用于測(cè)定維生素d代謝物的25-oh維生素d衍生物的制作方法
【專利說明】用于測(cè)定維生素 D代謝物的25-OH維生素 D衍生物
[0001] 本發(fā)明涉及新的維生素 D化合物，其在C-3立體中心通過連接體與標(biāo)記基團(tuán)相連 接。本發(fā)明還涉及用于制備這些維生素 D化合物的方法以及中間產(chǎn)物用于制備這些化合物 的用途。
[0002] 本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是通過使用根據(jù)本發(fā)明的維生素 D化合物作為示蹤物來定量 測(cè)定維生素 D的方法。本發(fā)明還涉及包含根據(jù)本發(fā)明的化合物的用于測(cè)定維生素 D的試劑， 以及其用于測(cè)定維生素 D的用途。
[0003] 對(duì)于人，充足的維生素 D供給是基本的。維生素 D最常見的生理形式是維生素 D3或 維生素 D2。維生素 D3[Cholecalciferol (膽鈣化醇）]最重要的生理有效衍生物是250HD3(25-羥基維生素 D3或鈣二醇）]和1，25-(0扣203(1-<1，25-二羥基維生素0 3或鈣三醇）。通常，占優(yōu) 勢(shì)量的維生素 D3不像其他維生素那樣與食物一起被吸收，而是在UV-光的影響下在皮膚中 制造。在這種情況下，7-二羥基膽固醇通過UV-照射轉(zhuǎn)變?yōu)榍熬S生素 D3,其中不穩(wěn)定的中間 產(chǎn)物改變結(jié)構(gòu)成為維生素 D3。在食物中，維生素 D3特別地包含在富含脂肪的魚類中。可以在 體內(nèi)存在的維生素 D的另一個(gè)形式是維生素 D2[ Calciferol (f丐化醇)或Ergocalciferol (麥 角鈣化醇）]，其存在于真菌中并且可以與食物一起被吸收。維生素 D3和維生素02制劑是供給 充足量的維生素 D的另一個(gè)來源。
[0004] 維生素 D和其天然衍生物是極為疏水的分子。在血液中，進(jìn)行以與維生素 D結(jié)合蛋 白（DBP)相復(fù)合的維生素 D的運(yùn)輸。DBP屬于白蛋白家族并且結(jié)合維生素 D、維生素 D代謝物和 脂肪酸。
[0005] 在肝臟中，維生素 D通過細(xì)胞色素 P450在C-25位置氧化。所得到的250HD(25-羥基 維生素 D3或25-羥基維生素 D2)是主要存在于循環(huán)中的維生素 D代謝物。血清中250HD的濃度 充當(dāng)評(píng)價(jià)人的維生素 D狀況的指示物。
[0006] 在腎中和在其他組織中，進(jìn)行250HD至1，25(0H)2D即維生素 D的生理活性形式的轉(zhuǎn) 化，后者在與維生素 D受體(VDR)結(jié)合后，控制依賴維生素 D而調(diào)控的(VDRE)基因活性。
[0007] 充足的維生素 D供給對(duì)于正常的骨形成和鈣吸收和磷酸鹽吸收的調(diào)節(jié)是基本的。 V D R被1，2 5 (0 H) 2 D的活化提高了腸鈣吸收的效率大約3 0 %和磷酸鹽吸收大約8 0 %。如果 250HD的血清濃度下降到30ng/ml以下，那么這就與腸中鈣吸收的明顯減少和甲狀旁腺激素 濃度的上升相聯(lián)系。維生素 D缺乏被視為對(duì)于具有增加的骨折風(fēng)險(xiǎn)的骨質(zhì)疏松癥的主要因 素并且與其他的健康風(fēng)險(xiǎn)相聯(lián)系。血清中維生素 D的濃度取決于食物吸收和陽光暴露而經(jīng) 受強(qiáng)烈的波動(dòng)，而250HD-血清濃度被視為確定維生素 D供給狀況的良好指示物。血清中 250HD濃度的測(cè)定因此在醫(yī)學(xué)診斷中常規(guī)地進(jìn)行。
[0008] 血清中的250HD-測(cè)定優(yōu)選地通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合試驗(yàn)來進(jìn)行。在這種情況下，樣品的 250HD濃度通過放射性或化學(xué)標(biāo)記的維生素 D衍生物被維生素 D結(jié)合蛋白、例如250HD特異的 抗體的置換來測(cè)定。在競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合試驗(yàn)中作為示蹤物使用的標(biāo)記維生素 D衍生物在此不得 不以較高的親和力和特異性與在試驗(yàn)中使用的維生素 D結(jié)合蛋白相結(jié)合。
[0009] DE 69713138(Immundiagnostic Systems Ltd.)描述了在C20-位放射性修飾的 1， 25-二羥基維生素 D衍生物，其可以作為示蹤物在免疫試驗(yàn)中使用。
[0010] US 5，116，573(Kureha Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha)描述了在C19-和C6_位 氖或氣標(biāo)記的維生素 D衍生物。
[0011] 備選地，可以使用維生素 D3和維生素衍生物的3β-羥基基團(tuán)以引進(jìn)非放射性標(biāo)記 基團(tuán)，其中羥基基團(tuán)被修飾為酯橋或醚橋。然而，基于半抗原標(biāo)記的酯衍生物的維生素 D示 蹤物的可用性，例如由于在高于ΡΗ7的pH值情況下酯橋的不穩(wěn)定性和其面對(duì)酯酶(其在生物 液體和組織中經(jīng)常存在)的無抵抗性而大受限制。為了解決該問題，發(fā)展了用于將羥基基團(tuán) 轉(zhuǎn)化為3β_氨基丙基醚衍生物的方法（Roy，Α·和Ray，R ·，Steroids · 1995，60 : 530-533， US6291693:Holick，M.F.和 1^^，1]56787660:八^111^118七61]\^.等人，1]520080317764:!1油61 E ·等人，US8003400: Kobold，U ·)。
[0012] 然而，該在現(xiàn)有技術(shù)中描述的用于制備維生素 D衍生物的方法和其在競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合 試驗(yàn)中作為示蹤物的用途具有一系列缺點(diǎn)。放射性標(biāo)記的維生素 D示蹤物具有低的持久性 和減小的穩(wěn)定性。除了對(duì)于健康和環(huán)境的原則上的缺點(diǎn)外，在放射性試劑的情況下，對(duì)于存 放、運(yùn)輸和清除的花費(fèi)提高了。
[0013] 在3β-羥基基團(tuán)上經(jīng)修飾的維生素 D衍生物具有這樣的缺點(diǎn)，即合成路徑是極其費(fèi) 力的并且必須在嚴(yán)格厭氧的條件下使用高度易燃的和腐蝕性的試劑。此外出現(xiàn)，這些化合 物在生理?xiàng)l件下大部分僅具有低的穩(wěn)定性，這強(qiáng)烈地限制了其在生物來源的樣品中的使 用。
[0014] 為測(cè)定維生素 D而使用的示蹤物應(yīng)當(dāng)是在合成上容易得到的，不包含潛在有害健 康的用于檢測(cè)的標(biāo)記基團(tuán)并且適合于在可自動(dòng)化的測(cè)試方法中使用。
[0015] 本發(fā)明的任務(wù)因此是，提供標(biāo)記的維生素 D化合物，其解決在標(biāo)記維生素 D衍生物 的合成中迄今為止的問題并且適合于作為示蹤物在用于定量測(cè)定維生素 D的自動(dòng)化方法中 使用。
[0016] 在現(xiàn)有技術(shù)中描述的標(biāo)記維生素 D化合物以及其制備的限制和缺點(diǎn)通過本發(fā)明至 少部分地被消除。
[0017] 本發(fā)明提供了標(biāo)記的維生素 D化合物，其適合于在用于測(cè)定維生素 D的測(cè)試方法中 作為示蹤物并且是通過簡(jiǎn)單和短的途徑合成可用的。
[0018] 令人意外地，發(fā)現(xiàn)維生素 D基體中的標(biāo)記基團(tuán)可以通過C-3原子上羥基基團(tuán)的親核 取代被引入。在這種情況下，出現(xiàn)C-3原子上構(gòu)型的反轉(zhuǎn)。盡管如此，所得到的具有以在C-3 上的α-構(gòu)型的標(biāo)記基團(tuán)的化合物令人意外地出色地適合于作為競(jìng)爭(zhēng)性維生素 D測(cè)定方法中 的示蹤物。C3上的反轉(zhuǎn)構(gòu)象首先由于因此伴隨而來的在生物液體例如血液中，例如面對(duì)酯 酶的穩(wěn)定性的提尚，而是有利的。
[0019] 通過本發(fā)明，提供了新的示蹤物以及用于測(cè)定維生素 D，特別是25-羥基維生素 D3 或25-羥基維生素 D2的濃度的可靠和可自動(dòng)化的方法。
[0020] 本發(fā)明的第一個(gè)方面因此涉及具有按照式(I)的結(jié)構(gòu)的維生素 D化合物，
[0022] 其中
[0023] RSC2-C1Q烷基殘基或烯基殘基，其如果需要地被羥基基團(tuán)取代，
[0024] L為連接體，和
[0025] W為標(biāo)記基團(tuán)，其不是維生素 D化合物。
[0026] 表述"C2-C1Q烷基"表示具有2至10個(gè)碳原子的線性或支化的烷基基團(tuán)。該術(shù)語包含 基團(tuán)例如乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、正戊基、正己基、正庚基、正辛基、 2_乙基己基、2_辛基、3_辛基、異辛基、正壬基、2_壬基、3_壬基、4_壬基、異壬基、正癸基、異 癸基、2-癸基和3-癸基。每個(gè)氫原子也可以被氖原子替代。
[0027] 表述"C2-C1Q烯基"表示具有2至10個(gè)碳原子的烯基基團(tuán)。其可以是直鏈的或支化的 并且以Z-型或E-型存在。此類基團(tuán)包括乙烯基、丙烯基、1-丁烯基、異丁烯基、2-丁烯基、1-戊烯基、（Z)-2_戊烯基、(E)-2_戊烯基、（Z)-4_甲基_2_戊烯基、(E)-4_甲基_2_戊烯基、戊二 烯基，例如1，3_或2,4-戊二烯基、江)-5,6-二甲基庚-3-烯基和(2)-5,6-二甲基庚-3-烯基。 每個(gè)氫原子也可以被氘原子替代。
[0028]表述"標(biāo)記基團(tuán)"表示這樣的基團(tuán)，其是通過物理、化學(xué)和/或生物化學(xué)的方法可檢 測(cè)的，與所標(biāo)記的分子的使用是相容的并且特別地是非放射性的。在此，它不是具有按照式 (I)的結(jié)構(gòu)的維生素 D化合物。
[0029]表述"連接體"表示這樣的分子間隔體，其使按照式(I)的維生素 D基架與標(biāo)記基團(tuán) 相連接。
[0030]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述連接體以此為特征，即它具有選自C原子和如果需要地雜 原子例如N、0和/或S的6至110個(gè)原子的鏈長(zhǎng)。鏈長(zhǎng)優(yōu)選地為8-80、12-60或30-50個(gè)原子長(zhǎng)。 如果需要在連接體中包含的雜原子優(yōu)選地為N和/或0。
[0031 ]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述連接體由式(II)來代表：
[0033] 其中
[0036] Y:為-〇-或-CH2-，
[0037] R1和R2相互獨(dú)立地為!1或&-〇5烷基，和
[0038] m 為 1-30,和
[0039] η 為 1-12，
[0040] 其中Q1與W基團(tuán)和Q2與按照式（I)的維生素 D化合物的基體相連接并且(·)各自指 示Q2與維生素 D化合物的基體或Q1與W基團(tuán)的連結(jié)位置。每個(gè)氫原子也可以被氘原子替代。 [0041 ]表述"&-C6烷基"表示線性或支化的烷基基團(tuán)，其具有1至6個(gè)碳原子，特別地1-3個(gè) 碳原子。這些基團(tuán)包括例如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、正戊基、新 戊基、1-乙基丙基、正己基和異己基。每個(gè)氫原子也可以被氘原子替代。
[0042]優(yōu)選的實(shí)施方案以此為特征：
[0055] R1和R2相互獨(dú)立地為!1或&-〇5烷基，和
[0056] m 為 1-30,和
[0057] η 為 1-12，
[0058]另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案以此為特征：
[0061] Υ:為-〇-，
[0062] R1和R2相互獨(dú)立地為!1或&-〇5烷基，和特別是Η，
[0063] m為 1-30,和
[0064] η 為 1-12。
[0065]按照式（II)的連接體中的Υ優(yōu)選地為-0-。
[0066]在另一個(gè)優(yōu)選的