使用濃度從20到100mM/L的磷酸鹽和檸檬酸鹽緩沖液將pH值調(diào)節(jié)到6.0到7.5 的范圍。
[0028] 滲透壓可以用不同的等滲劑，除了其它的以外，例如氯化鈉、甘露醇、山梨醇、葡萄 糖調(diào)節(jié)，濃度范圍為0.05到10g/L。
[0029] 使用的防腐劑是:濃度從0.01到0.02 %的苯扎氯銨聯(lián)合濃度為0.01 %的乙二胺四 乙酸二鈉、〇 . 3到0.5 %的三氯叔丁醇、0.02到0.035 %的對(duì)羥基苯甲酸甲酯和從0.01到 0.02 %的對(duì)羥苯甲酸丙酯。
[0030] 為了避免蛋白質(zhì)粘附到容器壁上，使用了非離子型表面活性劑，例如濃度范圍從 0.01到lg/L的月桂酸聚乙稀山梨坦（吐溫20到80)、cremophor RH 40、三油酸山梨坦（司盤 35到80)。
[0031 ]使用不同的氨基酸作為蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑，尤其是:L-色氨酸、L-亮氨酸、鹽酸L-精氨 酸和鹽酸L-組氨酸，濃度在0.1和lOmg/mL的范圍之間。在所有情況下使用的溶劑是注射用 水。
[0032]在大鼠中進(jìn)行鼻粘膜的刺激性試驗(yàn)，并且在該水平?jīng)]有發(fā)現(xiàn)刺激的指征。這與該 產(chǎn)物的優(yōu)良耐受性一起為在人類中使用堿性rhEPO提供了毒理學(xué)的驗(yàn)證。
[0033]穩(wěn)定性研究顯示，蛋白質(zhì)濃度與時(shí)間的適當(dāng)行為。應(yīng)用羅氏（Lowry)蛋白質(zhì)含量測(cè) 定法（±10%)時(shí)，建立了位于限度內(nèi)的pH。
【附圖說(shuō)明】
[0034] 圖1.酸性和堿性促紅細(xì)胞生成素對(duì)PC12細(xì)胞的培養(yǎng)物中GST的酶活性的作用。該 圖顯示神經(jīng)起源的細(xì)胞如何通過(guò)改變GST酶的活性而對(duì)存在的rhEPO起反應(yīng)。該圖中的值代 表了各自三個(gè)獨(dú)立培養(yǎng)物的平均值。
[0035] 圖2.蒙古沙土鼠的腦缺血模型中，對(duì)兩性死亡率的作用。
[0036]圖3.在圓筒中蒙古沙土鼠的運(yùn)動(dòng)-功能性活動(dòng)。
[0037]圖4.損傷后24小時(shí)，動(dòng)物的神經(jīng)學(xué)狀態(tài)。
[0038]圖5.在單側(cè)腦缺血后5周期間，鼻內(nèi)施用rhEPO對(duì)治療動(dòng)物體重的作用。
[0039] 圖6. a和b. rhEPO對(duì)腦水腫的作用。
[0040]圖7.在沙土鼠的海馬CAl扇形面中損傷的組織病理學(xué)得分。
[0041]圖8.缺血損傷后沙土鼠海馬的顯微照片，未治療(A)和通過(guò)鼻內(nèi)施用rhEPO治療 (B)。觀察在治療的動(dòng)物中CAl扇形面的完整性。
[0042]圖9.酸性和堿性促紅細(xì)胞生成素對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織中脂質(zhì)（Iipodic)過(guò)氧化的 保護(hù)作用。該圖顯示具有低含量唾液酸的重組人促紅細(xì)胞生成素如何減少了研究的大鼠腦 中三個(gè)區(qū)域的勻漿中MDA+4HDA的產(chǎn)生13% (0-23%)。該減少依賴于使用的劑量。在海馬和 小腦中觀察到保護(hù)的最高水平，其中已經(jīng)檢測(cè)到相當(dāng)水平的rhEPO受體。
[0043]圖10.對(duì)用rhEPO治療組三個(gè)樣品分析的血液學(xué)變量平均值行為，與第一次抽樣的 正常范圍X±2SD有關(guān)。
[0044]圖11.具有低含量唾液酸的重組人促紅細(xì)胞生成素從鼻腔傳遞到嗅球和小腦。圖 中每一條代表了六只動(dòng)物的平均值。該圖顯示具有低含量唾液酸的重組人促紅細(xì)胞生成素 如何在至少5分鐘內(nèi)到達(dá)腦區(qū)域，并隨時(shí)間從腦的前面到尾側(cè)區(qū)域逐漸減少。從應(yīng)用起60分 鐘，仍有一些rhEPO在嗅球和小腦區(qū)域。從應(yīng)用5分鐘，80到8 5 %之間的到達(dá)腦的rhEPO在嗅 球被檢測(cè)到，而接近20 %的在小腦被檢測(cè)到。大約30分鐘后，這些濃度幾乎相等，并且60分 鐘后小腦有30 %放射活性，并且嗅球只有10 %。
【具體實(shí)施方式】 [0045] 工作實(shí)施例 [0046] 實(shí)施例1
[0047] 具有低含量唾液酸的rhEPO的純化
[0048]為了獲得唾液酸含量小于40 %的堿性促紅細(xì)胞生成素，進(jìn)行了三個(gè)基本色譜法步 驟，從非常復(fù)雜和有大量污染蛋白質(zhì)的材料開(kāi)始，因?yàn)樵摬牧虾?%胎牛血清。然后進(jìn)行 附加步驟以獲得目標(biāo)同工型。
[0049] 為了堿性rhEPO的滲濾和濃縮，使用了實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的超濾系統(tǒng)（SART0FL0W SLICE 200)，其與懦動(dòng)栗（IP55Watson_Marlow)連接。使用IOkDa的Hydrosart膜。該工作以1.9土 0.251111711^11流速、推進(jìn)壓力（？1)2.9±0.25匕3^保留級(jí)分壓力（？2)0.65±0.讓33口跨膜 (TM)壓力1.8±0.2bar進(jìn)行。為了測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，在λ = 280ηηι使用Ultrospec TM 3100分 光光度計(jì)。對(duì)滲濾過(guò)程，使用pH 6.0和電導(dǎo)率3.25ms/cm的NaH2PO4和Na2HPO 4的鼻內(nèi)緩沖溶 液。pH值通過(guò)使用Sartorius pH計(jì)和Omega電導(dǎo)儀進(jìn)行控制。發(fā)現(xiàn)該過(guò)程的收率在75-95 % 的范圍內(nèi)。
[0050] 表1顯示該過(guò)程的結(jié)果
[0052] 實(shí)施例2
[0053]含有低含量唾液酸的rhEPO鼻用制劑，其使用HPMC作為生物粘附性聚合物、鹽酸組 氨酸作為穩(wěn)定劑、吐溫80作為非離子型表面活性劑和苯扎氯銨作為防腐劑。
[0054]制備方法：
[0055] 該溶液的制備從體積占制劑總體積30%的注射用水開(kāi)始。該體積用于溶解防腐 劑、緩沖劑和等滲劑。除此之外，在適當(dāng)容量的容器中，放入體積等于制劑總體積的15%的 注射用水，并加溫至溫度為85到95°C，并且在劇烈的不斷的攪拌下分散聚合物。一旦聚合物 被濕潤(rùn)，將先前制備的溶液摻入其中，同時(shí)劇烈搖動(dòng)直到全部勻化。然后為了摻入相應(yīng)量的 堿性rhEPO、非離子型表面活性劑和蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑，減少搖動(dòng)。最后，用注射用水將體積加到 制劑最終體積的100%。隨后通過(guò)0.2微米的乙酸纖維素膜將該制劑過(guò)濾，并且測(cè)試pH以驗(yàn) 證其保持在確定的范圍內(nèi)。
[0056] 制成的制劑的組成如下： 組分 比例 堿性 rhEPO 0 J mg/mL
[0057] 幾丙基甲基纖維素 5.0 mg/mL 鹽酸組氣酸 1.0 mg/mL 鱗酸二氫.鈉 . 2 mg/mL 鱗酸氣二鈉 0.7 mg./m.L 吐溫.80: 0.25 uig/mL 氯化鈉 7.4 mg/mL
[0058] 乙二胺四乙酸二傭 0.1 mg./mL 苯扎氯按 〇;·2 mg./m.L 注射用水 足量I ml
[0059] 實(shí)施例3
[0060] 具有低含量唾液酸的rhEPO鼻用制劑，其與前面的實(shí)施例相似，但使用甲基纖維素 作為生物粘附性聚合物
[0061] 制備方法:與實(shí)施例2相似。
[0062] 制成的制劑的組成如下： 組分 此例 .減性 rh.EPO 0.8 mg/mL 甲基纖維素 3.0 mg/mL 鹽酸組氣酸 1.0 mg/mL 磷酸二氫鈉 2 mg/mL
[0063] 磷酸氫二鈉 0.7 mg/mL 吐溫 8:0: 0.25 mg/mL 氯化納 7.4 mg/mL 乙二胺四乙:酸二納 0.1 mg/mL 苯扎氯倭 0.2 mg/mL 注射用水 足量I ml
[0064] 實(shí)施例4
[0065]具有低含量唾液酸的rhEPO鼻用制劑，其與實(shí)施例2相似，但使用吐溫20作為非離 子型表面活性劑。
[0066]制備方法:與實(shí)施例2相似。
[0067]制成的制劑的組成如下： 組分 比例 減性 rhEPO 0.8 mg/mL 羥丙基甲基纖維素 5.0 mg/mL 益酸組氣酸 1.0 mg/mL 嶙酸二氫鈉 2 mg/mL
[0068] 鱗酸氫二鈉 0.7 mg/mL 珠溢 20 0.20 mg/mL 氣化鈉 7.4 mg/mL 乙二胺四乙酸二納 0.1 mg/mL 苯扎氯按 0.2 mg/mL 注射用水 足量I ml
[0069] 實(shí)施例5
[0070] 具有低含量唾液酸的rhEPO鼻用制劑，其與前面的實(shí)施例相似，但有1.2mg/ml的有 效成分并且不含鹽酸組氨酸作為蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑。
[0071] 制備方法:與實(shí)施例2相似，但不使用鹽酸組氨酸。
[0072]制成的制劑的組成如下： 組分 此例 滅性 rhEPO 1.2 mg/mL 難丙基甲基纖維素 5.0 mg/mL 鱗酸二氫鈉 2 mg/mL
[0073] 止▲ # 磷酸氫二鈉 0.7 mg/mL 吐溫 20 0.20 mg/mL 氣化鈉 7.7 mg/mL 乙二胺四乙酸二鈉 0.1 mg/mL 苯扎氯按 0,2 mg/mL
[0074] ^ 注射用水 c.s:p I ml.
[0075] 實(shí)施例6
[0076] 具有低含量唾液酸的rhEPO鼻用制劑，其與實(shí)施例2相似，但有1.2mg/ml的有效成 分并且不含鹽酸組氨酸作為蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑。
[0077] 制備方法:與實(shí)施例2相似，但是沒(méi)有使用鹽酸組氨酸。
[0078]制成的制劑的組成如下： 組分 比例 減性 rhEPO 1.2 mg/mL .難丙基甲基纖維素 5.:0 m_g/m_L 鱗酸二氬枘 2 mg/mL 鱗酸氣二納 0.7 mg/mL
[0079] 吐溫 80 0.25 mg/mL 氣化納 7:.7 .mg/m_L 乙二胺四議二鈉 0.1 mg/mL 苯扎氯餐 0.2 mg/mL 注射用水 足量I ml
[0080] 實(shí)施例7