基，PBS洗兩遍并吸棄PBS。采用Axygen試劑盒提取原代大 鼠肝星狀細(xì)胞RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和QPCR儀將RNA逆轉(zhuǎn)錄為CDNA并稀釋，其后進行PCR， 分析aSMA、Co 11 agen 1 a 1和FR-a的mRNA表達量的變化。mRNA表達量變化如圖1 (a、b、C)。
[0035] 實施例4
[0036] 納米膠束載體材料FA-PEG-P化或者陽G-P化的制備
[0037 ] (1)雙端簇基化的聚乙二醇(C00H-PEG-C00H)的制備
[0038] 將PEG2000、下二酸酢、氯仿混合，油浴加熱至70度反應(yīng)4她。其后在反應(yīng)液中加入 去離子水萃取，重復(fù)兩次，有機層用無水硫酸鋼干燥過夜，過濾、旋蒸除去氯仿，最后加適量 冰乙酸沉淀過濾干燥，得到雙端簇基化的聚乙二醇(C00H-PEG-C00H)。
[0039] (2)單端簇基化的聚乙二醇(Boc-PEG-COOH)的制備
[0040] 將雙端簇基化陽G、抓C. HCL、DMAP和二氯甲燒混合，反應(yīng)體系置于冰水浴中，然后 向其滴加 N-叔下氧幾基乙二胺的二氯甲燒溶液，冰浴條件下攬拌過夜。旋蒸加冰乙酸沉淀， 過濾干燥得到單端簇基化的聚乙二醇(Boc-PEG-COOH)。
[0041] (3)二碳酸二叔下醋保護的聚己內(nèi)醋(Boc-PCL)的制備
[0042] 快速稱取N-叔下氧幾基乙二胺、蒸饋純化的己內(nèi)醋單體、氯化亞錫置于單頸瓶中， 抽真空，40度加熱攬拌化，其后置于140度反應(yīng)化。向反應(yīng)液中加入冰乙醇沉淀過濾，真空干 燥得到N-叔下氧幾基乙二胺聚己內(nèi)醋(Boc-P化）。
[0043] (4)單端氨基化聚己內(nèi)醋(N出一P化)的制備
[0044] 稱取N-叔下氧幾基己內(nèi)醋溶于二氯甲燒，加入S氣乙酸并攬拌化，旋蒸除去S氣 乙酸，加飽和碳酸氨鋼水調(diào)至抑為中性，過濾并用去離子水洗兩次，有機層用無水硫酸鋼干 燥過夜，過濾，旋蒸除去二氯甲燒，加冰乙醇沉淀過濾，真空干燥得到單端氨基化聚己內(nèi)醋 (畑2-P化）。
[0045] (5)二碳酸二叔下醋封端的聚乙二醇一聚己內(nèi)醋(PEG-PCL)的制備
[0046] 稱取Boc-陽G-COOH、畑2-P化、抓C. H化、DMAP溶于二氯甲燒并攬拌過夜。其后將 反應(yīng)液旋干，加適量冰乙酸沉淀過濾，真空干燥7化得到產(chǎn)物二碳酸二叔下醋保護的聚乙二 醇一聚己內(nèi)醋(PEG-P化）。
[0047] (6)單端氨基化的聚乙二醇一聚己內(nèi)醋(N出一陽G-PCL)的制備
[004引稱取Boc-PEG-PCL溶于二氯甲燒，加入S氣乙酸并攬拌化，旋蒸除去S氣乙酸， 加飽和碳酸氨鋼水調(diào)至pH為中性，過濾并用水洗兩次，有機層用無水硫酸鋼干燥過夜，過 濾，旋蒸除去二氯甲燒，加適量冰乙酸沉淀過濾，干燥得到單端氨基化的聚乙二醇一聚己內(nèi) 醋（畑2-陽 G-PCL )。
[0049] (7)偶聯(lián)葉酸的聚乙二醇一聚己內(nèi)醋(FA-PEG-P化)的制備
[0050] 稱取葉酸、EDC.肥L、N服溶于DMSO，避光過夜反應(yīng)，其后向其中加入畑2-陽G-PCL 反應(yīng)4她。其后將產(chǎn)物置于透析袋中（MW=1000 )中避光透析4她，冷凍干燥得到淡黃色固體 FA-PEG-P 化。
[0051 ]上述具體合成步驟見圖2。
[0052] 實施例5
[0053] 聚合物納米膠束的制備
[0054] 稱取5mg聚合物材料完全溶解于5mL四氨巧喃(THF)中，利用注射器將其緩慢滴加 至適量攬拌速度的去離子水中，然后置于通風(fēng)楓中待四氨巧喃完全揮發(fā)后，收集樣品待用。 [00巧]實施例6
[0056] 聚合物納米膠束載體材料結(jié)構(gòu)的表征
[0057] 所制備的聚合物納米膠束載體材料結(jié)構(gòu)的表征采用Ih-NMR分析，將適量待測樣品 溶于気代DMSO中，W四甲基硅烷為內(nèi)標(biāo)，通過核磁共振譜儀檢測各樣品中氨質(zhì)子的位移，核 磁測試結(jié)果見圖3。
[005引 實施例7
[0059] 聚合物納米膠束粒徑測試
[0060] 制備濃度為Img/ml的FA-PEG-P化納米膠束，通過動態(tài)光散射儀進行測試，粒徑測 試結(jié)果見圖4。
[0061] 實施例8
[0062] 聚合物納米膠束形貌觀察
[0063] 制備濃度為Img/ml的FA-PEG-P化納米膠束，滴加一滴濃度為Img/ml的膠束溶液至 碳膜銅網(wǎng)正面，保持60s后，用濾紙洗掉多余液體，滴加一滴2.5wt %的憐鶴酸水溶液負(fù)染 60s，吸掉多余染料，待液體揮干后進行投射電子顯微鏡觀察，投射電鏡照片見圖5。
[0064] 實施例9
[0065] 聚合物納米膠束臨界膠束濃度(CMC)的測試
[0066] 稱取適量的巧，配置成巧的甲醇溶液，移取50iil至一系列25ml的容量瓶中，待甲醇 揮發(fā)完全后，容量瓶定容配置成一系列不同濃度的膠束溶液，濃度從8Xl(T 5mol/L到IX 10 ^mol/L。采用巧光分光光度計測定巧的激發(fā)光譜，固定發(fā)射波長為390nm，峰寬為6nm，激發(fā) 波長分別為33化m和33：3nm，按I333/I339-lgC作圖，突變點即為膠束的CMC,經(jīng)計算CMC = 1.55 X lO^mg/ml ,CMC測試結(jié)果見圖6。
[0067] 實施例10
[0068] 聚合物納米膠束毒性實驗
[0069] 將大鼠肝纖維化細(xì)胞化SC-T6) W5 X 10^孔接種于96孔板上，于37°C，5 %C〇2細(xì)胞 解箱中貼壁生長24h后，加入濃度范圍從IOyg/血至500iig/mL的FA-PEG-P化和陽G-P化納米 膠束溶液繼續(xù)培養(yǎng)24h，加入CCK-8試劑，用酶標(biāo)儀檢測吸光度值，測試結(jié)果見圖7。
[0070] 實施例11
[0071] 包覆尼羅紅聚合物納米膠束的制備
[0072] 稱取5mg聚合物材料和適量尼羅紅（聚合物材料與尼羅紅的質(zhì)量比為1:10~1: 100)完全溶解于5mL四氨巧喃中，利用注射器將其緩慢滴加至適量攬拌速度的蒸饋水中，然 后置于通風(fēng)楓中待有機溶劑完全揮發(fā)后，轉(zhuǎn)移到透析袋(MW=1000 )在去離子水中透析48h， 再將所制備的聚合物納米膠束過濾，收集樣品待用。
[0073] 實施例12
[0074] 服C-T6細(xì)胞攝取包覆尼羅紅聚合物納米膠束巧光顯微鏡觀察
[007引將HSC-T6細(xì)胞W 5 X 10^孔接種于24孔板上，于37 °C，5 % C02細(xì)胞解箱中貼壁生長 24h后，加入包覆尼羅紅聚合物納米膠束繼續(xù)培養(yǎng)化，用PBS洗兩次，加入2.5 %的戊二醒固 定0.化，用PBS洗兩次，加入DAPI (1:600，V/V)約5min，再吸走DAPI，清洗兩次后加適量PBS避 光保存，利用巧光顯微鏡觀察HSC-T6細(xì)胞攝取包覆尼羅紅的葉酸祀向納米膠束(FA-PEG-PCL)及包覆尼羅紅的無葉酸祀向納米膠束(PEG-P化)巧光分布，巧光照片結(jié)果見圖8。
[0076] 實施例13
[0077] 服C-T6細(xì)胞攝取包覆尼羅紅聚合物納米膠束定量分析
[007引將HSC-T6細(xì)胞W5 X IO5/孔接種于6孔板上，于37°C，5 %C02細(xì)胞解箱中貼壁生長 24h后，加入包覆尼羅紅聚合物納米膠束繼續(xù)培養(yǎng)化，用PBS洗兩次，加入30化1膜酶消化下 貼壁細(xì)胞，然后加一定量培養(yǎng)基終止消化，將細(xì)胞離屯、收集于流式管，利用流式細(xì)胞儀檢測 HSC-T6細(xì)胞攝取包覆尼羅紅的葉酸祀向納米膠束(FA-PEG-P化)及包覆尼羅紅的無葉酸祀 向納米膠束(PEG-P化)巧光強度，流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)見圖9。
[0079] 實施例14
[0080] HSC細(xì)胞攝取包覆尼羅紅聚合物納米膠束巧光顯微鏡觀察
[0081] 采用原位灌注法消化大鼠肝臟，對消化分離得到的原代大鼠肝星狀細(xì)胞化SC)接 種于24孔板上，于37 °C，5 % C〇2細(xì)胞解箱中貼壁生長7天后，加入包覆尼羅紅聚合物納米膠 束繼續(xù)培養(yǎng)化，用PBS洗兩次，加入2.5 %的戊二醒固定0 .化，用PBS洗兩次，加入DAPI (1: 600，V/V)約5min，再吸走DAPI，清洗兩次后加適量PBS避光保存，利用巧光顯微鏡觀察HSC細(xì) 胞攝取包覆尼羅紅的葉酸祀向納米膠束(FA-PEG-P化)及包覆尼羅紅的無葉酸祀向納米膠 束(PEG-P化)巧光分布，巧光照片結(jié)果見圖10。
[0082] 實施例15
[0083] HSC細(xì)胞攝取包覆尼羅紅聚合物納米膠束定量分析
[0084] 采用原位灌注法消化大鼠肝臟，對消化分離得到的原代大鼠肝星狀細(xì)胞化SC)接 種于6孔板上，于37°C，5 %C〇2細(xì)胞解箱中貼壁生長7天后，加入包覆尼羅紅聚合物納米膠束 繼續(xù)培養(yǎng)化，用PBS洗兩次，加入30化1膜酶消化下貼壁細(xì)胞，然后加一定量培養(yǎng)基終止消 化，將細(xì)胞離屯、收集于流式管，利用流式細(xì)胞儀檢測HSC細(xì)胞攝取包覆尼羅紅的葉酸祀向納 米膠束(FA-PEG-P化)及包覆尼羅紅的無葉酸祀向納米膠束(PEG-P化)巧光強度，流式細(xì)胞 儀數(shù)據(jù)見圖11。
【主權(quán)項】
1. 一種葉酸祀向活化態(tài)肝星狀細(xì)胞的聚合物納米載體，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：式中，n = 41 ~50,m=12 ~14; 所述納米載體為球形，粒徑均勻且平均粒徑為50-60nm。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的葉酸祀向活化態(tài)肝星狀細(xì)胞的聚合物納米載體為納米膠束， 其特征在于，所述納米膠束親水段材料為聚乙二醇，其分子量為1800~2200,疏水段材料為 聚己內(nèi)醋，其分子量為1368~1596。3. 權(quán)利要求1或2所述的葉酸祀向活化態(tài)肝星狀細(xì)胞的聚合物納米膠束的藥用用途，其 特征在于，用作W葉酸作為祀向性配體的祀向活化態(tài)肝星狀細(xì)胞的藥物載體系統(tǒng)。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的藥用用途，其特征在于，在所述聚合物納米膠束內(nèi)核的疏水段 包覆疏水性抗纖維化藥劑。
【專利摘要】本發(fā)明提供了葉酸特異性靶向活化態(tài)肝星狀細(xì)胞的聚合物納米載體及其藥用用途。在由靜息態(tài)到肌纖維化樣活化態(tài)的轉(zhuǎn)型過程中，肝星狀細(xì)胞中α型葉酸受體的表達顯著增強。進一步制備葉酸偶聯(lián)的聚合物納米膠束載體，我們成功實現(xiàn)了其對活化態(tài)的原代大鼠肝星狀細(xì)胞及細(xì)胞株的特異性靶向。本發(fā)明所述的藥物納米載體系統(tǒng)采用聚乙二醇為親水段材料，確保其對血液循環(huán)中蛋白質(zhì)吸附和細(xì)胞粘附的抵抗；以聚己內(nèi)酯為疏水段材料成核，便于多種疏水性抗纖維化藥物及熒光染料的裝載。偶聯(lián)于PEG外殼上的葉酸則保證載體系統(tǒng)對活化態(tài)肝星狀細(xì)胞表面的葉酸受體進行特異性地識別，最終有效地提高藥物的利用率并降低其毒副作用。
【IPC分類】A61K9/51, A61K45/06, A61K47/34, A61K47/22, A61P1/16, A61K9/107
【公開號】CN105560180
【申請?zhí)枴緾N201610018293
【發(fā)明人】陳渝萍, 程江, 張艷軍, 汪辛
【申請人】西南交通大學(xué)
【公開日】2016年5月11日
【申請日】2016年1月12日