。同時，分兩步進(jìn)行:第一步脫礦4h主要是讓異體骨內(nèi)的免疫原充分暴露以利于后續(xù)的脫蛋白處理;第二步繼續(xù)脫礦Ih主要是讓鈣化的骨基質(zhì)中一些有利于細(xì)胞成骨分化的誘導(dǎo)因子充分釋放。這種兩步法的脫礦處理方式可從根本上解決生物衍生骨支架材料制作過程中存在的矛盾。
[0027]本發(fā)明通過“二次脫礦技術(shù)”的方法，制備出與天然骨結(jié)構(gòu)和功能基本類似的異體骨來源的生物衍生支架材料，并通過復(fù)合具有自發(fā)成骨效應(yīng)的BMMSCs，在低氧培養(yǎng)環(huán)境下制備富有成骨及血管化因子(VEGF、Runx2、BMP2、BMP4、0PN)的功能性組織工程骨。采用這種組織工程骨來修復(fù)動物大塊骨缺損，并取得較明顯的骨重建效果。具體步驟如下:
[0028](I)將帶有皮質(zhì)骨的骨塊，去離子水清洗干凈，于38°C用30%vol過氧化氫脫脂24h;去離子水清洗干凈，于4°C用0.6M鹽酸部分脫鈣4h;去離子水清洗干凈，入乙醇中浸泡4h以去除剩余的過氧化氫；室溫下氯仿/甲醇(體積比1:1)處理Ih，4 °C下0.25V01 %胰蛋白酶(一般溶劑為PBS)處理12h，再于室溫下0.5vo I % SDS (—般溶劑為I3BS)處理4h以脫蛋白；于4°C用0.6M鹽酸第二次脫鈣lh。去離子水再次清洗干凈后，在-38°C，10—5Pa下冷凍干燥24h;利用6qCo γ -ray放射線(20-25 X 13Gy)照射去除支架材料的抗原性。
[0029](2)支架材料用無菌的PBS浸泡24h，再用無FBS的L-DMEM浸泡2d。將支架材料中所含有的L-DMEM用無菌的棉球或紗布吸除干凈。取P3-5代BMMSCs用0.25%胰蛋白酶消化，以100rpm的速度離心5min，吸出消化液后，加入全培養(yǎng)基制備成一定細(xì)胞密度的懸液(2.5 X16個/ml)。為均勻接種，采用“滴注法”，將ΙΟΟμΙ的細(xì)胞懸液緩慢均勻地加到支架材料中，并避免懸液從材料底物漏出(根據(jù)經(jīng)驗ΙΟΟμΙ體積的細(xì)胞懸液基本不會從支架材料底面漏出)ο培養(yǎng)板置于37 °C、5 % CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育3h，使得細(xì)胞完全粘附在支架材料上。5 % CO2是指CO2在培養(yǎng)箱中的體積分?jǐn)?shù)，剩余的95 %為空氣，為本領(lǐng)域的公知常識。
[0030](3)選用密閉的水套式C02細(xì)胞培養(yǎng)箱構(gòu)建低氧培養(yǎng)環(huán)境培養(yǎng)過程中，使用的培養(yǎng)基為全培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為于37°C、飽和濕度、5 % CO2、5 %O2、95 %N2的飽和濕度孵箱。將上述(2)的細(xì)胞復(fù)合支架材料置于低氧中培養(yǎng)21d以制備富有成骨及血管化因子(VEGF、Runx2、BMP2、BMP4、0PN)的功能性組織工程骨。其中，5%C02、5%02、95%N2是指各種氣體在培養(yǎng)箱中的體積分?jǐn)?shù)。
[0031]通過一系列復(fù)雜的物理化學(xué)處理制備出來的生物衍生骨支架材料呈多孔形似海綿但機(jī)械性能良好類似松質(zhì)骨(圖1A)。掃描電鏡顯示骨衍生支架材料具有天然人體骨組織的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，孔隙分布均勻，孔隙之間相互連通?？紫吨睆揭话阍?0-700μπι，孔隙率大概在88%左右(圖1Β)。如此高的孔隙率為細(xì)胞粘附、伸展、增殖提供了足夠的空間和表面(圖1Ε)，并具有良好的骨誘導(dǎo)性(圖1C-D)。將種子細(xì)胞BMMSCs培養(yǎng)在實例中的支架材料上，相比于孔板，制備出的生物衍生支架材料本身即可促進(jìn)細(xì)胞增殖(圖2)。若將培養(yǎng)環(huán)境置于低氧環(huán)境中，細(xì)胞的增殖效應(yīng)更加明顯(圖2)。同樣，支架材料本身即可促進(jìn)細(xì)胞的成骨礦化及血管化反應(yīng)(圖3Α-Ε).若將該富含種子細(xì)胞的支架材料置于低氧環(huán)境，可制備出富有成骨及血管化因子(VEGF、Runx2、BMP2、BMP4、0PN)的功能性組織工程骨(圖3)。采用這種組織工程骨來修復(fù)動物大塊骨缺損，可在第12周取得較明顯的骨重建效果(圖4A-C)，而未骨修復(fù)組無骨修復(fù)重建反應(yīng)(圖4D)。
【主權(quán)項】
1.一種基于仿生學(xué)的組織工程骨的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)將P3-5代BMMSCs在多孔的生物支架材料上孵育3h;其中孵育過程中，使用的培養(yǎng)基為全培養(yǎng)基，孵育條件為37°C、含5 % CO2、飽和濕度； (2)轉(zhuǎn)移至密閉的水套式CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，每天換液，培養(yǎng)21天后獲得功能性組織工程骨;培養(yǎng)過程中，使用的培養(yǎng)基為全培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為于370C、飽和濕度、5%⑶2、5 %O2、95%N2o2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物支架材料通過以下步驟制備得到: (1.1)將帶有皮質(zhì)骨的骨塊，用去離子水清洗后，用38°C的30vol%過氧化氫浸泡脫脂24h； (1.2)去離子水沖洗后，用4°C的0.6M鹽酸浸泡脫鈣4h ； (1.3)去離子水沖洗后，于乙醇中浸泡4h以去除剩余的過氧化氫； (1.4)在室溫下用氯仿/甲醇的混合溶液(體積比1:1)浸泡處理Ih; (1.5)用4 °C的0.25VoI %胰蛋白酶(一般溶劑為PBS)浸泡處理12h，再用20?30 °C的0.5vol % SDS(—般溶劑為PBS)浸泡處理4h，以脫蛋白； (I.6)用4 °C的0.6M鹽酸第二次浸泡脫鈣Ih。 (1.7)去離子水沖洗后，在-38°C，10—5Pa下冷凍干燥24h; (1.8)利用6t3Coγ -ray放射線照射，去除支架材料的抗原性。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物支架材料在孵育前，還用無菌的PBS浸泡24h，然后用無FBS的L-DMEM浸泡2d，再用無菌的棉球或紗布吸除殘留的L-DMEM。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于仿生學(xué)的組織工程骨的制備方法，包括以下步驟：根據(jù)“仿生學(xué)”及“自主裝”原理，首創(chuàng)性地采用“二次脫礦技術(shù)”制備出與天然骨結(jié)構(gòu)和功能基本類似的異體骨來源的生物衍生支架材料作為支架，選用具有自發(fā)成骨現(xiàn)象的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMMSCs)作為種子細(xì)胞，采用低氧環(huán)境來模擬體內(nèi)BMMSCs的生長微環(huán)境作為誘導(dǎo)因子，來制備出具有與天然骨組成、微結(jié)構(gòu)及生物反應(yīng)性相似的組織工程骨。該法制備出的組織工程塊狀骨，具有明顯的成骨誘導(dǎo)性和血管化作用，可用于頜面部或骨科出現(xiàn)較大骨缺損的功能性骨重建修復(fù)。
【IPC分類】A61L27/36, A61L27/56, A61L27/38
【公開號】CN105617462
【申請?zhí)枴緾N201610056304
【發(fā)明人】周益, 沈建偉, 關(guān)曉旭, 王慧明
【申請人】浙江大學(xué)
【公開日】2016年6月1日
【申請日】2016年1月27日