一種基于仿生學(xué)的組織工程骨的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料領(lǐng)域，尤其涉及為一種如何基于“仿生學(xué)”及“自主裝原理”制備組織工程骨的新方法。
【背景技術(shù)】
[0002]骨缺損的功能性修復(fù)重建一直是當(dāng)前的重要研究課題。骨組織工程作為骨重建/替代治療的一種有效手段，其研究的關(guān)鍵因素包括種子細(xì)胞、支架材料和誘導(dǎo)調(diào)節(jié)因子等三個(gè)方面。目前骨替代材料可大體分為三類:自體骨、以無(wú)機(jī)材料或/和有機(jī)材料合成的人工替代材料以及由異體骨加工而來(lái)的衍生骨支架材料。自體骨由于無(wú)免疫原性且具有良好的骨誘導(dǎo)性、骨引導(dǎo)性及完美的力學(xué)匹配性而成為骨缺損修復(fù)最佳的選擇。但是由于自體骨來(lái)源有限、取材量小且容易造成供體部位的功能障礙以及由此引發(fā)的并發(fā)癥和不良后果影響著它們?cè)谂R床上的大量運(yùn)用。而人工合成的支架材料存在較差的生物相容性、生物活性、生物降解性及與宿主骨的力學(xué)匹配性等問題。另外，孔隙率和孔隙大小等方面也難以模仿天然骨的特性;而且有些材料的酸性降解產(chǎn)物還影響到細(xì)胞的附著、增殖和分化。因此，異體來(lái)源的衍生骨支架材料，為我們提供了希望和解決問題的思路。由于這些支架材料來(lái)源廣闊、擁有天然骨相似的結(jié)構(gòu)、力學(xué)性能和生物學(xué)功能，并且它們可加工成各種大小和形狀的骨塊可以滿足臨床手術(shù)中對(duì)支架多樣化的需求。在種子細(xì)胞選擇上，BMMSCs具有取材方便、細(xì)胞量大、易于增殖分化及較好的免疫耐受性等特點(diǎn)。作為具有多向分化潛能的干細(xì)胞，BMMSCs是組織工程骨理想的種子細(xì)胞。由于在體外無(wú)成骨誘導(dǎo)液的情況下，BMMSCs即可發(fā)生自發(fā)成骨礦化現(xiàn)象。大量的體內(nèi)研究也證實(shí)異位注入BMMSCs可在心肌、血管及軟骨內(nèi)發(fā)生礦化現(xiàn)象并形成可見的鈣結(jié)節(jié)。在選擇誘導(dǎo)調(diào)節(jié)因子上，不僅要考慮誘導(dǎo)因子具有促進(jìn)支架材料上細(xì)胞的成骨反應(yīng)，還要考慮該因子具有促進(jìn)支架材料的血管化反應(yīng)或促進(jìn)血管化相關(guān)因子的表達(dá)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有“組織工程骨制備”存在的不足之處，提供一種基于“仿生原理”的新型組織工程骨制備。
[0004]本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:一種基于仿生學(xué)的組織工程骨的制備方法，包括以下步驟:
[0005](I)將P3-5代BMMSCs在多孔的生物支架材料上孵育3h;其中孵育過程中，使用的培養(yǎng)基為全培養(yǎng)基，孵育條件為37°C、含5 % CO2、飽和濕度；
[0006](2)轉(zhuǎn)移至密閉的水套式CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，每天換液，培養(yǎng)21天后獲得功能性組織工程骨;培養(yǎng)過程中，使用的培養(yǎng)基為全培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為于37 0C、飽和濕度、5 % CO2、5 %02、95%Ν2ο
[0007]進(jìn)一步地，所述生物支架材料通過以下步驟制備得到:
[0008](1.1)將帶有皮質(zhì)骨的骨塊，用去離子水清洗后，用38°(:的3(^01%過氧化氫浸泡脫脂24h;
[0009](1.2)去離子水沖洗后，用4°C的0.6M鹽酸浸泡脫鈣4h;
[0010](1.3)去離子水沖洗后，于乙醇中浸泡4h以去除剩余的過氧化氫；
[0011](1.4)在室溫下用氯仿/甲醇的混合溶液(體積比1:1)浸泡處理Ih;
[0012](1.5)用4°(:的0.25%1%胰蛋白酶(一般溶劑為1^5)浸泡處理1211，再用20?301€的0.5vol % SDS (—般溶劑為PBS)浸泡處理4h，以脫蛋白；
[0013](I.6)用4°C的0.6M鹽酸第二次浸泡脫鈣Ih。
[0014](1.7)去離子水沖洗后，在-38 0C，10—5Pa下冷凍干燥24h;
[0015](1.8)利用6t3Co γ -ray放射線照射，去除支架材料的抗原性。
[0016]進(jìn)一步地，所述生物支架材料在孵育前，還用無(wú)菌的I3BS浸泡24h，然后用無(wú)FBS的L-DMEM浸泡2d，再用無(wú)菌的棉球或紗布吸除殘留的L-DMEM。
[0017]本發(fā)明的有益效果在于:
[0018](I)本發(fā)明通過一系列復(fù)雜的“脫脂”、“脫蛋白”、并首創(chuàng)性地采用“二次脫礦法”制備出無(wú)“免疫原性”、但卻保留良好“骨誘導(dǎo)性”并具有良好“生物相容性”的生物衍生骨支架材料。
[0019](2)BMMSCs具有取材方便、細(xì)胞量大、易于增殖分化及較好的免疫耐受性等特點(diǎn)。由于在體外無(wú)成骨誘導(dǎo)液的情況下，BMMSCs可發(fā)生自發(fā)成骨礦化現(xiàn)象。因此還可免除調(diào)配并加入成骨誘導(dǎo)液等繁復(fù)程序。
[0020](3)相對(duì)于需購(gòu)買FGFl/2、GDF5、GH、TGF0、roGF等細(xì)胞因子作為誘導(dǎo)劑，低氧作為一種誘導(dǎo)因子，具有容易獲取、簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)勢(shì)。另外，低氧可模擬BMMSCs生活的體內(nèi)微環(huán)境，不僅可以促進(jìn)成骨礦化反應(yīng)還可以促進(jìn)支架材料的血管化進(jìn)程。
[0021](4)制備得到的組織工程骨具有較高的成骨能力，且含有豐富的血管化因子(VEGF、Runx2、BMP2、BMP4、0ΡΝ)。
【附圖說明】
[0022]圖1是本發(fā)明所制得異體骨來(lái)源的生物衍生骨支架材料的實(shí)體圖(圖1A)、掃描電鏡圖(圖1B)、成骨誘導(dǎo)性分析(圖1C-D)、及生物相容性分析(圖1E);
[0023]圖2是種子細(xì)胞BMMSCs在支架材料上及低氧環(huán)境下的細(xì)胞優(yōu)勢(shì)增殖；
[0024]圖3是是種子細(xì)胞BMMSCs在支架材料上及低氧環(huán)境下的成骨礦化及血管化反應(yīng)(圖 3A-VEGF、圖 3B-Runx2、圖 3C-BMP2、圖 3D-BMP4、圖 3E-0PN)；
[0025]圖4是經(jīng)種子細(xì)胞復(fù)合后并在低氧環(huán)境下培養(yǎng)21d后的支架材料修復(fù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物脛骨骨缺損(圖4A-3周、圖4B-6周、圖4C-12、圖4D-未處理組)的愈合進(jìn)程。
【具體實(shí)施方式】
[0026]目前對(duì)異體骨的加工通常采用脫脂肪、脫蛋白、脫礦等物理和化學(xué)手段。適當(dāng)?shù)拿摰V處理可以從鈣化的骨基質(zhì)中釋放出一些有利于細(xì)胞成骨分化的誘導(dǎo)因子。而脫脂脫蛋白處理主要是去除骨組織中一些異體來(lái)源的免疫反應(yīng)原從而降低移植后宿主的排斥反應(yīng)。但是過分的脫脂脫蛋白處理會(huì)使細(xì)胞外基質(zhì)中一些有利于細(xì)胞成骨分化和細(xì)胞外基質(zhì)礦化的小分子物質(zhì)同時(shí)被洗脫掉。因此脫礦和脫脂/脫蛋白處理之間的平衡是保留生物衍生骨支架材料的骨誘導(dǎo)性同時(shí)去除免疫原性的關(guān)鍵。眾多研究表明將異體骨浸泡在鹽酸中15min即可使骨組織開始脫礦，24h后可使骨組織完全脫礦。據(jù)此我們采取了將骨組織脫礦5h的折中措施