白免疫小鼠組，或者根據(jù)DNA-蛋白初免-加強(qiáng)(prime-boost)程序 免疫小鼠組。在免疫接種后的不同時(shí)間收集血清樣品，并通過ELISA對(duì)特異性IgG的滴度進(jìn) 行測(cè)定。結(jié)果表明，在測(cè)試的所有方案下，即便是在不具有任何外源佐劑的情況下，BLS-Stx2B嵌合體均刺激免疫應(yīng)答（圖8B)。另一方面，DNA-蛋白初免-加強(qiáng)方案較晚地誘發(fā)出 Stx2B特異性抗體（蛋白加強(qiáng)(protein boost)后35天），但在該時(shí)間點(diǎn)達(dá)到了與具有AH的 BLS-Stx2B-L10相同的滴度。就最大滴度和達(dá)到最大滴度的時(shí)間而言，缺乏佐劑的蛋白誘發(fā) 出最低體液應(yīng)答。
[0189] 在0、15和30天，將成年BALB/c小鼠用具有以下物質(zhì)的3個(gè)劑量的BLS-Stx2B-L10進(jìn) 行免疫:弗氏佐劑(FA)(腹膜內(nèi)，i . p.);AH(皮下，s. c.);或無佐劑(NA) (i . p.)。在FA的情況 中，將第一劑與完全FA-起給予，將第二劑與不完全FA-起給予，并將最后一劑在無佐劑的 情況下給予。對(duì)于AH，在室溫下將lmg/ml的懸浮液與BLS-Stx2B-L10混合并伴隨振搖孵育 30min。將AH吸附的抗原以10,000g離心10min，將沉淀重懸于PBS中，并接種到小鼠中。另外， 用處于FA中的BLS和Stx2Bi.p.免疫小鼠組。BLS和BLS-Stx2B-L10的劑量通過它們的分子量 進(jìn)行校正，以接種相比Stx2B而言等摩爾量的各蛋白（劑量等同于20yg Stx2B)。
[0190] 為了初免-加強(qiáng)免疫，在0天、14天和28天通過肌內(nèi)（i.m.)途徑將IOOyg PCI-BLS-Stx2B-L10注射到小鼠后肢中，接著在第40天用處于不完全FA中的BLS-Stx2B-L10實(shí)施最終 的i .P.加強(qiáng)免疫(booster)。
[0191] 在每次免疫之前以及每15或30天，將小鼠麻醉，通過眼眶靜脈叢穿刺（puncture of the retro-orbital plexus)取血，從而獲得血清樣品。
[0192] 通過ELISA分析對(duì)免疫接種小鼠血清樣品中的Stx2B特異性IgG進(jìn)行分析。簡(jiǎn)要來 說，將96孔Maxisorp板（Greiner Bio-One，F(xiàn)rickenhausen,Germany)用0·5yg純化的Stx2B 涂覆，并在37°C下用0.4%BSA(PBS-吐溫0.05%)封閉2h。然后，在37°C下將板與連續(xù)稀釋的 小鼠血清孵育2h。洗滌后，在37°C下將板與稀釋于PBS-Tween 0.05%中的綴合有過氧化物 酶的山羊抗小鼠 IgG(Zymed，Invitrogen，Carisbad，CA，USA) (1:3000)孵育 1 · 5h。將板進(jìn)行 洗滌，并將反應(yīng)物用處于檸檬酸鹽/磷酸鹽緩沖液中的2mg/ml鄰苯二胺(Sigma)和0.3%過 氧化氫進(jìn)行顯影。將反應(yīng)用2M H2SCk終止，并在微量滴定板閱讀器ASYS UVM340(Bi〇chr〇m Ltd. ,Cambridge,England)上對(duì)492nm處的吸光度進(jìn)行測(cè)量。結(jié)果表示為終點(diǎn)滴度，計(jì)算為 具有高于免疫前血清樣品的培養(yǎng)基的光學(xué)密度的最后稀釋度的倒數(shù)值±2X標(biāo)準(zhǔn)差(SD)。
[0193] 實(shí)施例15
[0194] 抗體亞分型（subtyping)和抗體親和力
[0195]除了在初免-加強(qiáng)程序中外，BLS-Stx2B-L10抗原在分析的所有方案中均誘導(dǎo)出比 IgG2a滴度高的抗Stx2B特異性IgGl滴度(？〈0.001)，其中，兩種以6亞類之間不存在顯著差 異（圖9)。對(duì)于IgG亞分型而言，如上所述的，使用綴合有過氧化物酶的山羊抗小鼠 IgGl和 IgG2a(l: 1000) (BD-Pharmigen，New Jersey，USA)作為二抗進(jìn)行ELISA。
[0196] 相比來自用處于FA中的純化的Stx2B免疫的小鼠的血清，來自用FA或AH配制的 BLS-Stx2B-L10免疫的小鼠（如實(shí)施例14中所述）的血清展現(xiàn)出對(duì)Stx2B具有較高親和力的 抗體。在從用無佐劑的BLS-Stx2B-L10免疫的小鼠或初免-加強(qiáng)方案中的小鼠收集的血清 中，觀測(cè)到相似的親和力結(jié)果(表1A)。通過基于硫氰酸鹽洗脫的ELISA測(cè)定免疫小鼠中產(chǎn)生 的抗體的Stx2B親和力。該過程類似于所描述的關(guān)于Stx2B-ELISA的過程，包含一個(gè)額外的 步驟。在與標(biāo)準(zhǔn)化(normal ized)濃度的血清孵育后，對(duì)板進(jìn)行洗滌，并將稀釋于PBS中的硫 氰酸銨(Anedra，San Fernando,Bs.As· ,Argentina)以0-4M的濃度范圍加入到孔中。將板在 室溫下靜置15min，然后對(duì)它們進(jìn)行洗滌，并繼續(xù)進(jìn)行分析。測(cè)定使50%結(jié)合的抗體解離所 需的硫氰酸銨濃度。結(jié)合百分比按照如下進(jìn)行計(jì)算:存在硫氰酸銨時(shí)的OD 492nmX 100/不存在 硫氰酸銨時(shí)的OD492nm。
[0197] 實(shí)施例16
[0198] 針對(duì)重組Stx2(rStx2)的中和滴度
[0199] 為了測(cè)定中和Stx2的抗體滴度，將ICD5q的rStx2(670pg Stx2,殺死50%Vero細(xì)胞 的細(xì)胞毒性劑量)和如實(shí)施例14中免疫的小鼠的實(shí)驗(yàn)血清樣品的連續(xù)稀釋液在37°C下預(yù)孵 育lh，接著在4°C下預(yù)孵育lh。將混合物覆蓋到含有IO 4個(gè)Vero細(xì)胞的各孔，并在37°C下5% CO2中孵育48h。將細(xì)胞用PBS洗滌，用結(jié)晶紫染料染色，并在具有570nm濾光片的微量滴定板 閱讀器(Biochrom Ltd.)上進(jìn)行讀取。中和活性表示為阻斷針對(duì)Vero細(xì)胞的Stx2毒性的 50%的最高稀釋度的倒數(shù)值。
[0200] 來自用FA配制的BLS-Stx2B-L10免疫的小鼠的所有血清顯示出最高的中和滴度(P 〈0.001)。與此相反，來自用單獨(dú)的Stx2B(即便是配制于FA中時(shí)）免疫的小鼠的血清顯示出 最低的中和活性(表1)。
[0201] 表 1
[0203] 林*顯著不同于其它組
[0204] *顯著不同于Stx2B+弗氏佐劑
[0205]表1:來自免疫小鼠的血清的抗體親和力以及中和能力
[0206]抗體親和力以如下表示:使50 %結(jié)合的抗體解離(ELISA測(cè)試中）所需的硫氰酸銨 的摩爾濃度。結(jié)果表示為4-6只小鼠/組的平均值土SEM。
[0207]將來自免疫小鼠（最后一次免疫后45天）的血清在體外與rStx2預(yù)孵育，并如材料 和方法中所詳述的在Vero細(xì)胞上分析其毒性。每個(gè)值表示4-6只小鼠/組的平均值土SEM^P 〈0.05相對(duì)于Stx2B+FA組;***P〈0.001相對(duì)于所有其它免疫接種方案。
[0208] 實(shí)施例17
[0209]小鼠血清的交叉反應(yīng)性
[0210]為了這一目的，將來自產(chǎn)Stx2、或Stx2c變體或Stx2d變體的人分離EHEC株的上清 液與來自用BLS-Stx2B-L10+FA或Stx2B+FA免疫的小鼠（如實(shí)施例14中所述）的血清進(jìn)行孵 育，并評(píng)價(jià)了對(duì)Vero細(xì)胞的毒性。我們還評(píng)價(jià)了針對(duì)重組Stxl (rStxl)的中和能力。來自用 BLS-Stx2B-L10免疫的小鼠的血清強(qiáng)烈中和野生Stx2及其變體以及rStxl。與此形成鮮明對(duì) 比的是，用純化的Stx2B免疫的六只小鼠中，只有從一只小鼠中收獲的血清樣品能夠微弱地 中和野生Stx2,并且它們中沒有一者中和Stx2變體或rStxl (表2)。
[0211]表2
[0213] 表2:針對(duì)純化的rStxl、野生Stx2及其變體的中和滴度。來自用Stx2B或BLS-Stx2B-L10(均用FA配制)免疫的小鼠（最后一次免疫后45天）的血清與1CD50的各Stx在體外 孵育，如材料和方法中所詳述的分析對(duì)Vero細(xì)胞的毒性并表示結(jié)果。每個(gè)值表示6只小鼠/ 組的平均值土 SEM。
[0214] 實(shí)施例18
[0215]保護(hù)免疫小鼠抵抗rStx2激發(fā):離體rStx2中和活性
[0216] 對(duì)于離體分析，將2 · 2ng/小鼠的rStx2(-個(gè)致死劑量100 %，1LD·)與來自如實(shí)施 例14中所免疫的小鼠的血清在37°C下預(yù)孵育lh，并在4°C下預(yù)孵育lh。將該混合物靜脈內(nèi) (i . V.)接種到未經(jīng)處理的(naive)成年BALB/c小鼠中，并對(duì)存活進(jìn)行觀測(cè)。該rStx2劑量導(dǎo) 致注射后96h內(nèi)100%死亡率。如圖IOA中所說明的，rStx2與從在不同方案下用BLS-Stx2B-LlO免疫的小鼠收獲的血清的預(yù)孵育完全消除了rStx2毒性，然而來自Stx2B免疫接種的小 鼠的血清沒有防止rStx2毒性。
[0217] 實(shí)施例19
[0218] 用rStx2進(jìn)行的靜脈內(nèi)激發(fā)和長(zhǎng)期應(yīng)答
[0219] 在最后一次免疫后50天，通過用ILDiqq的rStx2進(jìn)行i . V.接種對(duì)如實(shí)施例14中所免 疫的小鼠進(jìn)行激發(fā)。圖108顯示，100%的此5-5^28-1^10免疫接種小鼠和33%的5以28免疫 接種小鼠在rStx2致死激發(fā)中存活。根據(jù)所使用的rStx2劑量，0 %的用BLS免疫的動(dòng)物或未 免疫小鼠在該激發(fā)中存活(圖IOB)。
[0220]長(zhǎng)期收獲來自存活BLS_Stx2B免疫小鼠的血清，以研究特異性抗體應(yīng)答的持續(xù)時(shí) 間（圖11A)。根據(jù)ELISA抗Stx2抗體評(píng)價(jià)，所有BLS-Stx2B方案均誘導(dǎo)出長(zhǎng)期持久性的免疫應(yīng) 答。在最后一次給藥后8個(gè)月用2LDi〇〇(4.4ng/小鼠）rStx2、并在最后一次給藥后10個(gè)月用 3LDi〇〇(6.6ng/小鼠）rStx2再次激發(fā)(re-challenged)小鼠（圖 11B)。所有BLS-Stx2B-L10免 疫接種小鼠在最后一次免疫給藥后8個(gè)月時(shí)用2LDiqq進(jìn)行的激發(fā)中以及在最后一次免疫給 藥后11個(gè)月時(shí)用3LD 1QQ進(jìn)行的激發(fā)中均得以存活。
[0221] 實(shí)施例20
[0222]由用一劑量BLS-Stx2B_L10進(jìn)行免疫產(chǎn)生的抗體的保護(hù)能力
[0223]為了進(jìn)一步分析由用BLS-Stx2B_L10蛋白免疫所產(chǎn)生的抗體的保護(hù)能力，將成年 BALB/c小鼠用配制在氫氧化鋁中的一劑量BLS-Stx2B-L10(劑量相當(dāng)于20yg Stx2B)進(jìn)行免 疫。將氫氧化鋁凝膠(AH)懸浮液（lmg/ml)與BLS-Stx2B-L10混合并在室溫下伴隨振搖孵育 30分鐘。將AH吸附的抗原以1000 Og離心10分鐘，將沉淀重懸于I 3BS中。在免疫接種后的不同 時(shí)間收集血清樣品，并通過ELI SA測(cè)定特異性I gG的滴度。如實(shí)施例14所述的通過ELI SA測(cè)定 法對(duì)免疫接種小鼠的血清樣品中的Stx2B特異性IgG進(jìn)行分析。
[0224] 圖12顯示，一劑量BLS-Stx2B_L10足以發(fā)展出特異性IgG體液應(yīng)答。
[0225]為了測(cè)試免疫應(yīng)答的保護(hù)能力，在免疫后一個(gè)月，用ILD1OorStU對(duì)小鼠進(jìn)行激發(fā)。 圖13A示出了 BLS-Stx2B-L10免疫接種的小鼠在rStx2致死激發(fā)中100 %存活，而未免疫小鼠 在激發(fā)中0 %存活。
[0226] 在免疫后2個(gè)月和免疫后4個(gè)月，分別以3LD1QQ和5LD1QQ對(duì)存活小鼠進(jìn)行再激發(fā)。圖 13B和圖13C表明，所有小鼠在用高劑量rStx2進(jìn)行的兩次激發(fā)中均能夠存活，這說明由用 BLS-Stx2B-L10進(jìn)行免疫產(chǎn)生的抗體具有高保護(hù)能力。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含與志賀毒素2型的B亞基的單體具有至少95%的氨 基酸序列一致性的肽，所述肽與布魯氏菌屬2，4-二氧四氫蝶啶合酶的單體直接融合或通過 肽接頭融合。2. 如權(quán)利要求1所述的嵌合蛋白，其中，所述肽與布魯氏菌屬2,4_二氧四氫蝶啶合酶的 單體的N末端直接融合或通過肽接頭融合。3. 如權(quán)利要求1或2所述的嵌合蛋白，其中，所述布魯氏菌屬2,4_二氧四氫蝶啶合酶的 單體與SEQ ID No. :9具有至少95%的序列一致性。4. 如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白，其中，所述布魯氏菌屬2,4_二氧四氫蝶啶 合酶的單體在前8個(gè)N末端氨基酸位置內(nèi)具有一個(gè)或多個(gè)替換、刪除和/或插入，使得刪除和 插入的組合并未導(dǎo)致相對(duì)于SEQ ID No. :9而言延長(zhǎng)超過5個(gè)氨基酸。5. 如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白，其中，所述志賀毒素2型的B亞基的單體與 所述布魯氏菌屬2,4_二氧四氫蝶啶合酶的單體的N末端通過肽接頭連接。6. 如權(quán)利要求5所述的嵌合蛋白，其中，所述肽接頭為G/S柔性肽。7. 如權(quán)利要求5或6所述的嵌合蛋白，其中，所述肽接頭的長(zhǎng)度為2-20個(gè)氨基酸。8. 如權(quán)利要求7所述的嵌合蛋白，其中，所述肽接頭的長(zhǎng)度為5-15個(gè)氨基酸。9. 如權(quán)利要求8所述的嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含選自于由以下氨基酸序列所組成 的組中的氨基酸序列：SEQ ID No:3、SEQ ID No:5和SEQ ID No:7。10. 如權(quán)利要求9所述的嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含氨基酸序列SEQ ID N〇:5。11. 包含權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白的五聚體的二聚物的蛋白寡聚復(fù)合 體。12. 編碼權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白的多核苷酸。13. 如權(quán)利要求12所述的多核苷酸，所述多核苷酸包含選自于由以下核苷酸序列所組 成的組中的核苷酸序列：SEQ ID No:4、SEQ ID No:6和SEQ ID No:8。14. 如權(quán)利要求13所述的多核苷酸，所述多核苷酸包含核苷酸序列SEQ ID No:6。15. 包含權(quán)利要求12所述的多核苷酸的載體。16. 如權(quán)利要求15所述的載體，所述載體包含選自于由以下核苷酸序列所組成的組中 的核苷酸序列：SEQ ID No:4、SEQ ID No:6和SEQ ID No:8。17. 如權(quán)利要求12所述的載體，所述載體包含核苷酸序列SEQ ID No:6。18. 包含權(quán)利要求12所述的多核苷酸的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。19. 如權(quán)利要求18所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，其中，所述細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞 或巴斯德畢赤酵母細(xì)胞。20. 如權(quán)利要求19所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，其中，所述細(xì)胞為大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞。21. 如權(quán)利要求19所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，其中，所述細(xì)胞為哺乳動(dòng)物293T細(xì)胞。22. 如權(quán)利要求19所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，其中，所述細(xì)胞為巴斯德畢赤酵母細(xì)胞。23. 包含權(quán)利要求11所述的蛋白寡聚復(fù)合體和/或權(quán)利要求15-17中任一項(xiàng)所述的載體 以及藥學(xué)上合適的賦形劑的藥物組合物。24. 如權(quán)利要求23所述的藥物組合物，其中，所述藥物組合物為疫苗。25. 如權(quán)利要求24所述的藥物組合物，其中，所述寡聚復(fù)合體包含選自于由以下氨基酸 序列所組成的組中的氨基酸序列：SEQ ID No:3、SEQ ID No:5和SEQ ID No:7。26. 如權(quán)利要求25所述的藥物組合物，其中，所述寡聚復(fù)合體包含氨基酸序列SEQ ID No: 5〇27. -種生產(chǎn)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白或權(quán)利要求11所述的蛋白寡聚復(fù) 合體的方法，其中，所述方法包括:a)在適合表達(dá)所述嵌合蛋白的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求18-22中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞;以及b)回收所述嵌合蛋白。28. -種用于生產(chǎn)特異性結(jié)合志賀毒素 2型的B亞基的抗體的方法，所述方法包括以下 步驟： a) 在適于引發(fā)針對(duì)權(quán)利要求11所述的蛋白寡聚復(fù)合體的中和抗體的免疫方案下，向哺 乳動(dòng)物給予所述蛋白寡聚復(fù)合體； b) 從所述哺乳動(dòng)物獲得包含所述中和抗體和/或能夠生產(chǎn)所述中和抗體的細(xì)胞的生物 樣品；以及 c) 將所述生物樣品用作所述抗體的來源。29. 如權(quán)利要求28所述的方法，其中，步驟b)中獲得的所述生物樣品包含B細(xì)胞，將所述 B細(xì)胞用于步驟c)中以生產(chǎn)雜交瘤。30. 如權(quán)利要求29所述的方法，其中，所述哺乳動(dòng)物為小鼠。31. 如權(quán)利要求29所述的方法，其中，所述哺乳動(dòng)物為駱駝科動(dòng)物。32. -種降低哺乳動(dòng)物中的腸出血性大腸桿菌的細(xì)菌負(fù)荷的方法，所述方法包括向期 望降低細(xì)菌負(fù)荷的動(dòng)物給予權(quán)利要求11所述的寡聚復(fù)合體的步驟。33. 如權(quán)利要求32所述的方法，其中，所述哺乳動(dòng)物為牛。34. -種在哺乳動(dòng)物受試者中誘導(dǎo)針對(duì)溶血性尿毒綜合征(HUS)的抵抗力的方法，所述 方法包括向所述哺乳動(dòng)物受試者給予權(quán)利要求24-26中任一項(xiàng)所述的疫苗。35. 供在哺乳動(dòng)物受試者中誘導(dǎo)針對(duì)溶血性尿毒綜合征(HUS)的抵抗力的方法使用的 權(quán)利要求24-26中任一項(xiàng)所述的疫苗。36. 權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白或權(quán)利要求13所述的寡聚復(fù)合體在制備用 于在哺乳動(dòng)物受試者中誘導(dǎo)針對(duì)溶血性尿毒綜合征(HUS)的抵抗力的藥物中的用途。37. 結(jié)合權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋白的抗體。38. 如權(quán)利要求37所述的抗體，其中，所述抗體對(duì)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的嵌合蛋 白而目是特異的。39. 包含權(quán)利要求37或38所述的抗體以及藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體的藥物組合物。40. -種用于在有需要的受試者中預(yù)防或治療溶血性尿毒綜合征(HUS)的方法，所述方 法包括向所述受試者給予權(quán)利要求37或38所述的抗體或權(quán)利要求39所述的藥物組合物的 步驟。41. 如權(quán)利要求40所述的方法，其中，所述受試者為人。42. 權(quán)利要求37或38所述的抗體在制備用于在哺乳動(dòng)物受試者中預(yù)防或治療溶血性尿 毒綜合征(HUS)的藥物中的用途。
【專利摘要】本發(fā)明涉及嵌合多肽，所述嵌合多肽作為用于在哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)針對(duì)志賀毒素(Stx)的保護(hù)性免疫應(yīng)答以及中和抗體的免疫原有用。具體而言，本發(fā)明涉及嵌合多肽以及由所述嵌合多肽形成的寡聚蛋白復(fù)合體，所述嵌合多肽包含與布魯氏菌屬2,4-二氧四氫蝶啶合酶的單體的N末端融合的志賀2毒素的同五聚體B亞基的單體。本發(fā)明還涉及編碼所述嵌合多肽的多核苷酸和載體、包含所述多核苷酸和載體的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞、以及包含所述嵌合多肽和嵌合多核苷酸的藥物組合物(如疫苗)。結(jié)合本發(fā)明的嵌合多肽的抗體、用于獲得特異性結(jié)合志賀2毒素的B亞基的抗體的方法以及降低哺乳動(dòng)物中腸出血性大腸桿菌的細(xì)菌負(fù)荷的方法(所述方法可用于預(yù)防特別是溶血性尿毒綜合征(HUS))也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
【IPC分類】A61K38/16, A61K39/02, A61K39/108
【公開號(hào)】CN105555293
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201480038098
【發(fā)明人】馬丁·迭戈·萊納斯·施帕茨, 費(fèi)爾南多·阿爾貝托·哥德巴姆, 瓦妮莎·孜勒比曼, 帕特里西·奧利弗·克雷格, 吉塞爾·蓋爾斯, 瑪麗娜·桑德拉·巴勒莫, 瑪麗亞·皮拉爾·梅希亞斯, 萊蒂西亞·維羅妮卡·本坦科
【申請(qǐng)人】英母拓公司, 馬丁·迭戈·萊納斯·施帕茨
【公開日】2016年5月4日
【申請(qǐng)日】2014年5月26日
【公告號(hào)】CA2913702A1, EP3003348A1, US20160115459, WO2014191903A1, WO2014191904A1