適配體靶向脂質(zhì)體載藥系統(tǒng)及制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及用于癌癥的祀向給藥系統(tǒng)，更具體地說，設(shè)及一種適配體祀向脂質(zhì)體 載藥系統(tǒng)及制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 脂質(zhì)體化iposome)，由憐脂或其他類脂化合物形成的具有雙分子層結(jié)構(gòu)的封閉囊 泡，是一種性質(zhì)穩(wěn)定、在血液循環(huán)中具有長(zhǎng)效半衰期的非病毒載體。將抗腫瘤藥物包封在脂 質(zhì)體中，不僅可W保護(hù)藥物在進(jìn)入病灶部位前免受機(jī)體酶的分解，延長(zhǎng)藥物循環(huán)時(shí)間，增加 藥物在病灶部位的濃度和作用時(shí)間，提高療效，降低毒性;而且和其它傳遞系統(tǒng)相比，脂質(zhì) 體能夠提供優(yōu)越的生物相溶性、生物可降解性、低毒性、尺寸可控性及表面功能可修飾性。
[0003] 雖然抗腫瘤藥物的脂質(zhì)體制劑傳遞藥物的高效性，降低了抗腫瘤藥物的毒副作 用，增強(qiáng)了癌癥的治療效果。但是W傳統(tǒng)的卵憐脂、膽固醇制備的常規(guī)脂質(zhì)體在體內(nèi)多被網(wǎng) 狀內(nèi)皮系統(tǒng)（reti州Ioendothelial system,RES)吞隧，在血液循環(huán)中駐留時(shí)間較短，并且 其物理化學(xué)穩(wěn)定性差，儲(chǔ)存和應(yīng)用過程中容易發(fā)生融合聚集，包封藥物容易泄漏、表面官能 團(tuán)少、不易進(jìn)行多功能化修飾，并且無祀向性、功能單一等。因此，抗腫瘤藥物脂質(zhì)體制劑的 穩(wěn)定性、祀向性和藥物傳遞效率有待提高。
[0004] 適配體是一類經(jīng)篩選得到的單鏈DNA或RNA，通過S維結(jié)構(gòu)W高親和力特異性結(jié)合 在祀標(biāo)上，又被稱作"化學(xué)抗體"。和單克隆抗體相比，適配體分子量小、易于修飾合成、低毒 低免疫原性、組織滲透性強(qiáng)等，因此，適配體被廣泛應(yīng)用于藥物祀向治療及腫瘤檢測(cè)等領(lǐng) 域。
[0005] 現(xiàn)有技術(shù)中已有研究將核酸適配體通過化學(xué)鍵連接到抗腫瘤藥物脂質(zhì)體上，W制 備適配體祀向脂質(zhì)體載藥系統(tǒng)，增強(qiáng)其穩(wěn)定性、祀向性和藥物傳遞效率。但是運(yùn)些適配體祀 向脂質(zhì)體載藥系統(tǒng)仍然采用常規(guī)的憐脂如卵憐脂等原料制備，難W抵抗體內(nèi)的化學(xué)和生物 的降解，因而也不適于制備尺寸較小的納米顆粒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于，針對(duì)現(xiàn)有常規(guī)憐脂制備的適配體祀向脂質(zhì)體載藥 系統(tǒng)穩(wěn)定性不高的缺陷，提供一種使用銷憐脂制備的適配體祀向脂質(zhì)體載藥系統(tǒng)及制備方 法和應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是:構(gòu)造一種適配體祀向脂質(zhì)體載藥系 統(tǒng)，由核酸適配體、抗腫瘤藥物W及使用銷憐脂制備的納米脂質(zhì)體組成，其中所述抗腫瘤藥 物包裹在所述納米脂質(zhì)體中，所述核酸適配體通過化學(xué)鍵連接在所述納米脂質(zhì)體上特異識(shí) 別腫瘤細(xì)胞。
[000引在根據(jù)本發(fā)明所述的適配體祀向脂質(zhì)體載藥系統(tǒng)中，所述使用銷憐脂制備的納米 脂質(zhì)體包括銷憐脂、憐脂穩(wěn)定劑、膽固醇類成分和功能性憐脂;其中，所述憐脂穩(wěn)定劑選自 二硬脂酷基憐脂酷乙醇胺-聚乙二醇、二肉豆違酷憐脂酷乙醇胺-聚乙二醇和憐脂酷乙醇 胺-聚乙二醇中的一種或多種;所述膽固醇類成分選自膽固醇及其衍生物、膽醬燒、膽酸和 膽汁酸中的一種或多種;所述功能性憐脂選自二硬脂酷基憐脂酷乙醇胺-聚乙二醇-馬來酷 亞胺交聯(lián)物、二硬脂酷基憐脂酷乙醇胺-聚乙二醇-簇基交聯(lián)物、二硬脂酷基憐脂酷乙醇胺-聚乙二醇-N-班巧酷亞胺和二硬脂酷基憐脂酷乙醇胺-聚乙二醇-氨基交聯(lián)物中的一種或多 種。
[0009] 在根據(jù)本發(fā)明所述的適配體祀向脂質(zhì)體載藥系統(tǒng)中，所述適配體祀向脂質(zhì)體載藥 系統(tǒng)的粒徑為100-120nm。
[0010] 在根據(jù)本發(fā)明所述的適配體祀向脂質(zhì)體載藥系統(tǒng)中，所述核酸適配體為sgc8、 A10、S2.2、AS1411或化Slla;所述抗腫瘤藥物為硫酸長(zhǎng)春新堿、阿霉素、柔紅霉素、順銷或紫 杉醇。
[0011] 在根據(jù)本發(fā)明所述的適配體祀向脂質(zhì)體載藥系統(tǒng)中，優(yōu)選地，所述適配體祀向脂 質(zhì)體載藥系統(tǒng)由核酸適配體Sgc8、硫酸長(zhǎng)春新堿W及使用銷憐脂制備的納米脂質(zhì)體組成， 其中使用銷憐脂制備的納米脂質(zhì)體包括W下成分:銷憐脂、二硬脂酷基憐脂酷乙醇胺-聚乙 二醇、膽固醇和二硬脂酷基憐脂酷乙醇胺-聚乙二醇-馬來酷亞胺交聯(lián)物。
[0012] 本發(fā)明還提供了一種適配體祀向脂質(zhì)體載藥系統(tǒng)的制備方法，該制備方法包括：
[0013] S1、將銷憐脂、膽固醇類成分、憐脂穩(wěn)定劑和功能性憐脂按摩爾比為50-60:35-45: 4-5:0.2-0.4溶解在有機(jī)溶劑中制備空白脂質(zhì)體；
[0014] S2、使用步驟Sl的空白脂質(zhì)體制備包裹抗腫瘤藥物的脂質(zhì)體；
[0015] S3、將核酸適配體連接至包裹抗腫瘤藥物的脂質(zhì)體上，制備適配體祀向脂質(zhì)體載 藥系統(tǒng)。
[0016] 在根據(jù)本發(fā)明所述的適配體祀向脂質(zhì)體載藥系統(tǒng)的制備方法中，所述步驟Sl具體 為:將銷憐脂成分、膽固醇類成分、憐脂穩(wěn)定劑和功能性憐脂按摩爾比為50-60:35-45:4-5: 0.2-0.4溶解在氯仿中的混合，在50-70°C下W轉(zhuǎn)速為100-2(K)rpm/min旋轉(zhuǎn)并抽真空形成干 燥的脂質(zhì)薄膜，去除有機(jī)溶劑;所述脂質(zhì)薄膜分散在構(gòu)祿酸緩沖液中，在液氮和50-60°C水 浴反復(fù)凍融多次，并經(jīng)過粒徑篩選后得到空白脂質(zhì)體。
[0017] 在根據(jù)本發(fā)明所述的適配體祀向脂質(zhì)體載藥系統(tǒng)的制備方法中，所述步驟S3中采 用核酸適配體為Sgc別寸，在包裹抗腫瘤藥物的脂質(zhì)體的溶液中按照核酸適配體SgcS和功能 性憐脂的摩爾比為1:5-1:10加入核酸適配體sgc8,氮?dú)獗Ｗo(hù)環(huán)境下室溫反應(yīng)，并透析洗涂 多余的功能性憐脂、抗腫瘤藥物和核酸適配體，得到所述適配體祀向脂質(zhì)體載藥系統(tǒng)。
[0018] 本發(fā)明還提供了一種治療和/或預(yù)防腫瘤藥物，該治療和/或預(yù)防腫瘤藥物的活性 成分為如前所述的適配體祀向脂質(zhì)體載藥系統(tǒng)。
[0019] 本發(fā)明還提供了如前所述的適配體祀向脂質(zhì)體載藥系統(tǒng)在治療和/或預(yù)防腫瘤中 的應(yīng)用。
[0020] 實(shí)施本發(fā)明的適配體祀向脂質(zhì)體載藥系統(tǒng)及制備方法和應(yīng)用，具有W下有益效 果:本發(fā)明使用銷憐脂來制備納米脂質(zhì)體，在包裹抗腫瘤藥物后連接適量的核酸適配體，其 中銷憐脂含有較多的酷胺鍵能夠更好地抵抗化學(xué)和生物的降解，保護(hù)脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定， 提高腫瘤細(xì)胞的藥物富集量，從而提高抗腫瘤效果。
【附圖說明】
[0021] 下面將結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，附圖中：
[0022] 圖1為根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例的適配體祀向脂質(zhì)體載藥系統(tǒng)的制備方法圖；
[0023] 圖2為根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例的適配體祀向脂質(zhì)體載藥系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0024] 圖3A-C分別為根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例的適配體祀向脂質(zhì)體載藥系統(tǒng)各個(gè)階段顆 粒的透射電鏡圖；
[0025] 圖4為根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例的適配體祀向脂質(zhì)體載藥系統(tǒng)各個(gè)階段顆粒的粒徑 分布圖；
[00%] 圖5為CEM細(xì)胞與sgc8/VCR-Lipo和VCR-Lipo的結(jié)合實(shí)驗(yàn)圖；
[0027] 圖6為不同處理組的荷瘤小鼠的腫瘤體積的變化圖；
[0028] 圖7為荷瘤小鼠在不同的存活率時(shí)距接種腫瘤的時(shí)間圖；
[0029] 圖8為不同處理的荷瘤BalB/c裸鼠的腫瘤大小圖；
[0030] 圖9為適配體祀向脂質(zhì)體載藥系統(tǒng)的體內(nèi)祀向作用圖。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，W下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì) 本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0032] 本發(fā)明提供了一種適配體祀向脂質(zhì)體載藥系統(tǒng)，由核酸適配體、抗腫瘤藥物W及 使用銷憐脂制備的納米脂質(zhì)體組成，其中抗腫瘤藥物包裹在納米脂質(zhì)體中，核酸適配體通 過化學(xué)鍵連接在納米脂質(zhì)體上能夠特異識(shí)別腫瘤細(xì)胞。本發(fā)明中主要用銷憐脂制備納米脂 質(zhì)體，其成分包括銷憐脂、憐脂穩(wěn)定劑、膽固醇類成分和功能性憐脂。其中銷憐脂作為一種 憐脂，與膽固醇類成分一起共同構(gòu)成脂質(zhì)體的基礎(chǔ)物質(zhì)。該膽固醇類成分選自膽固醇及其 衍生物、膽醬燒、膽酸和膽汁酸中的一種或多種。膽固醇類成分具有調(diào)節(jié)膜流動(dòng)性的作用， 因此被稱為脂質(zhì)體的"流動(dòng)性緩沖劑"。憐脂主要由一個(gè)憐酸基團(tuán)和一個(gè)季錠鹽基團(tuán)組成的 親水性基團(tuán)，W及由兩個(gè)較長(zhǎng)的控基組成的親脂性基團(tuán)。使用的憐脂類可W是天然憐脂，也 可W是合成憐脂。天然憐脂主要W卵憐脂，又名憐脂酷膽堿(Phosphatidylcholine,簡(jiǎn)稱 PC)為主，主要來源于蛋黃憐脂和大豆憐脂，顯中性。合成憐脂主要有二棟桐酷憐脂酷膽堿 (DPPC)、二棟桐酷憐脂酷乙醇胺化PPE)、二硬脂酷憐脂酷膽堿化SPC)等，運(yùn)些均屬氨化憐脂 類。本發(fā)明中選用銷憐脂(S曲ingomyelin)來替代常規(guī)的憐脂，運(yùn)是因?yàn)殇N憐脂含有較多的 酷胺鍵連接的脂肪鏈，能更好地抵抗化學(xué)和生物的降解，保護(hù)脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。
[0033] 前述憐脂穩(wěn)定劑也稱為mPEG化憐脂或mPEG憐脂，其加入可使由銷憐脂和膽固醇類 成分構(gòu)成的普通脂質(zhì)體成為空間穩(wěn)運(yùn)脂質(zhì)體、隱形脂質(zhì)體或長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體。該憐脂穩(wěn)定劑 選自二硬脂酷基憐脂酷乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-陽(yáng)G)、二肉豆違酷憐脂酷乙醇胺-聚乙二醇 (DMPE-PEG)和憐脂酷乙醇胺-聚乙二醇(PE-PEG)中的一種或多種。
[0034] 本發(fā)明所述功能化憐脂也稱為功能化PEG憐脂，其PEG-端與銷憐脂連接，另一端 被馬來酷亞胺基、竣基等修飾，除了使脂質(zhì)體具有空間穩(wěn)定、隱形或長(zhǎng)循環(huán)的特點(diǎn)外，功能 化PEG憐脂所修飾的馬來酷亞胺基、竣基等可與核酸適配體祀頭連接使脂質(zhì)體具有主動(dòng)祀 向性。該功能性憐脂選自二硬脂酷基憐脂酷乙醇胺-聚乙二醇-馬來酷亞胺交聯(lián)物(DSPE-陽(yáng)G-Mal )、二硬脂酷基憐脂酷乙醇胺-聚乙二醇-簇基交聯(lián)物化SPE-陽(yáng)G-C00H)、二硬脂酷基 憐脂酷乙醇胺-聚乙二醇-N-班巧酷亞胺(DS陽(yáng)-PEG-NHS)和二硬脂酷基憐脂酷乙醇胺-聚乙 二醇-氨基交聯(lián)物(DSPE-PEG-N出）中的一種或多種，根據(jù)所需連接的核酸適配體確定。
[0035] 本發(fā)明中適配體祀向脂質(zhì)體載藥系統(tǒng)包裹的抗腫瘤藥物可W為硫酸長(zhǎng)春新堿、阿 霉素、柔紅霉素、順銷或紫杉醇等。
[0036] 本發(fā)明連接的核酸適配體為3邑。8、410、52.2、451411或化511曰。其中核酸適配體 SgcS可W祀向識(shí)別白血病CCRF-CEM腫瘤細(xì)胞，核酸適配體AlO可W祀向識(shí)別前列腺腫癌細(xì) 胞;核酸適配體S2.2和核酸適配體AS1411可W祀向識(shí)別乳腺癌細(xì)