葉酸特異性靶向活化態(tài)肝星狀細胞的聚合物納米載體及其藥用用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于藥物輸送領(lǐng)域。具體設(shè)及一種祀向活化態(tài)肝星狀細胞的聚合物納米載 體及其制備和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 我國是肝纖維化、肝硬化、肝癌等肝臟疾病的高發(fā)區(qū)，其肝癌發(fā)病率和死亡率都超 過了全球的50%。肝硬化和肝癌的發(fā)病率呈正相關(guān)關(guān)系，肝纖維化作為肝硬化的前期重要 病癥，受到越來越多研究者關(guān)注。肝纖維化的形成設(shè)及到肝細胞化C)、肝星狀細胞化SC)、陷 窩細胞、庫普弗細胞化C)和肝竇內(nèi)皮細胞(SLEC)等，而靜止態(tài)向肌纖維化樣活化態(tài)轉(zhuǎn)變后 的肝星狀細胞化epatic stellate cell,HSC)被認為是肝纖維化起始過程的中屯、環(huán)節(jié)。隨 著細胞學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展和應(yīng)用，WHSC為祀點來研發(fā)抗肝纖維化藥物成為肝病治療 領(lǐng)域的熱點。已相繼有人嘗試紫杉醇、姜黃素、NO類等藥物來抑制活化態(tài)HSC的增殖和ECM的 沉積，也有采用RNAi技術(shù)針對I型膠原蛋白基因進行沉默的成功報道。
[0003] 無論是化學(xué)藥物還是基因藥物，它們大多或者水溶性差、藥效低下、價格不菲，或 者穩(wěn)定性低、在體內(nèi)容易被降解;而且其作用的非特異性，常常導(dǎo)致低藥效、高毒副作用。運 些問題的存在都極大地限制它們在臨床中的應(yīng)用。W納米載體系統(tǒng)載送藥物不僅可解決藥 物難溶性和穩(wěn)定性低的問題，還可W通過EPR效應(yīng)有效地使藥物在肝臟部位富集、改善細胞 對藥物的攝取。近年來已有一些納米載體藥物系統(tǒng)用于肝纖維化、肝硬化和肝癌的診斷和 治療的報道，成功載送了肝臟生長因子化GF)、N0藥物及中草藥等至纖維化小鼠肝臟；國內(nèi) 李玉娟等人也研發(fā)了 W多聚體和脂質(zhì)體為主的納米載送顆粒、嘗試對肝纖維化和肝癌的治 療。然而，運些納米粒子載體都不能有效地祀向性作用于活化服C-運一類主要的導(dǎo)致肝纖 維化的細胞;過量的納米粒子對肝臟形成毒性。與普通藥物治療相比，HSC細胞特異性的祀 向藥物載體能夠延長藥物的體循環(huán)時間、提高藥物在HSC中的富集、而且可降低藥物劑量、 進一步減少毒副作用，是目前肝纖維化治療中亟待發(fā)展的一類藥物載體系統(tǒng)。
[0004] 目前可特異性作用于HSC藥物載體主要有幾種：如甘露糖6憐酸人血清白蛋白 (16口-服4)脂質(zhì)體，參見：4化1曰11]\6.,?0613付3 1(.,5油61'曲(^6丄.，6131.1]116腳。1：；[0]1 of targeted liposomes with primary cultured hepatic stellate cells: Involvement of multiple receptor systems[J].Journal of hepatology,2006,44(3): 560-7;含有RGD序列環(huán)膚祀向長循環(huán)脂質(zhì)體(RGD-SSL)，參見:Du S丄.，Pan H. ,Lu W.Y.，et al.Cyclic Arg-Gly-Asp peptide-labeled liposomes for targeting drug therapy of hepatic fibrosis in rats[J]. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics , 2007,322(2): 560-8;偶聯(lián)維生素 A的聚合物納米載體，參見:Duong H. T., Dong Z.,Su L.,et 曰I.The use of nanoparticles to deliver nitric oxide to hep曰tic stell曰te cells for tre曰ting liver fibrosis 曰nd port曰I hypertension
[J].Small, 2015,11(19) :2291-304;偶聯(lián)識別血小板衍生生長因子受體的環(huán)膚共聚物，參 見：Bansal R.,Prakash J.,Post E.,et al.Novel engineered targeted interferon-gamma blocks hepatic fibrogenesis in mice[J].Hepatology,2011,54(2):586-96。運 四者都W肝星狀細胞表達的受體為祀位點，利用受體配體間的特異性結(jié)合實現(xiàn)對HSC的主 動祀向。但是，前兩種載體所識別的受體均在其他細胞中有所表達，導(dǎo)致載體在祀向肝星狀 細胞過程中也作用于其它正常細胞;且配體制備過程較為復(fù)雜、成本高昂，不利于臨床進一 步研究和利用。此外，靜止態(tài)HSC也大量攝取維生素 A，因此維生素 A修飾的載體系統(tǒng)不具備 對活化態(tài)HSC的特異性作用。而能特異性識別血小板衍生生長因子受體的環(huán)膚共聚物，其合 成困難、成本高昂。因此，開發(fā)一種特異性祀向活化態(tài)HSC的高效、低毒性、低成本的藥物載 體對肝纖維化的研究和治療有著積極而重要的意義。
[0005] 葉酸受體是一種腫瘤細胞表面高表達而正常細胞低表達的糖蛋白，作為其特異性 配體的葉酸，具有分子量低、易化學(xué)修飾、穩(wěn)定性好、無免疫原性、和受體親和性強W及成本 低廉等突出優(yōu)點。因此，葉酸漸漸成為腫瘤祀向的理想配體，近年來在藥物祀向輸送、癌癥 治療等領(lǐng)域引起了廣泛的關(guān)注。我們研究組發(fā)現(xiàn)，與靜止的肝星狀細胞相比，快速增殖的活 化態(tài)肝星狀細胞中葉酸受體的表達顯著增強；和腫瘤組織間質(zhì)類似，肝纖維化部位由于活 化肝星狀細胞旺盛的糖酵解而產(chǎn)生大量代謝酸性產(chǎn)物，使肝纖維化細胞間質(zhì)pH呈弱酸性 等。運些生理學(xué)上的類似特征啟發(fā)我們采用偶聯(lián)葉酸的聚合物納米膠束實現(xiàn)對活化態(tài)HSC 進行主動祀向。目前，尚未有特異性祀向肝星狀細胞的偶聯(lián)葉酸配體聚合物納米載體的相 關(guān)報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 鑒于現(xiàn)有技術(shù)的W上不足，本發(fā)明的目的在于，克服現(xiàn)有作用于活化態(tài)肝星狀細 胞藥物載體的不足，提供一種新型的、具有特異性祀向活化態(tài)肝星狀細胞功能的聚合物納 米載體。
[0007] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用一種葉酸祀向的聚合物納米載體，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如 下：
式中，n = 41~50,m=12~14。所述納米載體為球形，粒徑均勻且平均粒徑為50-60nm。
[0009] 所述葉酸祀向活化態(tài)肝星狀細胞的聚合物納米載體為納米膠束，其親水段材料為 聚乙二醇，其分子量為1800~2200，疏水段材料為聚己內(nèi)醋，其分子量為1368~1596。
[0010] 所述納米膠束粒徑較小，分布均勻，具有良好的穩(wěn)定性和生物相容性，可W有效地 祀向肝纖維化部位從而實現(xiàn)富集給藥。
[0011] 本發(fā)明的另一目的是將上述聚合物納米膠束用于特指的藥用用途，即：
[0012] 葉酸祀向活化態(tài)肝星狀細胞的聚合物納米膠束的藥用用途，在所述聚合物納米膠 束疏水段形成的內(nèi)核包覆尼羅紅等疏水性巧光染料和疏水性抗纖維化藥物，進而考察偶聯(lián) 葉酸配體的聚合物納米載體對活化態(tài)肝星狀細胞的祀向效果和藥物作用，用作肝纖維化的 祀向治療和研究。本發(fā)明所述的納米膠束結(jié)構(gòu)是核殼結(jié)構(gòu)，外殼的親水段末梢接枝祀向配 體，內(nèi)核的疏水段可包覆疏水性巧光染料及抗纖維化藥物。
[0013] 本發(fā)明提供了一種特異作用于活化態(tài)肝星狀細胞的聚合物納米載體的制備和應(yīng) 用。我們首次發(fā)現(xiàn)，在由靜息態(tài)到肌纖維化樣活化態(tài)的轉(zhuǎn)型過程中，肝星狀細胞中a型葉酸 受體的表達顯著增強。進一步制備葉酸偶聯(lián)的聚合物納米膠束載體，我們成功實現(xiàn)了其對 活化態(tài)的原代大鼠肝星狀細胞及細胞株的特異性祀向。本發(fā)明所述的藥物納米載體系統(tǒng)采 用聚乙二醇為親水段材料，確保其對血液循環(huán)中蛋白質(zhì)吸附和細胞粘附的抵抗；W聚己內(nèi) 醋為疏水段材料成核，便于多種疏水性抗纖維化藥物及巧光染料的裝載。偶聯(lián)于PEG外殼上 的葉酸則保證載體系統(tǒng)對活化態(tài)肝星狀細胞表面的葉酸受體進行特異性地識別，最終有效 地提高藥物的利用率并降低其毒副作用。
【附圖說明】：
[0014] 圖1為本發(fā)明所用原代大鼠肝星狀細胞(HSC)靜息態(tài)到活化態(tài)mRNA表達量變化。其 中：圖1 (a)為aSMA的mRNA變化量，圖1 (b)為Co 1 Iagen Ia 1的mRNA變化量，圖1 (C)為FR-a的 mRNA變化量。
[001引圖2為本發(fā)明所用FA-PEG-PCL聚合物材料合成路線圖。
[0016]圖3為本發(fā)明所用FA-PEG-PCL聚合物材料Ih-NMR圖譜。
[0017 ]圖4為本發(fā)明所用FA-PEG-PCL納米膠束粒徑分布。
[0018]圖5為本發(fā)明所用FA-PEG-P化納米膠束透射電鏡照片。
[0019 ]圖6為本發(fā)明所用FA-PEG-PCL納米膠巧臨界膠束濃度現(xiàn)慢曲線。
[0020]圖7為本發(fā)明所用納米膠束對服C-T6細胞毒性實驗。
[0021 ]圖8為本發(fā)明所用服C-T6細胞攝取包覆尼羅紅納米膠束巧光照片。
[0022] 圖9為本發(fā)明所用HSC-T6細胞攝取包覆尼羅紅納米膠束流式細胞儀定量分析。
[0023] 圖10為本發(fā)明所用服C細胞攝取包覆尼羅紅納米膠束巧光照片。
[0024] 圖11為本發(fā)明所用HSC細胞攝取包覆尼羅紅納米膠束流式細胞儀定量分析。
【具體實施方式】
[0025] 基于開發(fā)一種新型、高效、低毒性、低成本并能特異性祀向HSC的藥物載體，使之對 肝纖維化的治療具有明確的祀向效果的發(fā)明目的，設(shè)計了祀向環(huán)境和效率、聚合物材料的 制備和評價、聚合物納米膠束的獲取實驗環(huán)節(jié)?？紤]到尼羅紅(Nile Red)作為一種獨特的 疏水性巧光染料，在水溶液中巧光強度非常低，而在疏水環(huán)境中會發(fā)出強烈巧光，在細胞成 像、生物診斷及檢測等應(yīng)用非常廣泛。此外，尼羅紅在分子量、親疏水性W及藥物穩(wěn)定性等 方面與疏水性藥物非常相似，是一種非常理想的巧光標記染料和疏水性藥物模型，所W我 們采用尼羅紅作為巧光染料和疏水性藥物模型來驗證偶聯(lián)葉酸配體聚合物納米載體對活 化態(tài)肝星狀細胞的祀向性和藥物作用。并W尼羅紅為疏水性藥物模型和祀向效果檢測標識 進行定性和定量評價。將上述內(nèi)容構(gòu)成實施例，下面結(jié)合各實施例和附圖做進一步說明。
[0026] 實施例1
[0027] 原代大鼠肝星狀細胞化SC)的分離和培養(yǎng)
[0028] 采用原位灌注法消化大鼠肝臟，對消化分離得到的原代大鼠肝星狀細胞采用高糖 DMEM培養(yǎng)基(含15 % -20 % FBS，1 %雙抗P/S)置于37 °C，5 % C〇2細胞解箱中培養(yǎng)。
[0029] 實施例2
[0030]活化態(tài)大鼠肝星狀細胞化SC-T6)的培養(yǎng)
[0031 ] 對HSC-T6細胞進行復(fù)蘇傳代后加入高糖DMEM培養(yǎng)基(含10 % FBS，1 %雙抗P/S)后 置于37°C，5%C02細胞解箱中培養(yǎng)。
[0032] 實施例3
[0033] 原代大鼠肝星狀細胞(HSC)由靜息態(tài)到活化態(tài)aSMAXollagenlal、FR-a的mRNA表 達量變化分析
[0034] 采用原位灌注法消化大鼠肝臟，對消化分離得到的原代大鼠肝星狀細胞在24孔板 中培養(yǎng)7天，其后吸除24孔板培養(yǎng)