成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21在治療腎纖維化中的應(yīng)用
【專(zhuān)利說(shuō)明】成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21在治療腎纖維化中的應(yīng)用
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明涉及成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21的一種新用途，即成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21在治療腎纖維化中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0003]腎纖維化是各種慢性腎臟疾病進(jìn)展至終末期腎衰竭的共同轉(zhuǎn)歸及主要的病理基礎(chǔ)，是嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的重要疾病之一。腎間質(zhì)纖維化是以細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，如膠原1、
I1、II1、IV型、纖維連接蛋白、層連蛋白，在腎間質(zhì)過(guò)多的積聚及腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞增生為主要特征。阻止和逆轉(zhuǎn)腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展是治療CKD、控制腎功能衰竭的關(guān)鍵。腎間質(zhì)纖維化的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，包括炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化等。
[0004]近年來(lái)學(xué)術(shù)界對(duì)氧化應(yīng)激在腎間質(zhì)纖維化中的作用展開(kāi)了深入的研究。氧化應(yīng)激反應(yīng)是腎間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，在腎間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展的全過(guò)程中都起著重要作用。纖維化始動(dòng)階段:各種能導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化的始動(dòng)因素如炎癥、剪應(yīng)力、低氧、細(xì)胞因子都會(huì)影響腎臟固有細(xì)胞(腎小管上皮細(xì)胞，腎小球系膜細(xì)胞等)及炎癥浸潤(rùn)細(xì)胞(巨噬細(xì)胞等)的氧化還原狀態(tài)，刺激上述細(xì)胞產(chǎn)生大量ROS AOS與細(xì)胞膜上的碟脂、核酸等大分子物質(zhì)形成脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物(LPO)，直接損傷腎臟固有細(xì)胞導(dǎo)致腎臟細(xì)胞凋亡、肥大或轉(zhuǎn)分化，促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化發(fā)生;纖維化發(fā)展階段:上游刺激因素導(dǎo)致各種致纖維化信號(hào)產(chǎn)生后，需要ROS作為重要的第二信使，傳遞和放大各種致纖維化信號(hào)。研究表明:ROS可介導(dǎo)趨化因子(如MCP-1、ICMA-1等)大量釋放，并促進(jìn)炎性細(xì)胞在腎臟聚集；ROS也可誘導(dǎo)血管緊張素 Π (Ang1tenin Π , Ang Π )、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β? (Transforming Growth Factor-β,TGF-β)等致纖維化關(guān)鍵細(xì)胞因子的產(chǎn)生并進(jìn)一步介導(dǎo)其下游的致纖維化效應(yīng)。
[0005]目前臨床上缺少有效治療腎間質(zhì)纖維化的藥物，治療的措施主要在于控制原發(fā)疾病及惡化因素，如降血糖、降血壓、控制感染、調(diào)血脂、攝入優(yōu)質(zhì)蛋白飲食及改善腎臟局部的微循環(huán)等。但這些方式都只能很有限地緩解疾病的發(fā)展，當(dāng)腎臟損傷發(fā)展到腎纖維化不可逆轉(zhuǎn)階段時(shí)，患者只能通過(guò)血液、腹膜透析或腎移植來(lái)進(jìn)行腎臟替代治療維持生命。臨床上大多數(shù)CKD患者出現(xiàn)了臨床癥狀后再來(lái)尋求藥物治療，此時(shí)腎臟已存在不同程度的纖維化病變。因此探討藥物對(duì)已形成的纖維化病變的治療作用更具有臨床意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21在治療腎纖維化中的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明還保護(hù)一種治療和/或預(yù)防腎纖維化的藥物，其活性成分為成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21。所述藥物還包括其它藥學(xué)上可接受的載體或輔料。所述藥物中，除了所述活性成分外，可以添加藥學(xué)上允許的賦形劑、填充劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載體、增效劑和添加劑等。所述藥物的給藥形態(tài)可為針劑(如粉劑、水劑、油劑)。所述制劑都可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知常用的制備方法而獲得。所述藥物的給藥途徑可為皮下注射、靜脈注射或肌肉注射。
[0008]以上任一所述成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21為如下(a)或(b):
(a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
(b)將序列I的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有治療和/或預(yù)防腎纖維化的功能的由序列I衍生的蛋白質(zhì)。
[0009]所述成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21對(duì)腎纖維化的治療作用體現(xiàn)為(Cl)至(c7)中的至少一種:
(Cl)抑制腎纖維化程度；
(c2)抑制腎纖維化發(fā)生；
(c3)降低腎臟中膠原纖維和/或肌纖維的水平；
(c4)降低腎臟中24小時(shí)尿白蛋白，血清肌酸酐及血清尿素氮的水平；
(c5)降低腎臟中I型膠原蛋白和/或α-平滑肌肌動(dòng)蛋白的水平；
(c6 )降低腎臟中Co IIV和/或FN的水平；
(c7)降低腎臟中TGF-β和/或磷酸化Smad2/3的水平；
以上任一所述成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21具體可采用包括如下步驟的方法制備:
(1)表達(dá)所述成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21與分子伴侶的融合蛋白；
(2)收集所述融合蛋白，切除所述分子伴侶后得到所述成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21。
[0010]所述分子伴侶具體可為分子泛素樣修飾蛋白(即分子伴侶SUM0)。
[0011]所述“表達(dá)所述成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21與分子伴侶的融合蛋白”的實(shí)現(xiàn)方法如下:將所述成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21的編碼基因插入原核表達(dá)載體pSUMO，得到重組質(zhì)粒;將所述重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌Rosetta(DE3)，得到重組菌;發(fā)酵所述重組菌并采用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，得到所述融合蛋白。
[0012]所述“切除所述分子伴侶”的實(shí)現(xiàn)方式如下:取所述融合蛋白，用SUMO蛋白酶I(SUM0蛋白酶I與融合蛋白的摩爾比具體可為1: 50)和DTT(所述DTT的初始濃度可為2mmol/L)切割(切割條件具體可為4°C切割過(guò)夜)。
[0013]所述成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21的編碼基因具體可為如下I)或2)或3)的DNA分子:
1)序列表中序列2所示的DNA分子；
2)在嚴(yán)格條件下與I)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能的蛋白的DNA分子；
3)與I)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼具有相同功能的蛋白的DNA分子。
[0014]所述嚴(yán)格條件為在0.1 X SSPE(或0.1XSSC)、0.1% SDS的溶液中，65°C條件下雜交并洗膜。
[0015]本發(fā)明發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-21能夠有效抑制腎纖維化的發(fā)生，可作為藥物治療和/或預(yù)防腎纖維化，對(duì)于腎纖維化的治療和預(yù)防具有重大價(jià)值。
【附圖說(shuō)明】
[0016]圖1為FGF-21溶液的聚丙烯凝膠電泳圖。
[0017]圖2為HE染色和Masson染色結(jié)果。
[0018]圖3為Masson染色的表面密度。
[0019]圖4為24小時(shí)尿蛋白，血清肌酸酐及血清尿素氮結(jié)果。
[0020]圖5為ColI基因，a-SMA基因，I型膠原蛋白基因和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白基因蛋白的表達(dá)水平，I型膠原蛋白和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白相對(duì)β-actin的蛋白水平。
[0021 ] 圖6為，Co IIV基因和FN基因的表達(dá)水平和含量。
[0022]圖7為T(mén)GF-β基因的表達(dá)水平，TGF-β蛋白相對(duì)β-actin蛋白的蛋白水平和磷酸化Smad2/3蛋白相對(duì)Smad2/3蛋白的蛋白水平。
[0023]圖8為HIPK2相對(duì)β-act in的蛋白水平。
【具體實(shí)施方式】
[0024]以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買(mǎi)得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。
[0025]FGF-21蛋白的，簡(jiǎn)稱(chēng)FGF-21，如序列表的序列I所示。FGF-21的編碼基因如序列表的序列2所示。
[0026]原核表達(dá)載體pSUMO(在文獻(xiàn)中被稱(chēng)為“pHisSUMO”):參考文獻(xiàn):姜媛媛，尹成凱，李晉南，任桂萍，張薇，李德山.利用SUMO融合系統(tǒng)高效表達(dá)可溶性重組蛋白的研究.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，39(10): 57-62;李璐，尹成凱，李德山.高效表達(dá)可溶性重組蛋白表達(dá)載體——pHisSUM0.生物技術(shù)，2009，19(3): 11-14.。
[0027]大腸桿菌Rosetta(DE3):北京全式金生物技術(shù)有限公司，目錄號(hào)CD801。
[0028]雄性db/db小鼠:上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)SCXK(滬)2015-0005。
[0029]PBS緩沖液(pH 7.2):溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度如下:NaCl 137 mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HP04 10 mmol/Τ,,ΚΗ^ΡΟ^