CSCal ibur流式細(xì)胞分析儀）：
[0047]流式細(xì)胞操作流程：
[0048] 1.1將待測(cè)樣品（富集前和富集后的骨髓)稀釋10倍；
[0049] 1.2取BD絕對(duì)數(shù)計(jì)數(shù)管，加樣50ul;
[0050] 1.3向絕對(duì)計(jì)數(shù)管中加入混合試劑，混勻，避光孵育15min;
[0051 ] 1.4加入IOul溶血素，然后再加入440ul透明液(BD FACS)，混勻，避光孵育30min
[0052] 2.上機(jī)檢測(cè)。
[0053]結(jié)果：以DBM作為對(duì)照，SAP/DBM的骨髓中有核細(xì)胞的富集倍數(shù)為2.2倍，無(wú)核細(xì)胞 為1.62倍。其中有核細(xì)胞中單核細(xì)胞的富集倍數(shù)為3.63倍;紅細(xì)胞的富集倍數(shù)為4.2倍；間 充質(zhì)干細(xì)胞的富集倍數(shù)為2.6倍。
[0054]實(shí)施例5富集細(xì)胞因子的計(jì)數(shù) [0055]采用蛋白質(zhì)芯片技術(shù)(美國(guó)RayBio公司）
[0056] A封閉和孵育
[0057] (1)打開(kāi)試劑盒，取出玻璃芯片，室溫風(fēng)干2h。其余試劑4°C保存。
[0058] (2)將玻璃芯片裝配到孵育小室和孵育架中。
[0059] (3)用雙蒸水稀釋2X封閉緩沖液。每孔中加入IOOul IX的封閉緩沖液，室溫下孵育 30min封閉玻片。注意:確保每孔中無(wú)氣泡，只向包被有抗體的孔中加試劑。
[0060] (4)吸出每孔中的封閉buffer，每組檢測(cè)樣本各取IOOul加入到6、7、8、9、10芯片陣 列的1-7號(hào)樣本孔。加入IOOul的封閉緩沖液到內(nèi)參管中，混勻后移取Iul混合液加入各陣列 的8號(hào)內(nèi)參孔中。薄膜封口后室溫下孵育2h。注意:加樣時(shí)貼壁緩流，以避免氣泡產(chǎn)生。
[0061] (5)用雙蒸水稀釋20倍的清洗緩沖液1得到1倍的緩沖液。輕輕倒出每孔中的樣本， 室溫下用1倍的清洗緩沖液1清洗3遍，每次2min。注意:避免樣本流進(jìn)鄰近的小孔。
[0062] (6)將玻璃芯片連同支架一起放入盛有IX清洗緩沖液1的盒子中（緩沖液要完全覆 蓋整個(gè)玻片以及支架），室溫下輕微震蕩清洗2次，每次lOmin。
[0063] (7)用雙蒸水稀釋20倍的清洗緩沖液2得到1倍的緩沖液。吸除每孔中的清洗緩沖 液，將玻璃芯片連同支架放入盛有1倍的清洗緩沖液2的盒子中，室溫下輕微震蕩清洗2次， 每次5min。徹底吸除洗滌后殘留的緩沖液2。
[0064] (8)用1倍的封閉緩沖液稀釋抗體制備抗體工作液。每孔中分別加入70ul已稀釋的 生物素結(jié)合的抗體(試劑盒自帶），薄膜封口后室溫下孵育2h。
[0065] (9)按照步驟5洗滌后用1倍的清洗緩沖液2在室溫下震蕩清洗3次，每次2min。徹底 吸除洗滌后殘留的緩沖液2。
[0066] (10)加入70ul熒光染料結(jié)合的鏈霉親和素(試劑盒自帶)至每一個(gè)陣列中，薄膜完 全覆蓋孵育小室，在室溫下暗室中孵育2h。
[0067] (11)按照步驟5，用IX清洗緩沖液1清洗2遍。
[0068] B熒光檢測(cè)
[0069] (1)吸除小孔中的清洗緩沖液。
[0070] (2)將玻片從孵育小室和支架中取下。
[0071] (3)將整個(gè)玻片置入30ml的離心管中，加入足量的IX清洗緩沖液1覆蓋整個(gè)玻片， 室溫下輕微震蕩lOmin，重復(fù)兩次后用IX清洗緩沖液2室溫下輕微震蕩清洗lOmin。
[0072] (4)1000rpm離心3min，將玻片置于空氣中徹底干燥至少20min(避光）。確保熒光掃 描之前玻片完全干燥。
[0073] (5)使用生物晶片掃描器的綠光光圈采集信號(hào)圖像(激發(fā)光譜532nm)。
[0074]結(jié)果:與骨髓中的濃度相比較，SAP/DBM材料中富集的骨髓中與成骨密切相關(guān)的細(xì) 胞因子:BMP-6，PDGF-BB，VEGF，and EGF的倍數(shù)分比為1 · 38，1 · 30，1 · 65，and 3 · 95〇 [0075]圖1-6所示:融合肽/DBM材料可見(jiàn)無(wú)色透明的膠樣物黏附于網(wǎng)孔支架內(nèi)部及DBM表 面。
[0076] 三維視頻顯微鏡圖像分析系統(tǒng)測(cè)定DBM孔徑大小為(414.32±175.00)μπι(η = 60)， 融合肽/DBM材料孔徑大小為(220.55± 158.54)μπι(η = 60)，融合肽/DBM與DBM孔徑的總體均 數(shù)差異顯著(Ρ<〇.05)?？瞻譊BM材料呈三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)（圖1)，孔隙內(nèi)部相互連通，孔徑相對(duì) 較大;融合肽/DBM復(fù)合材料不但保持了天然骨材料的的三維網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)，而且在DBM表面及網(wǎng) 孔內(nèi)部形成片狀、絲狀結(jié)構(gòu)（圖2,圖3)，相互交錯(cuò)連接成網(wǎng)孔狀結(jié)構(gòu)，孔徑相對(duì)較小，孔與孔 之間有小的孔隙相互連通?？梢?jiàn)修飾后的材料（圖5、6,其中，從圖5可見(jiàn)修飾后的復(fù)合材料 內(nèi)部為網(wǎng)孔狀并且有大量的富集細(xì)胞圖）比修飾前的材料(圖4,從圖4可見(jiàn)細(xì)胞是散在材料 表面），具有更高的富集效率。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種構(gòu)建高成骨活性骨的方法，其特征在于，有以下步驟： 1) 富集材料的制備 取同種異體骨脫鈣骨支架； 純度2 95%的融合肽，溶解在20%蔗糖溶液中，至溶液的終濃度為1%，超聲處理30分 鐘，得到肽溶液； 2) 取同種異體脫鈣骨支架完全浸泡在肽溶液中4-8分鐘，取出，用pH值7.4的磷酸緩沖 鹽溶液沖洗，得到自組裝肽修飾的同種異體脫鈣骨支架材料； 3) 富集 將骨髓注入裝填有自組裝肽修飾的同種異體骨脫鈣骨支架材料的骨生長(zhǎng)富集器中，骨 髓富集若干次，得到高成骨活性骨。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述融合肽包含RADA16-I肽和偶聯(lián)于 RADA16-I肽序列的C端的osteostatin肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:所述osteostatin肽的序列如SEQ ID N0:4 所示。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述融合肽包含由RADA16-I肽序列的C端 經(jīng)由氨基酸殘基GG與osteostatin肽偶聯(lián)形成，其氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示。5. 根據(jù)權(quán)利要求2或4所述的方法，其特征在于:所述RADA16-I肽的氨基酸序列為SEQ ID Ν0:1〇6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:步驟3)所述的骨髓富集為4次。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種構(gòu)建高成骨活性骨的方法，有以下步驟：1)取同種異體骨脫鈣骨支架；融合肽溶解在蔗糖溶液中，至溶液的終濃度為1％，超聲處理，得到肽溶液；2)取同種異體脫鈣骨支架完全浸泡在肽溶液中4-8分鐘，取出，用磷酸緩沖鹽溶液沖洗，得到自組裝肽修飾的同種異體脫鈣骨支架材料；3)將骨髓注入裝填有自組裝肽修飾的同種異體骨脫鈣骨支架材料的骨生長(zhǎng)富集器中，骨髓富集若干次，得到高成骨活性骨。該方法能使同種異體骨支架材料高效率富集可促進(jìn)骨再生細(xì)胞，滿足成骨的需要，得到的是高成骨活性骨移植材料。
【IPC分類】A61L27/36, A61L27/38, A61L27/54, A61L27/22
【公開(kāi)號(hào)】CN105536067
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610057023
【發(fā)明人】侯天勇, 陳貝克, 李志強(qiáng), 邢軍超, 羅飛, 張帥, 許建中
【申請(qǐng)人】中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院
【公開(kāi)日】2016年5月4日
【申請(qǐng)日】2016年1月28日