用于治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的含有低濃度唾液酸的重組人紅細(xì)胞生成素的鼻用制劑的制作方法
【專利說明】用于治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的含有低濃度唾液酸的重組人紅 細(xì)胞生成素的鼻用制劑
[00011 本申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)枮?00680034781.X、申請(qǐng)日為2006年7月27日、發(fā)明名稱為"用于 治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的含有低濃度唾液酸的重組人紅細(xì)胞生成素的鼻用制劑"的發(fā)明專 利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及生物制藥工業(yè)，特別涉及含有低含量(堿性)唾液酸的rhEPO鼻內(nèi)藥物 的制備，其通過遺傳工程開始于中國倉鼠卵巢細(xì)胞，用于治療腦血管、神經(jīng)變性和精神病學(xué) 疾病。
【背景技術(shù)】
[0003] 促紅細(xì)胞生成素(EPO)是一種糖蛋白激素，其分子量在34kDa范圍內(nèi)；該蛋白質(zhì)部 分由大約166個(gè)氨基酸組成;它產(chǎn)生于腎、肝臟和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞中，并且它參與紅細(xì) 胞和其它造血細(xì)胞的增殖、分化和成熟。
[0004] 1998年，Sakanaka和合作者報(bào)告了在沙土鼠的頸總動(dòng)脈阻塞(一個(gè)全球性的缺血 模型），接著將rhEPO注入側(cè)腦室后，rhEPO對(duì)抗體內(nèi)缺血損傷的神經(jīng)元保護(hù)特性。那些作者 觀察到對(duì)CA 1海馬神經(jīng)元的缺血性損傷的減少。
[0005] rhEPO的神經(jīng)元保護(hù)作用可能歸于不同的因素，包括：拮抗谷氨酸誘導(dǎo)的細(xì)胞毒 性、增加抗氧化性酶的表達(dá)、減少自由基介導(dǎo)的一氧化氮(NO)的形成、使腦血流正常化、影 響神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、促進(jìn)新血管發(fā)生、抑制興奮性毒素或一氧化氮誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡、增加抗 細(xì)胞凋亡基因的表達(dá)、神經(jīng)營養(yǎng)作用、降低神經(jīng)元興奮性、腦抗炎作用、抑制kainato誘導(dǎo)的 細(xì)胞凋亡和促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生、血管原性和神經(jīng)原性作用。此外，rhEPO有助于缺血預(yù) 調(diào)節(jié)。整體而言，這些原因可以證明rhEPO在治療腦血管、神經(jīng)變性、精神病學(xué)疾病中的應(yīng) 用。
[0006] rhEPO的神經(jīng)元保護(hù)特性能預(yù)防神經(jīng)元死亡或使神經(jīng)元死亡復(fù)原，神經(jīng)元死亡成 為許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，例如缺血、神經(jīng)性創(chuàng)傷和神經(jīng)變性和神經(jīng)元炎性疾病的特征性 事件。
[0007] 還描述了神經(jīng)變性過程促使觸發(fā)精神分裂癥的生理病理學(xué)。這就是為什么神經(jīng)元 保護(hù)性藥物可以是治療該疾病的有效替代治療。
[0008] -旦將生物暴露于某些病理學(xué)條件，例如低血糖癥或強(qiáng)烈的神經(jīng)元去極化，或由 于線粒體產(chǎn)生氧一反應(yīng)性物種，rhEPO的表達(dá)顯著增加。
[0009] 另一方面，炎癥過程通過不同的機(jī)理增加腦損傷，并且它們甚至直接局部抑制EPO 的產(chǎn)生。事實(shí)上，即使在腦缺血后內(nèi)源性產(chǎn)生rhEPO,其表達(dá)也顯著地受到炎性細(xì)胞因子的 抑制。該抑制降低了 rhEPO的神經(jīng)元保護(hù)能力并證明了 rhEPO的外源性施用對(duì)腦血管、神經(jīng) 變性或精神病學(xué)疾病特別有益。
[0010] 此外，眾所周知，rhEPO分子對(duì)其受體(receiver)的親和力（并且，因此，對(duì)該分子 的生理學(xué)反應(yīng)的有效性)與和它結(jié)合的唾液酸百分比反相關(guān)。
[0011] 通過靜脈內(nèi)途徑對(duì)腦缺血的鼠模型施用，rhEPO的神經(jīng)元保護(hù)作用[LM Brines and cols,PNAS97( 19) :10526-10531,2000]減少了由缺血引起的損傷50%到75%，并且在 人類中產(chǎn)生類似的效果(W0 0354475)。然而，使用酸性重組人促紅細(xì)胞生成素(rhEPO)的臨 床和實(shí)驗(yàn)結(jié)果還沒有評(píng)估使用該分子對(duì)誘導(dǎo)紅細(xì)胞生成的潛在負(fù)性中期影響，因?yàn)橐阎?腦屏障（BBB)的低滲透性和CNS中rhEPO受體的低親和性，為了相對(duì)長時(shí)間獲得有效的藥理 學(xué)效果，需要相對(duì)大量的rhEPO。在這些條件下，人們冒增加血液粘度和增加溶血栓事件(其 導(dǎo)致大腦缺血）的可能性的風(fēng)險(xiǎn)。已經(jīng)報(bào)道了應(yīng)用酸性rhEPO的這些負(fù)性結(jié)果是用該分子治 療的腎炎患者中的并發(fā)癥。
[0012] 為了開發(fā)出增加 BBB滲透性(其被認(rèn)為是將物質(zhì)結(jié)合至腦組織中的關(guān)鍵步驟)的方 法，已經(jīng)進(jìn)行了研究（US 5260308;TO 8901343;US 4801575;US 5442043;JP 57146710和JP 01149718)。這些方法中的許多方法包括形成肽的綴合物的所謂的載體(US 5442043)，或它 們使用嵌合肽(US 48015575)來將物質(zhì)結(jié)合到腦。已經(jīng)報(bào)道過包含促紅細(xì)胞生成素的脂質(zhì) 體的制劑（JP 08231417)。已報(bào)道了關(guān)于神經(jīng)節(jié)苷脂的使用鼻內(nèi)途徑使分子達(dá)到CNS(US 4639437)，以及關(guān)于神經(jīng)元治療藥通過鼻粘膜對(duì)它們的吸收并隨后通過神經(jīng)嗅覺途徑將它 們輸送到達(dá)腦(EP 504263)。
[0013] 存在幾個(gè)涉及rhEPO液體制劑保護(hù)的專利，下面列出其中最具有代表性的專利： [0014]液體制劑，其中使用的有效成分是rhEPO并且其中在任何情況下，蛋白質(zhì)以可注射 的形式提供（例如：CIP0-2041989;CIP0-2353553)。這種給藥方式表明使用的rhEPO為酸類 型，就是說，超過40%的分子為唾液酸所覆蓋，否則它將被肝臟酶滅活，并且它在臨床上不 會(huì)有效。
[0015] 專利CIP0-2074820使用鼻內(nèi)途徑來施用蛋白質(zhì)。在該情況下，環(huán)糊精用作制劑的 成分，并且同樣追求rhEPO的全身性吸收，以至于蛋白質(zhì)也是酸性的。
[0016] 存在涉及使用生物粘附劑增加蛋白質(zhì)在鼻腔內(nèi)的停留時(shí)間的科學(xué)出版物 Polireddy D和cols，[International Journal of Pharmaceutics(127):115-133,1996]； 然而，沒有關(guān)于在含有rhEPO的制劑中使用生物粘附劑的報(bào)道。
[0017] 專利CIP0-2353553證明了外源性施用rhEPO用于治療大腦缺血，但與以前的情況 完全一樣，該研究是蛋白質(zhì)直接或者間有效地進(jìn)入血流以便有效，以至于我們同樣地在存 在含有高含量唾液酸的rhEPO。
[0018] 專利CIP0-2408685覆蓋了rhEPO的不同制劑，但在這種情況下，打算讓它們用于治 療貧血，所以它是酸性rhEPO,因?yàn)閴A性rhEPO不能促進(jìn)紅細(xì)胞的增殖、分化和成熟。
[0019] 專利CIP0-2437333詳細(xì)說明了保護(hù)的制劑是起源于α促紅細(xì)胞生成素，也就是起 源于酸性rhEPO。
[0020] 在以前披露和文獻(xiàn)中修訂的所有情況中，提到的是酸性rhEPO,而我們正在申請(qǐng)的 專利打算保護(hù)起源于堿性rhEPO的液體制劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0021 ]在rhEPO的生產(chǎn)過程中，獲得有不同含量唾液酸的糖蛋白。小于40%的其分子被 (堿性)唾液酸保護(hù)的蛋白質(zhì)正常被清除，因?yàn)樗ㄟ^全身途徑而不具有生物學(xué)活性。含有 低含量唾液酸的這種堿性rhEPO代表了全部產(chǎn)生的rhEPO的70%。令人意外地是，我們已發(fā) 現(xiàn)鼻內(nèi)施用堿性rhEPO能夠比酸性rhEPO具有更高的治療價(jià)值;本發(fā)明的結(jié)果使得能利用 rhEPO的堿性同工型，其當(dāng)時(shí)沒有被回收而且容易獲得。這代表了很大的經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢(shì)，因?yàn)樗?允許回收在當(dāng)時(shí)組成rhEPO生產(chǎn)的廢物。
[0022]在初級(jí)衛(wèi)生保健系統(tǒng)水平，在能走的基礎(chǔ)上，該制劑可以用來治療和/或預(yù)防中樞 神經(jīng)系統(tǒng)疾病，包括腦血管，神經(jīng)變性和精神疾病。建議的溶液的優(yōu)勢(shì)包括使用具有低含量 唾液酸的rhEPO用于允許在較小劑量下有更大保護(hù)作用的治療目標(biāo)。實(shí)現(xiàn)了治療藥快速到 達(dá)作用部位，而這對(duì)在存在腦缺氧的情況下，獲得滿意的治療效果是關(guān)鍵的。在腦血管疾病 的特殊情況下，在級(jí)聯(lián)缺血的一些過程發(fā)生之前，在急性期從治療干預(yù)開始是必要的。這稱 為治療窗口期。
[0023]鼻內(nèi)施用堿性rhEPO消除了誘導(dǎo)紅細(xì)胞生成的危險(xiǎn)。紅細(xì)胞濃度的增加將增加血 液粘度，從而使阻塞或出血事件后再灌注危險(xiǎn)，以至于腦血流將減少并因此將阻礙氧和養(yǎng) 分到達(dá)腦組織。
[0024] 鼻內(nèi)途徑比其它施用形式有更大的優(yōu)勢(shì)，允許快速到達(dá)腦；它比靜脈內(nèi)或腦室內(nèi) 途徑的侵入性更小，并且一定百分比的rhEPO能到達(dá)腦脊液而不必首先傳到血流，這避免首 過肝臟步驟代謝，從而防止了它隨后失活。鼻內(nèi)應(yīng)用不是創(chuàng)傷性的并且消除了外科手術(shù)危 險(xiǎn)和其它由創(chuàng)傷性途徑產(chǎn)生的可能并發(fā)癥。它構(gòu)成了在不損害BBB的條件下到達(dá)腦的可替 代性途徑。使用血管途徑的可替代性的施用途徑保證了分子經(jīng)通過組織液的擴(kuò)散，到達(dá)中 樞神經(jīng)系統(tǒng)的很少或無血液灌注的區(qū)域。
[0025] 考慮到鼻內(nèi)施用的主要限制之一是快速纖毛-誘導(dǎo)的粘液清除，本發(fā)明采取了使 用生物粘附性聚合物的策略，該生物粘附性聚合物增加了rhEPO在鼻腔內(nèi)的停留時(shí)間。在制 劑的開發(fā)過程中，為了獲得具有物理、化學(xué)和微生物學(xué)穩(wěn)定性(該穩(wěn)定性自始至終保持其治 療特性）的制劑，也混合了其它的輔助性物質(zhì)或賦形劑，例如防腐劑、張力活性劑、pH調(diào)節(jié) 劑、等滲劑和蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑，所述自始至終保持其治療特性。
[0026] 使用的rhEPO在其分子中包含小于40%的唾液酸(就是堿性rhEPO)，其濃度在0.5 到2mg/mL的范圍內(nèi)。因此，提供的制劑為液體、無色、透明制劑，無機(jī)械雜質(zhì)，表觀粘度在10 至lj250mPas的范圍內(nèi)。使用了濃度0.4到0.9%的羥丙基甲基纖維素(HPMC)，0.2到0.8 %的羥 丙基纖維素(HPC)，0.25到0.5%的甲基纖維素(MC)作為生物粘附性聚合物。
[0027]主要