA轉(zhuǎn)染。在z-VAD-fmk(每天補(bǔ)充） 存在或不存在時(shí)將細(xì)胞孵育4天。在孵育期結(jié)束時(shí)測(cè)定細(xì)胞成活力。
[0059] 圖9A-E說(shuō)明了作為對(duì)p21敲減的響應(yīng)，E2F靶和炎癥基因被上調(diào)。生長(zhǎng)（G)和經(jīng) 依托泊苷（Eto)處理的BJ細(xì)胞的指定基因的mRNA水平的定量RT-PCR分析。GAPDHmRNA 用作參考。數(shù)據(jù)表示為3次獨(dú)立的RT-PCR分析的平均值+SEM。
[0060] 圖10是照片，說(shuō)明了在p21敲除小鼠中同時(shí)減少了衰老細(xì)胞和纖維化瘢痕的存 在。野生型和P21-/-(敲除）小鼠經(jīng)歷6周CC14處理以誘導(dǎo)纖維化。處理后對(duì)肝通過(guò)針對(duì) 衰老細(xì)胞的存在情況的SA-β-gal和通過(guò)針對(duì)纖維化瘢痕形成的天狼星紅（SiriusRed) 染色進(jìn)行評(píng)價(jià)。
[0061] 本發(fā)明的具體實(shí)施方案的描沐 本發(fā)明，在其一些實(shí)施方案中，涉及通過(guò)下調(diào)編碼Bcl-2-家族蛋白和/或p21的基因 而殺死衰老細(xì)胞用于治療年齡相關(guān)性障礙的方法。
[0062] 在詳細(xì)解釋本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施方案之前，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明不一定將其應(yīng)用 限制在以下說(shuō)明中給出的或通過(guò)實(shí)施例舉例說(shuō)明的細(xì)節(jié)上。本發(fā)明能夠具有其它實(shí)施方案 或以不同方式被實(shí)踐或?qū)嵤?br>[0063] 衰老細(xì)胞可以在皮膚、肝、肺、胰腺、前列腺的纖維化或炎性疾病中以及關(guān)節(jié)軟骨、 動(dòng)脈粥樣硬化斑塊和其它年齡相關(guān)性疾病中找到。此外，衰老細(xì)胞顯示出在正常組織、尤其 是皮膚中隨年齡增長(zhǎng)而積累并表明促進(jìn)組織老化。因此，消除衰老細(xì)胞可顯著地延遲許多 組織的老化并治療其中存在衰老細(xì)胞的病理狀況。
[0064] 本發(fā)明人已經(jīng)表明，通過(guò)siRNA(圖2A-B和3A-B)或通過(guò)Bcl-2家族的特異性抑 制劑（ABT-737 ;圖4A-B和5A-B)對(duì)Bcl-xL和Bcl-w的組合抑制導(dǎo)致衰老細(xì)胞的特異性消 除。對(duì)Bcl-2本身的抑制不能執(zhí)行這項(xiàng)任務(wù)（圖3C-D)。因此，本發(fā)明人提出對(duì)Bcl-xL和 Bcl-w的組合抑制允許衰老細(xì)胞的特異性消除并可用于治療其中存在衰老細(xì)胞的疾病。 [0065] 令人驚奇的是，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，對(duì)衰老細(xì)胞的相同效應(yīng)可以通過(guò)降低p21表 達(dá)而實(shí)現(xiàn)（圖6A-E和7A-C)，p21是通常與衰老的發(fā)作（作為⑶K4和⑶K2的抑制劑）和 腫瘤抑制相關(guān)的一種蛋白。盡管在生長(zhǎng)細(xì)胞中的P21敲減對(duì)細(xì)胞成活力沒(méi)有有害效應(yīng)，但 在衰老細(xì)胞中對(duì)P21敲減導(dǎo)致頂R-90、BJ、H1299和MEF細(xì)胞的細(xì)胞成活力分別下降30%、 50%、75%和30%(圖6A)。因此，本發(fā)明人提出p21對(duì)于維持衰老細(xì)胞成活力而言是必要的。 [0066] 正如根據(jù)p21作為RB蛋白磷酸化抑制劑的功能所料的，注意到在響應(yīng)p21敲減 時(shí)，E2F介導(dǎo)的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)相關(guān)的基因（例如，細(xì)胞周期蛋白-A2和CDK-1)的mRNA水平 顯著增加（圖9)。另外，出乎意料的是，發(fā)現(xiàn)了p21敲減導(dǎo)致IL-8和IL-1βmRNA水平增 加，指向衰老細(xì)胞生物相關(guān)的炎性反應(yīng)。因此，本發(fā)明人推斷p21敲減在衰老細(xì)胞中誘導(dǎo)促 炎反應(yīng)和細(xì)胞死亡。這可導(dǎo)致其治療潛力增加，因?yàn)檠仔约?xì)胞因子將會(huì)募集免疫系統(tǒng)，以殺 死通過(guò)敲減本身未能消除的細(xì)胞。
[0067] 因此，本發(fā)明人提出，由下調(diào)Bcl-xL和Bcl-w的試劑在衰老細(xì)胞中對(duì)細(xì)胞凋亡的 直接誘導(dǎo)（其導(dǎo)致細(xì)胞死亡的誘導(dǎo)）連同由P21敲減所誘導(dǎo)的促炎反應(yīng)的組合應(yīng)在從癌前 病變、損傷的和老化的組織中有效地消除衰老細(xì)胞方面達(dá)到極點(diǎn)。這將對(duì)其中存在著衰老 細(xì)胞的各種各樣的病癥提供重要的治療影響。
[0068] 因此，根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供了在有需要的受試者中治療炎性或纖維化疾病 的方法，其包括給予所述受試者治療有效量的下調(diào)Bcl-xL和/或Bcl-w和/或p21的活性 和/或量的試劑。
[0069] 術(shù)語(yǔ)"Bcl-xL"是指具有SEQIDN0: 21所示的序列的人蛋白（也稱為B-細(xì)胞淋 巴瘤-超大）及其同源物和直向同源物。人Bcl-xL的cDNA序列如SEQIDN0: 22所示。
[0070] 術(shù)語(yǔ)"Bcl-W"是指具有SEQIDNO: 23所示的序列的人蛋白（也稱為Bcl-2-樣 蛋白2)及其同源物和直向同源物。人Bcl-w的cDNA序列如SEQIDN0: 24所示。
[0071] 術(shù)語(yǔ)"p21"也稱為"細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1"是指具有SEQIDNO: 25 所示的序列的人蛋白及其同源物和直向同源物。人p21的cDNA序列如SEQIDNO: 26所 不。
[0072] 根據(jù)具體的實(shí)施方案，所述方法包括下調(diào)Bcl-xL和Bcl-w。
[0073] 根據(jù)另一實(shí)施方案，所述方法包括下調(diào)Bcl-xL、Bcl-w和p21的每一種。
[0074] 根據(jù)再一實(shí)施方案，所述方法包括下調(diào)p-21和下調(diào)Bcl-xL。
[0075] 根據(jù)再一實(shí)施方案，所述方法包括下調(diào)p-21和下調(diào)Bcl-w。
[0076] 本文使用的短語(yǔ)"下調(diào)（靶蛋白）的活性和/或量"是指下調(diào)至少10%、至少20%、 至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或甚至至少90%。另外，術(shù)語(yǔ)"下 調(diào)"也可指完全抑制。
[0077] 使用化學(xué)試劑可實(shí)現(xiàn)對(duì)Bcl-xL和/或Bcl-w和/或p21的下調(diào)。已知能降低 Bcl-xL和/或Bcl-w的活性的化學(xué)試劑包括ABT-737、ABT-263、棉酚、AT-101、TW-37和 0batoclax〇
[0078] 根據(jù)具體的實(shí)施方案，所述試劑是ABT-737或ABT-263。
[0079]ABT-737 和ABT-263 (ABT-263 是生物可利用形式，稱為 "Novatoclax"，Abbot) 目前處于用于多發(fā)性骨髓瘤、淋巴瘤、急性白血病、CLL、小細(xì)胞肺癌的II期。
[0080] 棉酚（天然的）用于頭頸部腫瘤、胰腺癌的II/III期。
[0081] AT-101 (棉酸衍生物；AscentaTherapeutics)用于胰腺癌、頭頸部癌癥、膠質(zhì)瘤 的Π/ΙΙΙ期。
[0082] TW-37(UniMichigan)用于胰腺癌、淋巴瘤的II期。
[0083] Obatoclax(GX15-070MS;GeminX，稍后稱為Cephalon,現(xiàn)在稱為T(mén)eva)用于骨 髓瘤、骨髓纖維化和套細(xì)胞淋巴瘤的II期。
[0084] 下調(diào)p21活性的化學(xué)試劑的實(shí)例公開(kāi)于美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?0110301192,通過(guò)引用 結(jié)合到本文中。
[0085] 使用干擾轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的各種分子（例如，RNA沉默劑、核酶、DNA核酶和反義 物），也可在基因組和/或轉(zhuǎn)錄本水平上實(shí)現(xiàn)Bcl-xL和/或Bcl-w和/或p21的下調(diào)，或者 使用例如拮抗劑、切割多肽的酶等，也可在蛋白質(zhì)水平上實(shí)現(xiàn)Bcl-xL和/或Bcl-w和/或 p21的下調(diào)。
[0086] 以下是能夠下調(diào)Bcl-xL和/或Bcl-w和/或p21的表達(dá)水平和/或活性的試劑 列表。
[0087] 能夠下調(diào)Bcl-xL和/或Bcl-w和/或p21的試劑的一個(gè)實(shí)例是能夠與之特異性 結(jié)合的抗體或抗體片段。優(yōu)選地，所述抗體能夠被細(xì)胞內(nèi)在化。
[0088] 本發(fā)明使用的術(shù)語(yǔ)"抗體"包括完整分子及其功能