用于制備與蜂蠟組合的基于花粉的物質(zhì)的反應(yīng)平臺(tái)和方法及其用圖
【專(zhuān)利說(shuō)明】用于制備與蜂蠟組合的基于花粉的物質(zhì)的反應(yīng)平臺(tái)和方法及 其用途 發(fā)明領(lǐng)域
[0001]描述了用于制造基于花粉的產(chǎn)品的方法以及反應(yīng)平臺(tái)。描述了適合施用給個(gè)體的 化妝和營(yíng)養(yǎng)制劑，其包含與蜂蠟組合的基于花粉的物質(zhì)，包括多肽、氨基酸、脂肪酸甘油三 酯和類(lèi)黃酮。
[0002] 背景
[0003] 自然狀態(tài)下的蜂巢包含有趣的化學(xué)，包括通過(guò)某些酶的作用釋放有價(jià)值的被運(yùn)輸 至蜂巢的花粉的生物活性組分。然而，使用蜂巢原料或混合物存在問(wèn)題，包括組分分離、微 生物菌群污染、和/或暴露于用來(lái)消滅害蟲(chóng)(例如螨蟲(chóng)）的殺蟲(chóng)劑。因此，需要一種使用協(xié)同 組合的期望蜂巢組分有效利用(economize)已流水線(xiàn)化的生產(chǎn)的方法。
[0004] 本發(fā)明人(Weir，曾用名O'Brien)已證實(shí):植物具備內(nèi)部遺傳機(jī)制以控制凋亡（又 名程序性細(xì)胞死亡(PCD))的過(guò)程和進(jìn)展。在一個(gè)實(shí)例中，染色體凝聚(其是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中 PCD的標(biāo)志）在植物細(xì)胞中在凋亡早期階段可以是可逆的（O'Brien等人，The Plant Journal(1998)13(6):803-814)。
[0005] 花粉具有被稱(chēng)為孢粉素的硬殼，孢粉素非常耐化學(xué)降解。此外，花粉表面上有引起 已知變態(tài)反應(yīng)的蛋白。在一種方法中，利用反應(yīng)使花粉粒在壓力下"爆炸"或"破裂"，隨后使 用蛋白酶來(lái)使產(chǎn)生變態(tài)反應(yīng)的蛋白水解和失活。
[0006] 在另一種可行的兩步反應(yīng)中，可操作花粉使起始萌發(fā)并因此更溫和和天然地釋放 花粉的生物活性?xún)?nèi)容物。
[0007] 因此，如果能夠找到一種方法首先打開(kāi)花粉粒或使花粉粒萌發(fā)從而以生物方式釋 放有益組分，隨后加入其它蜂巢組分，那么這將模擬天然過(guò)程，從而提供獲得營(yíng)養(yǎng)品或化妝 品的新方法。
[0008] 異位性皮炎(通常被稱(chēng)為濕疹)是復(fù)雜的皮膚疾病，其特征為瘙癢、受損的表皮屏 障功能、以及對(duì)多種食物和環(huán)境變應(yīng)原的免疫球蛋白致敏（Sohn，A.等人，"Eczema，" Mt.Sinai J.Med. (2011)78:730-739)。皮膚炎癥表現(xiàn)得類(lèi)似紅斑，其可包括起鱗(scaling) 和痂（Krafchik，B.R.，"Eczema,"Paediatr.Child Health(2000)5:101-105)。其通常由于 基因與環(huán)境的相互作用而發(fā)生。有濕疹的患者發(fā)展出更高的皮膚感染風(fēng)險(xiǎn)。護(hù)膚品(包括保 濕乳膏）被用于處理干燥和鱗狀的皮膚（Loden，M.等人，"A double-blind study comparing the effect of glycerine and urea on dry，eczematous skin in atopic patients，" Acta Derm. Venereol · (2002)82:45-47)。這種乳膏（cream)的效果表明 了對(duì)嘗 試所述產(chǎn)品的患者的生活質(zhì)量有積極影響(Eberlein，B.等人，"Adjuvant treatment of atopic eczema:assessment of an emollient containing N-paImitoyIethanolamine (ATOPA study)，"J.Eur.Acad.Dermatol.Venereol·(2008)22:73-82)〇
[0009] 如果能夠找到一種方法來(lái)使用基于植物的物質(zhì)以影響或控制哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的 免疫或P⑶信號(hào)通路，這將為營(yíng)養(yǎng)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域做出有價(jià)值的貢獻(xiàn)。
[0010] 此外，如果能夠找到一種方法來(lái)使用基于植物的物質(zhì)(包括基于花粉的提取物）以 處理炎性或皮膚狀況(conditions)，這將為營(yíng)養(yǎng)、化妝和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域做出有價(jià)值的貢獻(xiàn)。
[0011] 發(fā)明概述
[0012] 基于花粉的提取物包含萌發(fā)的花粉、蜂巢組分、和任選地含酶物質(zhì)(包括蜜露或植 物粉)。
[0013]水性皮膚乳膏(aqueous skin cream)包含基于花粉的提取物和甘油、天然油、潤(rùn) 滑劑、防腐劑、維生素、香料、乳化劑或蠟中的一種或多種。皮膚乳膏可被用于處理皮膚狀況 或炎癥。
[0014] 提供治療濕疹或牛皮癬的方法，所述方法包括：向需要這種治療的個(gè)體施用治療 有效量的水性皮膚乳膏。所述皮膚乳膏可局部(topically)施用至皮膚。
[0015] 提供用于生產(chǎn)基于花粉的提取物物質(zhì)的兩階段反應(yīng)平臺(tái)，所述反應(yīng)平臺(tái)包括以下 步驟:第一階段，其包括:使花粉粒打開(kāi)和/或萌發(fā)，使經(jīng)處理的花粉粒與一種或多種蜂巢組 分反應(yīng)，所述蜂巢組分選自蜂蠟、蜂蜜或含酶物質(zhì)，以及攪拌以形成膠狀物;和第二階段，其 包括:在密閉容器中加熱所述膠狀物以產(chǎn)生提取物。所述提取物可以是發(fā)酵的提取物。應(yīng)該 理解，可通過(guò)加入一種或多種組分使提取物進(jìn)一步可發(fā)酵。 附圖簡(jiǎn)介
[0016] 圖1描述了根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式制備的打開(kāi)和發(fā)酵的花粉的脂肪酸分析。
[0017] 圖2描述了根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式制備的打開(kāi)和發(fā)酵的花粉(來(lái)自反應(yīng)的上 層和沉降物二者)的脂肪酸分析。
[0018] 圖3A描述了在MTT試驗(yàn)中用具有非常強(qiáng)的細(xì)胞保護(hù)活性的基于椰子水的提取物 (作為未發(fā)酵的"7K"提取物)處理HL-60細(xì)胞。
[0019] 圖3B描述了在MTT試驗(yàn)中用具有非常強(qiáng)的細(xì)胞保護(hù)活性并促進(jìn)細(xì)胞增殖的基于椰 子水的提取物(作為發(fā)酵的2階段"乙醇"提取物)處理HL-60細(xì)胞。
[0020] 圖4描述了在MTT試驗(yàn)中用包含具有非常強(qiáng)的細(xì)胞保護(hù)活性的樹(shù)番茄粉并促進(jìn)細(xì) 胞增殖的基于椰子水的提取物(作為發(fā)酵的2階段"乙醇"提取物)處理HL-60細(xì)胞。
[0021] 圖5描述了根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式制備的打開(kāi)和發(fā)酵的花粉的凝膠電泳 (SDS-PAGE)分析。泳道標(biāo)記如下：DE2-DE9 (12.5μ1上樣）、蛋白標(biāo)記、和DE2-DE7 (2.5μ1)上 樣，如下所述。
[0022]圖6描述了根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式制備的打開(kāi)和發(fā)酵的花粉的RP-UHPLC和陰 離子電噴霧電離(ESI)分析(實(shí)施例2Α)，其顯示了長(zhǎng)達(dá)72小時(shí)的2階段發(fā)酵反應(yīng)的產(chǎn)物。 [0023]圖7A顯示了：處理之前，具有嚴(yán)重濕疹的人類(lèi)患者的一只手的照片。
[0024]圖7B顯示了 ：使用實(shí)施例6B的發(fā)酵的基于花粉的乳膏局部處理4周后，圖7A的濕疹 患者的照片。
[0025]圖8A顯示了：處理之前，具有嚴(yán)重濕疹的人類(lèi)患者的一條胳膊的照片。
[0026]圖8B顯示了 ：使用實(shí)施例6B的發(fā)酵的基于花粉的乳膏局部處理4周后，圖8A的濕疹 患者的照片。
[0027]圖9A顯示了：處理之前，具有牛皮癬病變的人類(lèi)患者的一條腿的照片。
[0028]圖9B顯示了 ：使用實(shí)施例6D的發(fā)酵的基于花粉的乳膏局部處理4周后，圖9A的牛皮 癬患者的照片。
[0029]圖10描述的柱狀圖顯示了 ：接受含有根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式制備的發(fā)酵的基 于花粉的提取物的皮膚乳膏（實(shí)施例6B)的臨床處理組(n = 20)的異位性皮炎嚴(yán)重度得分 (SCORAD)指數(shù)。
[0030]圖11描述的柱狀圖顯示了 ：接受含有根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式制備的發(fā)酵的基 于花粉的提取物的皮膚乳膏（實(shí)施例6B)的臨床處理組（n = 20)的皮膚病生活質(zhì)量指數(shù) (DLQI)0
[0031] 詳細(xì)描述
[0032] 在下文中，連同闡釋本發(fā)明原理的附表和附圖一起提供了本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí) 施方式的詳細(xì)描述。因而，該詳細(xì)描述通過(guò)示例性方式而非限制性方式闡釋了本發(fā)明。該描 述能夠清楚地使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)嵤┖褪褂帽景l(fā)明，并且描述了本發(fā)明的若干實(shí)施方 式、改變、變化、替代方式和用途，包括目前我們認(rèn)為本發(fā)明的最佳實(shí)施方式。應(yīng)當(dāng)清楚地理 解:可對(duì)所述發(fā)明進(jìn)行常規(guī)的變化和改變，且這種變化和改變明確落入本發(fā)明的精神和范 圍內(nèi)。
[0033] 換言之，結(jié)合這些實(shí)施方式描述本發(fā)明，但本發(fā)明不限于任何實(shí)施方式。本發(fā)明的 范圍僅由權(quán)利要求限定且本發(fā)明包含多種替代方式、修改和等同。以下描述中給出了多個(gè) 特定細(xì)節(jié)以提供對(duì)本發(fā)明的透徹理解。這些細(xì)節(jié)被提供用于示例的目的，可根據(jù)權(quán)利要求 且利用或不利用這些特定細(xì)節(jié)中的一些或全部來(lái)實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。
[0034] 已提供了安全有效的基于花粉的皮膚乳膏，其包含蜂蠟和任選地酶，其可以以治 療有效量被施用至個(gè)體用于治療濕疹或牛皮癬?；诨ǚ鄣钠つw乳膏可局部施加在皮膚 上。
[0035] 花粉具有被稱(chēng)為孢粉素的硬殼，孢粉素非常耐化學(xué)降解。此外，花粉表面上有引起 已知變態(tài)反應(yīng)的蛋白。在一種方法中，利用反應(yīng)使花粉粒在壓力下"爆炸"或"破裂"（常用的 非生物方法），隨后使用蛋白酶來(lái)使產(chǎn)生變態(tài)反應(yīng)的蛋白水解和失活。任選地，然后可使用 肽酶由產(chǎn)生的混合物或湯(soup)中產(chǎn)生肽。
[0036] 不同于試著使花粉粒爆炸(其的確有部分作用），嘗試操作或處理花粉粒以起始萌 發(fā)并因此天然地釋放它們的內(nèi)容物，從而優(yōu)化生物活性并提供定向性強(qiáng)得多的產(chǎn)品。這可 以被認(rèn)為是打開(kāi)花粉的"生物"方法。如果花粉粒爆炸，則所釋放的化合物更響應(yīng)于壓力(這 對(duì)一些醫(yī)療狀況有益），但如果它們通過(guò)萌發(fā)溫和釋放，則它們促進(jìn)細(xì)胞更新和修復(fù)（如之 前所討論的）。通過(guò)利用生物萌發(fā)途徑，有活力的花粉粒開(kāi)始萌發(fā)而受損或死亡的花粉粒保 留并可被濾出。因此，通過(guò)除去死亡的花粉粒，這種途徑也是一種改善。
[0037]在一個(gè)實(shí)施方式中，已發(fā)現(xiàn)兩步法可被用于生產(chǎn)基于花粉的提取物物質(zhì)，所述方 法包括利用生物方法使花粉粒打開(kāi)和/或萌發(fā)，和使經(jīng)處理的花粉粒與一種或多種蜂巢組 分(例如，蜂錯(cuò)、蜂膠(propolis)等)反應(yīng)。
[0038] 發(fā)酵方法的開(kāi)發(fā)和花粉粒的打開(kāi)。
[0039] 首先，在密封的不銹鋼瓶?jī)?nèi)，在水(500mL)中將少量干花粉(25g)與白糖(5g)和活 性酵母(5g)混合。在環(huán)境溫度下，約72小時(shí)后，所產(chǎn)生的這種混合物發(fā)酵并產(chǎn)生醇和伴隨的 醇?xì)馕丁?br>[0040]利用來(lái)自新西蘭南部(Nothofagus spp.)山毛櫸森林中的山毛櫸樹(shù)的蜜露（分離 自新西蘭山毛櫸蟻殼蟲(chóng)Ultracoelostoma assimiIe(Maskel 1))和原蜜（馬努卡，忍冬花，三 葉草)進(jìn)行之后的實(shí)驗(yàn)。在新西蘭內(nèi)，這種昆蟲(chóng)主要出現(xiàn)在南島且在黑山毛櫸(N.solandri solandri)和山地山毛櫸(N. s . cliffortioides)上最常見(jiàn)，但通常任何山毛櫸都能滿(mǎn)足 (Gaze等人，N.Z.J.Ecol. (1983)6:33-37)。在這些實(shí)驗(yàn)中，發(fā)酵反應(yīng)在較高溫度(37°C、42°C 或65°C)下在約24小時(shí)內(nèi)發(fā)生，但在25°C下則耗費(fèi)48小時(shí)。顯示出約66 %的花粉粒打開(kāi)。此 外，使用蜜露不產(chǎn)生醇?xì)馕?，但?huì)產(chǎn)生非常金黃色的油質(zhì)湯。
[0041]發(fā)酵和花粉粒打開(kāi)之后進(jìn)行脂肪酸（FA)含量分析，如圖1和2中所示（NZLabs， Auckland，新西蘭）。示例性的發(fā)酵后沉降物的過(guò)濾請(qǐng)參見(jiàn)下文的制備實(shí)施例A和B。
[0042] FA分析結(jié)果清楚顯示:在打開(kāi)的花粉粒中，脂肪酸含量被保持和保護(hù)。該實(shí)驗(yàn)所證 明的關(guān)鍵事情在于：脂肪酸從花粉中釋放，但在未爆炸的花粉中，所分析的湯中沒(méi)有脂肪 酸。
[0043]反應(yīng)平臺(tái)的開(kāi)發(fā)
[0044]發(fā)現(xiàn)了有效打開(kāi)花粉粒的方法后，進(jìn)行了花粉粒內(nèi)容物和來(lái)自蜂巢的其它組分 (例如，蜂蠟、蜂膠等)的反應(yīng)。通過(guò)如下所述的一些制備實(shí)施例開(kāi)發(fā)了方法。
[0045] 已發(fā)現(xiàn):包含昆蟲(chóng)酶的蜜露(來(lái)自南方山毛櫸森林）比原蜜效果好。蜜露是由山毛 櫸樹(shù)上的食用汁液的蚧殼蟲(chóng)提煉的物質(zhì)。這種蜜露是蜂蜜物質(zhì)，但含有來(lái)自蚧殼蟲(chóng)的酶和 它們的"腸道菌群，包括嗜果糖(fructo