構(gòu)建高成骨活性骨的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種生物醫(yī)學(xué)的骨基質(zhì)材料，特別涉及一種構(gòu)建高成骨活性骨的方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 因外傷、感染、腫瘤等各種原因所致的骨缺損十分常見，骨修復(fù)過程，是一個(gè)多蛋 白、多因子協(xié)調(diào)作用的復(fù)雜調(diào)控過程。
[0003] 同種異體骨(DBM)是目前最常用的組織工程骨支架材料，經(jīng)過深低溫凍存、脫脂、 脫功能蛋白、脫鈣、γ射線輻照等一系列處理后，有極小的免疫源性，因其天然的三維空間 結(jié)構(gòu)、一定的骨誘導(dǎo)活性等是一種理想的組織工程骨支架材料。
[0004] 在組織工程骨成骨修復(fù)中，可促進(jìn)骨再生的細(xì)胞和細(xì)胞因子在骨支架中的濃度， 對(duì)于成骨有著非常重要的作用。
[0005] 骨髓、血液等組織液中含有一些可促進(jìn)骨再生的細(xì)胞和細(xì)胞因子。這些細(xì)胞和因 子除了具有一定的體積之外還具有一定的表面電荷。通常，為了提高支架材料中上述成份 的濃度，采用縮小支架材料孔徑的方法提高富集效率。但是，這種方法富集效率雖有提高， 但是富集的倍數(shù)局限在1.5-2倍左右，難以滿足成骨的需要，而且對(duì)體積很小的細(xì)胞因子富 集效果不佳。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種構(gòu)建高成骨活性骨的方法，該方法能使同種異體骨支架 材料高效率富集可促進(jìn)骨再生細(xì)胞，滿足成骨的需要，得到的是高成骨活性骨移植材料。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案是：
[0008] 構(gòu)建高成骨活性骨的方法，有以下步驟：
[0009] 1)富集材料的制備 [0010]取同種異體骨脫鈣骨支架；
[0011 ] 純度2 95%的融合肽，溶解在20%蔗糖溶液中，至溶液的終濃度為1 %，超聲處理 30分鐘，得到肽溶液；
[0012] 2)取脫同種異體媽骨支架完全浸泡在肽溶液中4-8分鐘，取出，用pH值7.4的磷酸 緩沖鹽溶液沖洗，得到自組裝肽修飾的同種異體脫鈣骨支架材料；
[0013] 3)富集
[0014] 將骨髓注入裝填有自組裝肽修飾的同種異體骨脫鈣骨支架材料的骨生長(zhǎng)富集器 中，骨髓富集若干次，得到構(gòu)建高成骨活性骨材料。
[0015] 所述融合肽包含RADA16-I肽和偶聯(lián)于RADA16-I肽序列的C端的osteostatin肽 (TRSAW)，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示;或者所述融合肽包含由RADA16-I肽序列的C端 經(jīng)由氨基酸殘基GG與osteostatin肽(TRSAW)偶聯(lián)形成，其氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示。
[0016] 所述RADA16-I肽的氨基酸序列為SEQ ID N0:1。
[0017] 所述osteostatin肽的序列如SEQ ID N0:4所示。
[0018] 步驟3)所述的骨髓富集為4次。
[0019]本發(fā)明采用〃物理化學(xué)雙修飾〃，利用納米級(jí)自組裝肽RADA16-I，等帶有一定電荷 的材料來修飾同種異體骨等孔徑較大的支架材料，納米級(jí)自組裝肽等材料凝固在支架材料 的表面可以減小材料的孔徑，提高富集效率；同時(shí)，凝固在支架材料表面的納米級(jí)自組裝肽 還帶有一定電荷的集團(tuán)，可以通過電荷間的相互作用提高對(duì)同樣帶有不同電荷的細(xì)胞和細(xì) 胞因子的吸附作用，進(jìn)一步提高富集效果，提高富集材料中的細(xì)胞和因子的濃度，進(jìn)一步提 高成骨能力。
【附圖說明】
[0020]圖1為空白DBM材料呈三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)圖；
[0021]圖2為融合肽/DBM復(fù)合材料在DBM表面及網(wǎng)孔內(nèi)部形成片狀結(jié)構(gòu)圖；
[0022]圖3為融合肽/DBM復(fù)合材料在DBM表面及網(wǎng)孔內(nèi)部形成絲狀結(jié)構(gòu)圖；
[0023]圖4為未修飾的DBM支架的掃描電鏡圖片；
[0024] 圖5為修飾的融合肽/DBM復(fù)合材料內(nèi)部可見網(wǎng)孔狀的結(jié)構(gòu)及其內(nèi)部大量的富集細(xì) 胞；
[0025] 圖6為修飾的融合肽/DBM復(fù)合材料富集細(xì)胞的放大圖像。
【具體實(shí)施方式】 [0026] -.試劑和儀器
[0027] 1.試劑：
[0028] 同種異體脫鈣骨支架樣本(北京大清技術(shù)有限公司，中國(guó)）
[0029] RADA16-I肽和融合肽(強(qiáng)耀生物有限責(zé)任公司，上海，中國(guó)）
[0030] FACSCal ibur流式細(xì)胞分析儀(BD公司，美國(guó)）
[0031] 溶血素南昌百特生物高新技術(shù)有限公司
[0032] 混試劑CD34-PE，CD45-Per CP,nucleic acid dye,(有核細(xì)胞）
[0033]核酸染料(BD公司，美國(guó)）
[0034] 2.儀器
[0035] 超聲波清潔器K5100(昆山有限責(zé)任公司，上海，中國(guó)）
[0036] 骨生長(zhǎng)富集器(重慶市富沃思醫(yī)療器械有限公司，中國(guó)）
[0037]生物晶片掃描器(美國(guó)Axon儀器公司）
[0038]實(shí)施例1多肽的設(shè)計(jì)
[0039] 以RADA16-I肽，序列為SEQ ID N0:1(AcN-RADARADARADARADA-C0NH2)作為基礎(chǔ)，在 其C末端借肽鍵直接偶聯(lián)一段osteostatin肽(TRSAW)，該多肽(融合肽)氨基酸序列為SEQ ID N0:2(RADARADARADARADAGGTRSAW)，分子量為2387.54;或者在1^0416-1肽的(：端經(jīng)兩個(gè) 氨基酸殘基GG與osteostatin肽(TRSAW)偶聯(lián)，該多肽(融合肽)氨基酸序列為SEQ ID NO: 3 (RADARADARADARADAGGWASRT)，上述多肽均由蘇州強(qiáng)耀生物科技有限公司合成。
[0040] 實(shí)施例2富集材料的制備
[0041] 將同種異體骨脫鈣骨支架(DBM)樣本切成立方體(10X10X5mm，，備用。取實(shí)施例1 所述的多肽(所述多肽均可以達(dá)到本發(fā)明所述技術(shù)效果），本實(shí)施例采用SEQ ID N0:2,純度 2 95%，溶解在20 %蔗糖溶液中，最終濃度為1 % (w/v)，用超聲波清潔器進(jìn)行超聲處理30分 鐘以降低肽的粘滯性。DBM完全浸泡在肽溶液中約5分鐘。取出DBM后用足量的磷酸緩沖鹽溶 液(PBS，pH值7.4)沖洗，即完成肽的自組裝，形成自組裝肽修飾的DBM材料(SAP/DBM)。
[0042]實(shí)施例3富集
[0043]將骨髓注入已裝填骨修復(fù)材料的椎杯中，蓋緊外蓋，均勻用力按壓骨生長(zhǎng)富集器 手柄至平齊頂部后松開，本產(chǎn)品在恒力彈簧提供的負(fù)壓作用下，自動(dòng)完成1次骨髓富集操 作，并將骨髓回吸入回流筒中。待骨髓完全回流、手柄恢復(fù)到初始位置后，再次按壓手柄開 始第二次循環(huán)。累計(jì)4次上述富集操作，即完成高成骨活性骨移植材料的構(gòu)建，總過程約5-10分鐘。
[0044]富集材料的孔徑指標(biāo)觀察：富集材料制備后通過三維視頻顯微鏡圖像分析系統(tǒng)測(cè) 定未修飾的DBM孔徑大小為(414.32±175.00)μπι(標(biāo)本數(shù)量為η = 60)，修飾后的支架材料融 合肽/DBM材料孔徑大小為(220.55±158.54)μπι(η = 60)，二者之間具有顯著的差異。具體圖 像見圖1(未修飾的DBM)和圖2(融合肽修飾的DBM)。支架材料的孔徑被縮小后，可以形成濾 篩一樣的效應(yīng)，可以顯著提高支架材料對(duì)骨髓中細(xì)胞等促進(jìn)成骨的成分的滯留。
[0045]實(shí)施例4富集效果評(píng)價(jià)
[0046] 1.富集細(xì)胞的計(jì)數(shù)(FA