，Η·R.Smith，Μ·Ε.WooIhouse和 G.Frankel.2004.Shedding patterns of verocytotoxin-producing Escherichia coli strains in a cohort of calves and their dams on a Scottish beef farm. Appl. Environ .Microbiol. 70:7456-7465)，并且沒有發(fā)展出感染的臨床癥狀，但可能 大量脫落（shed)該細菌數(shù)個月（Widiasih，D.A.，N. Ido, K.Omoe，S.Sugii 和 K.Shinagawa.2004.Duration and magnitude of faecal shedding of Shiga toxin- producing Escherichia coli from natural Iy infected cattle·Epidemiol·Infect.132:67-75)〇
[0084] 減少牛中的持續(xù)性STEC脫落將大大有助于防止人STEC感染。關(guān)于牛免疫接種 (vaccination)可為明智的控制選項的證據(jù)來自以下研究:在該研究中，在用STEC 0157:H7 抗原免疫后，牛較少脫落大腸桿菌0157( Pot ter，A. A.，S. Klashinsky，Y. Li，E .Frey， H·Townsend,D.Rogan，G.Erickson，S.Hinkley，Τ.Klopfenstein,R.A.Moxley,D.R.Smith和 B.B.Finlay.2004.Decreased shedding of Escherichia coli 0157:H7by cattle following vaccination with type III secreted proteins.Vaccine 22:362-369)〇逐 漸增加的證據(jù)表明，在感染期間志賀毒素阻抑對STEC抗原的免疫應(yīng)答。Stx改變了粘膜巨噬 細胞（Stamm，I ·，M· Mohr，P · S · Bridger，E · Schro pfer，M · Ko nig，W· C · Stoffregen， E.A.Dean-Nystrom，G.Baljer和C.Menge·2008·Epithelial and mesenchymal cells in the bovine colonic mucosa differ in their responsiveness to Escherichia coli Shiga toxin l.Infect.Immun.76:5381_5391 )和上皮內(nèi)淋巴細胞（Menge，C·， M.Blessenohl，T.Eisenberg,I·Stamm和G.Baljer·2004·Bovine ileal intraepithelial lymphocytes represent target cells for Shiga toxin lfrom Escherichia coli . Infect. Immun. 72:1896-1905)中的細胞因子表達模式，并在體外阻抑了粘膜淋巴細 胞和外周淋巴細胞的活化和增殖（Moussay，E .，I . Stamm，A.Taubert，G.Baljei^PI C.Menge.2006.Escherichia coli Shiga toxin lenhances IL_4transcripts in bovine ileal intraepithelial lymphocytes.Vet.Tmmunol·Immunopathol·113:367-382)〇另外， 相比用Stx陰性大腸桿菌0157:H7接種的動物中的情況，用產(chǎn)Stx2的STEC 0157:H7實驗性感 染小牛后，適應(yīng)性細胞免疫應(yīng)答的發(fā)展顯著延遲(Hoffman，Μ·Α·，C .Menge，Τ·Α· Casey， W.Laegreid，B·T·Bosworth和E·A·Dean-Nystrom.2006·Bovine immune response to Shiga-toxigenic Escherichia coli 0157:H7.Cl in.Vaccine Immunol·13:1322-1327)〇 [0085]因此，雖然仍不知曉0157: H7大腸桿菌特異性細胞免疫應(yīng)答如何影響長期STEC脫 落和間歇性STEC脫落（Cray ,W· C·，Jr ·和H. W.Moon · 1995 · Experimental infection of calves and adult cattle with Escherichia coli 0157: H7. Appl .Environ .Microbiol .61:1586-1590)，已提出了在用于牛疫苗的抗STEC制劑中包 含Stx作為抗原將是有益的，因為它是所有STEC菌株共有的唯一毒力因子，還因為Stx中和 可以改善整個抗STEC免疫應(yīng)答（FI·δhlichJl，BaljerG，MengeC·Maternallyand naturally acquired antibodies to Shiga toxins in a cohort of calves shedding Shiga-toxigenic Escherichia coli.Appl Environ Microbiol.2009Jun；75(II):3695-704)。
[0086] 此外，在小鼠模型中進行的研究表明，抗Stx抗體能夠抑制EHEC定殖 (colonization)(Mohawk KL,Melton-Celsa AR,Robinson CM1OjBrien AD.Neutralizing antibodies to Shiga toxin type 2(Stx2)reduce colonization of mice by Stx2_ expressing Escherichia coli 0157:H7.Vaccine 2010. ,28:4777-4785)。在提出的不同 機制中，已證明Stx2可通過增強核仁素(nucleolin)的表面表達來積極推動EHEC粘附，核仁 素用作緊密粘附素（intimin)的真核受體（Sinclair JF，0'Brien AD.Cell surface-localized nucleolin is a eukaryotic receptor for the adhesin inti min-gamma, of enterohemorrhagic Escherichia coli 0157:H7.J Biol Chem 2002,277:2876-2885； Robinson CM,Sinclair JF，Smith MJ,O'Brien AD.Shiga toxin of enterohemorrhagic Escherichia coli type 0157:H7promotes intestinal colonization.Proc Natl Acad Sci U S A 2006,103:9667-9672)〇
[0087] 在本發(fā)明的用于在哺乳動物(如牛）中降低腸出血性大腸桿菌的細菌負荷的方法 中，向期望降低細菌負荷的動物給予本發(fā)明的寡聚復合體，由此引發(fā)針對志賀毒素2的B亞 基的有效免疫應(yīng)答。轉(zhuǎn)而，這防止了志賀毒素所產(chǎn)生的對針對STEC抗原的免疫應(yīng)答的阻抑， 從而導致牛中持續(xù)性STEC脫落的減少。
[0088]在本發(fā)明的用于在哺乳動物(如牛）中降低腸出血性大腸桿菌的細菌負荷的替代 方法中，向期望降低細菌負荷的動物給予本發(fā)明的抗體。
[0089] 本發(fā)明的再一方面涉及結(jié)合本發(fā)明的嵌合蛋白的抗體。此類抗體優(yōu)選對本發(fā)明的 嵌合蛋白而言是特異的。在這一背景下，術(shù)語"特異的"是指抗體優(yōu)先結(jié)合本發(fā)明的嵌合蛋 白，但并不排除以較低的程度與其它蛋白結(jié)合。
[0090] 本發(fā)明的抗體在制備用于在哺乳動物(例如人）中預防或治療溶血性尿毒綜合征 的藥物組合物中的用途也是本發(fā)明的一部分。在這種情況下，本發(fā)明的抗體與藥學上可接 受的運載體聯(lián)用，以將其給予需要預防或治療HUS的哺乳動物。藥物運載體和藥物制品 (pharmaceutical presentations)已在上面進行了討論，并且是專業(yè)人員公知的。
[0091 ]本發(fā)明的再一方面涉及藥物組合物，所述藥物組合物包含本發(fā)明的抗體和藥學上 合適的運載體。本發(fā)明的抗體和藥物組合物例如在用于在有需要的受試者中治療或預防溶 血性尿毒綜合征(HUS)的方法中有用，這是本發(fā)明的又一方面。此類方法優(yōu)選用于在人受試 者（例如被腸出血性大腸桿菌菌株感染的人受試者）中治療或預防溶血性尿毒綜合征 (HUS) 0
[0092] 實施例
[0093] 實施例1
[0094]嵌合蛋白BLS_Stx2的分子建模
[0095] 嵌合體的設(shè)計通過以下方式進行：用程序PyMOL 1.5(www.pymol.org)對它的理論 結(jié)構(gòu)進行建模，將Stx2B(H)B編碼：IR4P)結(jié)構(gòu)的C末端與BLS(H)B編碼：ID10)晶體結(jié)構(gòu)的N末 端融合，這是與以前由Laplagne等所描述的策略類似的策略(Laplagne等，2004. Proteins 57:820-828)。將BLS N末端前8個殘基的編碼序列替換為Stx2B以及連接兩個蛋白的柔性G/ S五肽肽接頭、十肽肽接頭或15個氨基酸的肽接頭的編碼序列。Stx2B和BLS二者形成相同C5 對稱的五聚體結(jié)構(gòu)，其中，每個原聚體與其它兩個相互作用。通過分子建模獲得的嵌合體的 理論結(jié)構(gòu)（圖1)說明，所使用的所有接頭都足夠長，從而允許將Stx2B五聚體組裝至BLS的五 聚體模塊上，這沒有任何空間位阻。在十聚體BLS顆粒中，兩個Stx2B五聚體將以相對的方向 展示在該結(jié)構(gòu)的頂部和底部。值得注意的是，在這個模型中，Stx2B的C端表面(與Stx2全毒 素中的A亞基相互作用)將面向BLS支架，并可能被保護免于與免疫系統(tǒng)相互作用，而神經(jīng)酰 胺三己糖苷(Gb3)結(jié)合位點將會完全暴露出來。
[0096] 實施例2
[0097] 通過以下方案構(gòu)建含有具有SEQ.ID.No.4的基因的pETlla-BLS-Stx2B-L5(具有5 個氨基酸的接頭)質(zhì)粒：
[0098] a)為了克隆布魯氏菌屬(Brucella spp.)的2,4_二氧四氫蝶啶合酶(BLS)的編碼 基因，利用特異性引物通過PCR擴增從流產(chǎn)布魯氏菌(B. abortus)的基因組DNA獲得BLS序 列，并克隆到pETlIa載體(Novagen，USA)中。為了開發(fā)表達盒(cassette)，對編碼布魯氏菌 屬2,4-二氧四氫蝶啶合酶(BLS)的開放閱讀框的序列進行定向誘變(Laplagne等，2004)。在 BLS基因的5'區(qū)域中插入兩個新的限制性位點:位于5'端的前兩個密碼子中的NsiI位點；以 及位于包含BLS天然氨基酸序列的第8位和第9位殘基的兩個密碼子中的一個Afl II位點。 [0099] b)為了將所編碼的序列插入Stx2B蛋白（SEQ. ID. No. 1)中，我們設(shè)計了擴增Stx2B 蛋白的寡核苷酸，所述寡核苷酸在序列的5'端具有NsH酶的位點（下劃線），在序列的3'端 具有ΑΠΠ 酶的位點（下劃線），并具有編碼5個氨基酸的接頭的序列(粗體）。以pGEM-T載體 中的以前克隆的序列為模板，通過PCR獲得Stx2B基因 （Seq · ID · No · 2 ) (Capozzo等， 2003.Infect Tmmun 71:3971-3978)。
[0100] 因此，制備以下寡核苷酸以用作PCR中的引物：
[0101] 正向引物（Seq.ID.N0.10):
[0102] 5；ATCAACATGCATGCGGATTGTGCTAAAGGT 3'
[0103] 反向引物 5(Seq.ID.N0.11):
[0104] 5，TAAAATCTTAAGACCAGAACCAGAACCGTCATTATTAAACTGCAC 3'
[0105] 用以下物質(zhì)進行PCR反應(yīng)：0 · 2mM脫氧核苷三磷酸（dNTP) (Promega Inc ·)、I · 5mM MgCl2:(PBL?)、〇 · 15單位DNA Taq聚合酶(PBL181)和〇 · 5μΜ引物。循環(huán)模式為：94°C2分鐘，1 個循環(huán);92°C10秒，62°C12秒和72°C30秒，35個循環(huán)；以及，72°C2分鐘，1個最終循環(huán)。
[0106] 使用瓊脂糖凝膠對PCR產(chǎn)物進行檢查，然后使用Qiagen提取試劑盒(Qiagen，UK)進 行純化。
[0107] c)用NsiI和AflII限制性酶對pETlla-BLS質(zhì)粒和純化的PCRStx2B-L5產(chǎn)物進行消 化。用處于緩沖液Tango? 2 X (終濃度）中的3單位NsiI (Fermentas Inc.)和3單位Af III (Fermentas Inc.)在37°C實施消化4小時。用5單位DNA T4連接酶(Fermentas Inc.)將消化 產(chǎn)物在16°C連接過夜。將連接物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞中，并利用特異性引物(正 向和反向5)通過PCR對菌落進行篩選。通過測序確認插入。測序分析顯示，布魯氏菌屬2,4_ 二氧四氫蝶啶合酶的前8個氨基酸被來自Stx2B蛋白的70個氨基酸（Seq. ID. No. 1)替換。由 此獲得了編碼具有Seq. ID. No. 3的嵌合融合蛋白（稱為BLS_Stx2B(L5))的基因。
[0108] 實施例3
[0109] 通過以下方案構(gòu)建pCI-ne〇-BLS-Stx2B-L5質(zhì)粒：
[0110] 將克隆在pETlla載體中的BLS-Stx2B(L5)的基因序列Seq.ID.No.4亞克隆到載體 pCi-neo(Promega，USA)中。因此，制備以下寡核苷酸以用作PCR中的引物:ACCATG
[0111] BLS-DNA-嵌合體al I (Seq · ID · No · 12): 5 ' GTTTAAGAATTCGAAGGAGATACCACCATGCAT 37
[0112] BLS-Back(Seq.ID.No.13)：37 CGTAGCGCGAACAGACTCGATCGTACTGACCACCTGT 57
[0113] 引物BLS-DNA-嵌合體all添加了用于EcoRI酶的限制性位點（粗體)和Kozak共有序 列（下劃線）;BLS-Back引物添加了用于Nhe頂每的限制性位點(粗體）。
[0114] 使用pETl la-BLS-Stx2B( L5)質(zhì)粒作為模板，通過PCR來擴增此類序列。如實施例2C 所述的進行PCR反應(yīng)。循環(huán)模式為:94°C5分鐘，1個循環(huán);94°C1分鐘，55°C1分鐘和74°C1分 鐘，40個循環(huán)；以及74°C8分鐘，1個最終循環(huán)。將PCR產(chǎn)物用EcoRI酶和NheI酶進行消化，并將 pCI-neo載體用EcoRI和XbaI進行消化。EcoRI/NheI消化按照如下進行：用處于緩沖液 Tango? I X (終濃度）中的5單位NheI(Fermentas Inc.)在37°C進行4小時。然后，根據(jù)式V = A/8(其中，V是待添加的緩沖液的體積，A是反應(yīng)的初始體積），加入5單位EcoRI (Fermentas Inc.)和緩沖液Tango?。在37°C下將消化反應(yīng)物(digestion)再孵育另外3個小時。EcoRI/ XbaI消化用處于緩沖液Tango? 2 X (終濃度）中的4單位EcoRI和4單位XbaI (Fermentas Inc.)在37°C進行4小時。
[0115] 然后，如實施例2C中所描述的實施連接反應(yīng)(NheI和XbaI酶具有兼容的末端）。將 連接物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞中，并利用特異性引物(BLS-DNA-嵌合體all/BLS-Back以及正向/反向5)通過PCR對菌落進行篩選。通過測序?qū)Λ@得的構(gòu)建體進行檢查。在大 腸桿菌DH5a細胞中對pCI-ne〇-BLS_Stx2B(L5)質(zhì)粒進行擴增，并進一步通過"mini prep"柱 (Qiagen，UK)進行純化。DNA的純度和濃度通過分光光度計在260/280nm處進行評估。
[0116] 實施例4
[0117] 通過以下方案構(gòu)建含有具有SEQ ID.No.6的基因的pETlla-BLS-Stx2B-L10(具有 1 〇個氨基酸的接頭)質(zhì)粒：
[0118] a)為了克隆布魯氏菌屬的2,4_二氧四氫蝶啶合酶(BLS)的編碼基因，利用特異性 引物通過PCR擴增從流產(chǎn)布魯氏菌的基因組DNA獲得BLS序列，并克隆到pETl Ia載體 (Novagen，USA)中。為了開發(fā)表達盒，對編碼布魯氏菌屬2，4-二氧四氫蝶啶合酶(BLS)的開 放閱讀框的序列進行定向誘變(Laplagne等，2004.Proteins 57:820-828)。在BLS基因的5' 區(qū)域中插入兩個新的限制性位點：位于5'端的前兩個密碼子中的NsiI位點；以及位于包含 BLS天然氨基酸序列的第8位和第9位殘基的兩個密碼子中的一個Afl II位點。
[0119] b)為了將所編碼的序列插入Stx2B蛋白（SEQ. ID. No. 1)中，我們設(shè)計了包含編碼該 Stx2B蛋白的核苷酸序列的序列，該序列在序列的5'端具有NsiI酶的位點（下劃線），在序列 的3'端具有ΑΠΠ 酶的位點（下劃線），并具有編碼10個氨基酸的接頭的序列(粗體）。
[0120]以pGEM-T載體中的以前克隆的序列為模板，通過PCR獲得Stx2B基因 (Seq.ID.No.2)(Capozzo等，2003.Infect Tmmun 71:3971-3978)〇
[0121] 因此，制備以下寡核苷酸以用作PCR中的引物：
[0122] 正向引物（Seq.ID.No.14):
[0123] 5；ATCAACATGCATGCGGATTGTGCTAAAGGT 3'
[0124] 反向引物 10(Seq.ID.No.l5):
[0125] 5 ' TAAAATCTTAAGAGAACCAGAACCAGAACCAGAACCAGAACCGTCATTATTAAACTGCAC 3 '
[0126] 如實施例2C中所述的進行PCR反應(yīng)。循環(huán)模式為:94°C2分鐘，1個循環(huán);92°C10秒， 68°C12秒和72°C30秒，35個循環(huán)；以及，72°C2分鐘，1個最終循環(huán)。
[0127] 使用瓊脂糖凝膠對PCR產(chǎn)物進行檢查，然后使用Qiagen提取試劑盒(Qiagen，UK)進 行純化。
[0128] c)如實施例2(C)中所述的，用NsiI和Af I