尿素氮測定試劑盒并按說明書操作)。結(jié)果見圖4(圖4的縱坐標(biāo)的單位為:每升尿液或血清中含有尿白蛋白，肌酸酐及尿素氮的質(zhì)量)。由圖4可以看到:模型對照組小鼠尿白蛋白，肌酸酐及尿素氮含量非常高，即腎臟纖維化程度非常高;與模型對照組相比，PFD組和FGF21組小鼠尿白蛋白，肌酸酐及尿素氮含量顯著降低。結(jié)果表明，F(xiàn)GF-21可以顯著抑制腎纖維化的發(fā)生。
[0064]I型膠原蛋白和α-平滑肌肌動蛋白為腎纖維化的標(biāo)志蛋白。取小鼠腎臟，提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過Real-time PCR檢測I型膠原蛋白(Collagen I)基因和α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)基因的表達(dá)水平(采用β-actin基因?yàn)閮?nèi)參基因)。用于檢測I型膠原蛋白基因的引物對為:5 ’-GACTGGAAGAGCGGAGAGTACTG-3 ’ ； 5 ’-CCTTGATGGCGTCCAGGTT-3 ’。用于檢測α-平滑肌肌動蛋白基因的引物對為d’-CCGAGATCTCACCGAd'S’-TCCAGAGCTACATGACACAG-S ’ ο用于檢測內(nèi)參基因的引物對為:5 ’ - ACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3’ ； 5’-GGTACCACCATGTACCCAGG-3’。取小鼠腎臟，提取總蛋白，通過Western blot檢測I型膠原蛋白、α-平滑肌肌動蛋白和β-actin蛋白水平(用于檢測I型膠原蛋白的一抗為羊抗鼠I型膠原抗體，購自Santa Cruz公司；用于檢測α_平滑肌肌動蛋白的一抗為兔抗鼠α_平滑肌肌動蛋白抗體，購自Abcam公司hReal-time PCR檢測I型膠原蛋白基因的結(jié)果見圖5A。Real-time PCR檢測α-平滑肌肌動蛋白基因的結(jié)果見圖SB13Western blot的照片見圖5C。由圖5可以看到:模型對照組小鼠I型膠原蛋白含量和α-平滑肌肌動蛋白含量非常高，即腎臟纖維化程度非常高；與模型對照組相比，PFD組和FGF21組小鼠羥I型膠原蛋白含量和α-平滑肌肌動蛋白含量顯著降低。結(jié)果表明，F(xiàn)GF-21可以顯著抑制腎纖維化的發(fā)生。
[0065]取小鼠腎臟，提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過Real-time PCR檢測ColI基因，ColIV基因，F(xiàn)N基因及a-SMA基因的表達(dá)水平(采用β-actin基因?yàn)閮?nèi)參基因)。用于檢測ColI基因的引物對為:5’-CGCCATCAAGGTCTACTGC -3’ ；5’-GAATCCATCGGTCATGCTCT-3’。用于檢測Co IIV基因的引物對為:5 ’ -AGAAGCGAGATGTTCAAGAAG-3 ’ ； 5 ’ -GTTGTGACGGTGGCAGAG-3 ’。用于檢測FN基因的引物對為:5 ’ -CTTTGGCAGTGGTCATTTCAG-3 ’ ； 5 ’ -TGGTAGGTCTTCCCATCGTCA-3 ’。用于檢測a-SMA基因的引物對為:5’-6厶(:(^厶6厶1^厶丁61'1^6厶6厶(:(:-3’；5’-CAGAGTCCAGCACAATACCAG-3 ’，結(jié)果見圖 6。
[0066]取小鼠腎臟，提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過Real-time PCR檢測TGF-β基因的表達(dá)水平(采用β-actin基因?yàn)閮?nèi)參基因)。用于檢測TGF-β基因的引物對為:5’_ATGCTAAAGAGGTCACCCGC-3 ’ ； 5 ’-TGCTTCCCGAATGTCTGACG-3 ’。取小鼠腎臟，提取總蛋白，通過Western blot檢測TGF-β蛋白、Smad2/3蛋白、磷酸化Smad2/3蛋白和β-actin蛋白的水平(用于檢測TGF-β蛋白的一抗為兔抗TGF-β，用于檢測Smad2/3蛋白的一抗為兔抗Smad2/3，用于檢測磷酸化Smad2/3蛋白的一抗為兔抗磷酸化Smad 2/ 3，均購于Ce 11 Signal ingTechnology公司)。結(jié)果見圖7aReal-time PCR檢測TGF-β基因的結(jié)果見圖TAc3Western blot的照片見圖7BJtWestern blot的照片進(jìn)行灰度掃描，得到TGF-β蛋白相對β-actin蛋白的蛋白水平和磷酸化Smad2/3蛋白相對Smad2/3蛋白的蛋白水平，結(jié)果見圖7C。由圖7可以看至IJ:模型對照組小鼠TGF-β蛋白含量和磷酸化Smad2/3蛋白含量非常高，即腎臟纖維化程度非常高；與模型對照組相比，ΡΠ)組和FGF21組小鼠TGF-β蛋白含量和磷酸化Smad2/3蛋白含量顯著降低。結(jié)果表明，F(xiàn)GF-21可以顯著抑制腎纖維化的發(fā)生。
[0067]HIPK2是保守的絲氨酸/蘇氨酸核激酶，主要通過轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄原件的組成成分磷酸化來調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。HIPK2介導(dǎo)TGF-β的信號通路，而TGF-β是介導(dǎo)腎臟纖維化的主要基因，有研究表明HIPK2是促進(jìn)腎臟纖維化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，因此HIPK2是治療腎臟纖維化的潛在治療靶點(diǎn)。取小鼠腎臟，分別提取總蛋白和核蛋白，通過Western blot檢測總蛋白中!11?1(2的水平，通過￥6 8七61.]! blot檢測HIPK2和β-actin的水平。Western blot的照片見圖8Ac^fWestern blot的照片進(jìn)行灰度掃描，得到HIPK2相對β-actin的蛋白水平，結(jié)果見圖SB。由圖8可以看到:模型對照組小鼠總蛋白中的HIPK2含量非常高，即腎臟纖維化程度非常高；與模型對照組相比，PFD組和FGF21組小鼠總蛋白中的HIPK2含量顯著降低。結(jié)果表明，F(xiàn)GF-21可以顯著抑制腎纖維化的發(fā)生。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.成纖維細(xì)胞生長因子-21在制備治療和/或預(yù)防腎纖維化中的應(yīng)用。2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:所述成纖維細(xì)胞生長因子-21為如下(a)或(b): (a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)將序列I的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有治療和/或預(yù)防腎纖維化的功能的由序列I衍生的蛋白質(zhì)。3.如權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于:所述成纖維細(xì)胞生長因子-21對腎纖維化的治療作用體現(xiàn)為(c I)至(c7 )中的至少一種: (Cl)抑制腎纖維化程度； (c2)抑制腎纖維化發(fā)生； (c3)降低腎臟中膠原纖維和/或肌纖維的水平； (c4)降低腎臟中24小時尿白蛋白，血清肌酸酐及血清尿素氮的水平； (c5)降低腎臟中I型膠原蛋白和/或α-平滑肌肌動蛋白的水平； (c6 )降低腎臟中Co IIV和/或FN的水平； (c7)降低腎臟中TGF-β和/或磷酸化Smad2/3的水平。4.一種治療和/或預(yù)防腎纖維化的藥物，其活性成分為成纖維細(xì)胞生長因子-21。5.如權(quán)利要求4所述的藥物，其特征在于:所述成纖維細(xì)胞生長因子-21為如下(a)或(b): (a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)將序列I的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有治療和/或預(yù)防腎纖維化的功能的由序列I衍生的蛋白質(zhì)。6.如權(quán)利要求4或5所述的藥物，其特征在于:所述成纖維細(xì)胞生長因子-21對腎纖維化的治療作用體現(xiàn)為(c I)至(c7 )中的至少一種: (Cl)抑制腎纖維化程度； (c2)抑制腎纖維化發(fā)生； (c3)降低腎臟中膠原纖維和/或肌纖維的水平； (c4)降低腎臟中24小時尿白蛋白，血清肌酸酐及血清尿素氮的水平； (c5)降低腎臟中I型膠原蛋白和/或α-平滑肌肌動蛋白的水平； (c6 )降低腎臟中Co IIV和/或FN的水平； (c7)降低腎臟中TGF-β和/或磷酸化Smad2/3的水平。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種成纖維細(xì)胞生長因子-21在治療腎纖維化治療和/或預(yù)防中的應(yīng)用。本發(fā)明還保護(hù)一種治療和/或預(yù)防腎纖維化的藥物，其活性成分為成纖維細(xì)胞生長因子-21。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞生長因子-21能夠有效抑制腎纖維化的發(fā)生，可作為藥物治療和/或預(yù)防腎纖維化，對于腎纖維化的治療和預(yù)防具有重大價值。
【IPC分類】A61K38/18, A61P13/12
【公開號】CN105597085
【申請?zhí)枴緾N201510947507
【發(fā)明人】李德山, 于丹, 任桂萍, 王文飛, 劉銘瑤
【申請人】哈爾濱博翱生物醫(yī)藥技術(shù)開發(fā)有限公司
【公開日】2016年5月25日
【申請日】2015年12月17日