5-二羥基維生素 D3、1,25-二羥基維生素 D2和其混 合物。特別優(yōu)選地，所述維生素 D化合物是25-羥基維生素 D3和/或25-羥基維生素 D2。
[0131] 本發(fā)明的第四個方面涉及包含按照式(I)的化合物的用于測定維生素 D的試劑。
[0132] 優(yōu)選地，所述試劑還包含用于釋放結(jié)合的維生素 D的試劑和如果需要的稀釋劑、載 體、溶劑、輔劑、穩(wěn)定劑、防腐劑和/或分散劑。
[0133] 所述試劑優(yōu)選地以干試劑或濕試劑存在。
[0134] 本發(fā)明的第五個方面為上面所描述的試劑用于測定維生素 D的用途，特別是在如 上面所描述的根據(jù)本發(fā)明的體外方法中的用途。
[0135] 本發(fā)明的第六個方面為具有按照式(VI)的結(jié)構(gòu)的化合物：
[0137] 其中RSC2-C1Q烷基殘基或烯基殘基，其如果需要地被羥基基團(tuán)取代，
[0138] X 為 NHR3、0H 或 SH，和
[0139] R3 為!1或&-C6烷基，
[0140] 用于制備示蹤物化合物，即具有按照式（I)、式（la)、式（lb)或式（Ic)的結(jié)構(gòu)的化 合物，特別是用于制備具有按照式(I)、式(lb)或式(Ic)的結(jié)構(gòu)的化合物的用途。
[0141] 每個氫原子也可以被氘原子替代。
[0142] 基團(tuán)R優(yōu)選地為維生素 D側(cè)鏈，優(yōu)選地具有0H基團(tuán)，例如按照式（III)或按照式(IV) 的結(jié)構(gòu)。
[0143] 此外，將通過下面的附圖和實(shí)施例，更詳細(xì)地描述本發(fā)明。
[0144] 圖例：
[0145] 圖1:生物素25-OH-維生素 D3示蹤試劑的合成，通過將25-羥基維生素 D3(l)轉(zhuǎn)變?yōu)?表3αΝ-鄰苯二甲酰亞胺衍生物(2)，去保護(hù)為氨基衍生物(3)和與NHS-PEG12-生物素反應(yīng)為3 α_[α-生物素酰氨基-ω -十二（乙二醇)-酰氨基]-25-羥基-去氧維生素 D3 (4)。
[0146] 圖2:確定的250HD3濃度被生物素-250HD3示蹤試劑的競爭性置換的表征。對于特 異性250HD競爭的ELISA檢測，給以0、5、10、20、20、50、100、200、3001^/1111濃度的在無維生素 的D血清基質(zhì)（SerCon，Seracare Inc.)中的250HD3的稀釋系列，在7.5ng/ml生物素-250HD 示蹤試劑存在下?lián)饺?0μ1維生素 D釋放劑并涂抹在用抗250HD抗體涂覆的微量滴定板孔上。 依賴于競爭性250HD濃度的示蹤物結(jié)合用過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白和四甲基聯(lián) 苯胺(ΤΜΒ)-顏色反應(yīng)通過測量0D 450nm來測定。
[0147] 圖3 :具有確定的250HD3和250HD2濃度的血清（6PLUSlMultilevel Serum Calibrator Set 25-〇H_Vitamin D3/D2，Chromsystems GmbH)與其在無維生素的D血清基 質(zhì)（SerCon，Seracare Inc.)中的稀釋物的比較分析所顯示的是，在HPLC和LC-MS/MS確定的 25-OHD3/D2濃度與在自動Aleria?系統(tǒng)（0RG270，0RGENTEC)中的直接25-OH維生素 D3/D2測 定方法之間的高度一致。
[0148] 圖4:在37°C下、在24小時孵育后在無維生素的D血清基質(zhì)中的25-OH維生素 D衍生 物3α-[α-生物素酰氨基-ω-十二（乙二醇)-酰氨基]-25-羥基-去氧維生素 D3(VD1)和3β-3' [α_生物素酰氨基-ω -十二（乙二醇)-酰氨基]酰氨基丙基醚-25-羥基維生素 D3 (VD2)的稀 釋物恢復(fù)的比較測定所顯示的是，在C3-原子上以（R)-構(gòu)型存在的衍生物VD1相對于在C3-原子上以（S)構(gòu)型存在的衍生物VD2的高血清穩(wěn)定性。
[0149] 實(shí)施例1:3α-[α-生物素酰氨基-ω-十二（乙二醇)-酰氨基]-25-羥基-去氧維生素 D3的合成（圖1)
[0150] 在具有溶劑CDC13的Bruker AC300(Bruker，Karlsruhe，Bruker)上記錄hMR(在 300MHz)譜。評價用四甲基硅烷作為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)物以ppm來進(jìn)行。質(zhì)譜在Varian MAT 311光譜儀 (70eV，EI)上測得。對于分析型薄層色譜法，使用F . 256硅膠板（Merck Darmstadt， Germany)。色譜純化在硅膠柱中于230-400網(wǎng)眼ASTM進(jìn)行。所有試劑從Sigma Aldrich購進(jìn)。
[0151] 1.1: 3α-鄰苯二甲酰亞胺-25-羥基-去氧維生素 D3的合成
[0152] 在室溫下攪拌在四氫呋喃（2.0ml)中的25-羥基-維生素 D3(10.0 mg，25μπι〇1)、鄰苯 二甲酰亞胺（4 · 5mg，31 · 25μηιο1)、三苯基膦（8 · 2mg，31 · 25μηιο1)和偶氮二羧酸二乙酯 (5.4mg，31.25μπι〇1)的溶液24小時。在添加己烷(2.0ml)后，將化合物通過硅膠過濾器進(jìn)行 過濾。在除去溶劑后，將固體吸收在5ml 10%Na2C03中并用每次10ml的二乙醚抽提2次。將 合并的醚相通過MgS04進(jìn)行干燥并在真空下濃縮至無色油。將產(chǎn)物通過硅膠柱色譜法進(jìn)行 純化。3α_鄰苯二甲酰亞胺-25-羥基去氧維生素 D3(圖1式2)以無色油的形式分離出 (7.311^)。匪1?:3〇.58(8，!1-〇(18)，3!〇，0.85(d，J = 6.4Hz，H-C(21)，3H)，1.21(s，H-C(26和 27)，6H)，AB四重峰：4.84(d，J = 2.4Hz，H-C(19)E，lHWP5.06(d，J=1.9Hz，H-C(19)Z，lH)， 八8四重峰：6.02((1，了=11.0!^，!1-(：(7)，1!1)和6.26(1，了=11.0!^，!1-(：(6)，1!〇,7.80(111，八1 4H)，MS:m/e(100)529.24(M+)。
[0153] 1 · 2: 3α-氨基-25-羥基-去氧維生素 D3的合成
[0154] 將3α-鄰苯二甲酰亞胺-25-羥基-去氧維生素03(2)，（7.211^，13.5111111 〇1)在氮?dú)庀?溶解在0.5ml 8Μ的甲胺乙醇溶液中。將混合物首先在室溫下攪拌2小時，緊接著在4°C攪拌 16小時。將溶劑在低壓下蒸發(fā)掉并將殘留物吸收在5ml 10%Na2C03中并用每次10ml的二乙 醚抽提3次。將合并的醚相通過MgS0 4進(jìn)行干燥并在真空下濃縮至無色油。將產(chǎn)物通過硅膠 柱色譜法進(jìn)行純化。3α_鄰苯二甲酰亞胺-25-羥基去氧維生素 D3以無色油分離出（4)， (5.211^)。匪1?:3〇.57(8，!1-〇(18)，3!〇，0.85(d，J = 6.4Hz，H-C(21)，3H)，1.21(s，H-C(26和 27)，6H)，AB四重峰：4.83(d，J = 2.4Hz，H-C(19)E，lHWP5.00(d，J=1.8Hz，H-C(19)Z，lH)， AB 四重峰：5.97(d，J=11.0Hz，H-C(7)，lH)^P6.27d，J=11.0Hz，H-C(6)，lH)，MS:m/e(100) 400·37(Μ+)。
[0155] 1.3:3α-[α-生物素酰氨基-ω-十二（乙二醇)-酰氨基]-25-羥基去氧維生素 D3的 合成
[0156] 將 3α-氨基-25-羥基-去氧維生素 D3(3)，（5.2mg，12.9ymol)、SZK(0.02yl)、 NHS-PEG12-生物素（9·4mg，10·Ομπιο 1，Thermo Scientific，產(chǎn)品編號：21312)溶解在0·2ml二 乙基甲酰胺中，并在室溫下攪拌過夜。將溶劑在低壓下蒸發(fā)掉并將殘留物通過硅膠柱色譜 法進(jìn)行純化。在這種情況下，獲得5.9mg無色蠟形式的3α-[α-生物素酰氨基-ω -十二（乙二 醇）_ 酰氨基]-25-羥基-去氧維生素 03(4)。匪1?4〇.58(8，!《：(18)，3!〇,0.85((1，1 = 6.4抱， !1-<：(21)，3!〇，1.21(8，!1-(：(26和27)，6!〇,3.62(111，!1-(：(乙二醇），50!〇，厶8四重峰：4.84((1，了 = 2.4Hz，H-C(19)E，lH)和5.06((1, J = 1.9Hz, H-C(19)Z，1H)，AB 四重峰：6.02((1, J= 11 ·0Hz， H-C(7)，lH)^P6.26d，J=ll，0Hz，H-C(6)，lH)，MS:m/e(100)1247.80(M+Na+)。
[0157] 實(shí)施例2:維生素 D釋放試劑的制備
[0158] 將甲基苯磺酸鈉溶解在水中并用1M檸檬酸鈉和1M氯化鐵（III)的母液調(diào)節(jié)至1M甲 基苯磺酸鈉、l〇〇mM梓檬酸鈉和50mM氯化鐵(III)的最終濃度。
[0159] 實(shí)施例3:25-OHD抗體與固相的結(jié)合
[0160] 將針對25-OH-維生素 D3或25-OH-維生素 D2的抗體在Tris鹽緩沖液，pH8.0中稀釋 至lμg/ml的濃度。將微量滴定板(MaxiS〇rb，Nunc)的孔用100μΙ的抗體稀釋液涂覆，在37°C 下干燥并在4°C下存放直至測試進(jìn)行。
[0161]實(shí)施例4:競爭性結(jié)合分析
[0162] 給無維生素 D的血清基質(zhì)（Seracon，Seracare Inc ·)摻入確定濃度的25-OHD3。將 各個80μ1的濃度系列填充入放有作為示蹤物的來自實(shí)施例1的3α-[α-生物素酰氨基-ω-十 二（乙二醇)-酰氨基]-25-羥基-去氧維生素 D3(250HD-生物素-示蹤試劑）的微量滴定板孔 中并且為了使示蹤試劑增溶，在室溫(20-27°C )下孵育5分鐘。隨后，將80μ1來自實(shí)施例2的 釋放試劑，其使樣品的維生素 D從與DBP的復(fù)合物解離，添加給樣品批料并混合。將100μ1用 維生素 D-釋放試劑稀釋的樣品轉(zhuǎn)移入250HD-抗體涂覆的孔中并在室溫下孵育30分鐘。樣品 中包含的250HD現(xiàn)在與250HD生物素-示蹤物競爭250HD抗體上的結(jié)合位點(diǎn)。隨后，除去樣品 批料并用每次200μ1洗滌緩沖液沖洗孔3次。結(jié)合抗體的生物素250HD示蹤物的檢測用過氧 化物酶標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白和四甲基聯(lián)苯胺(ΤΜΒ)-顏色反應(yīng)來進(jìn)行。在通過添加100μ 1 50mM磷酸終止反應(yīng)后，進(jìn)行在450nm下的光密度測量。為此，如在圖2