11 2.1復(fù)制肝衰竭動(dòng)物模型：以1.4g/kg(預(yù)實(shí)驗(yàn)確定)劑量的D-GalN單次腹腔注射構(gòu) 建肝衰竭模型。正?？瞻讓?duì)照組同等條件下用無(wú)菌蒸餾水腹腔注射。2.2實(shí)驗(yàn)分組與給藥 [0052]將動(dòng)物分別按體重隨機(jī)分為4組，分別為：
[0053] 空白對(duì)照組：分為亞組1(10只大鼠）和亞組2(10只大鼠）；均用等劑量無(wú)菌蒸餾水 腹腔注射并灌服生理鹽水；
[0054] 模型組:分為亞組1 (20只大鼠）和亞組2 (15只大鼠）；均用1.4g/kg劑量的D-GalN腹 腔注射并灌服生理鹽水；
[0055] 美能組:分為亞組1 (20只大鼠）和亞組2 (15只大鼠）；均用1.4g/kg劑量的D-GalN腹 腔注射并給予美能灌胃給藥15.6mg/kg/d。
[0056] 實(shí)驗(yàn)組(本發(fā)明藥物組合物）：分為亞組1(20只大鼠）和亞組2(15只大鼠）；
[0057]均用1.4g/kg劑量的D-GalN腹腔注射并給予本發(fā)明藥物6.25g/kg/d。給藥方法為 每日灌胃1次，造模前3天開始灌胃，連續(xù)5天。
[0058] 2.3觀察指標(biāo)和方法
[0059] (1)本發(fā)明藥物的藥效研究
[0060] 一般情況和生存期
[0061]亞組1大鼠：從造模時(shí)間點(diǎn)起，連續(xù)觀察96小時(shí)，觀察大鼠的一般情況，記錄死亡時(shí) 間和大鼠死亡數(shù)，計(jì)算平均生存時(shí)間以及生存率、肝功能、凝血功能、肝組織病理。
[0062] 亞組2大鼠：腹腔注射后36h經(jīng)股動(dòng)脈取血4ml置于干燥管中，另再取2ml置于枸櫞 酸納抗凝管中，送成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科以3000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速離心10分鐘分離出 血清，以檢測(cè)肝功能（釆用全自動(dòng)生化分析法)和凝血功能（釆用全自動(dòng)血凝分析法）。取血 完成后斷頸處死大鼠，平攤于超凈工作臺(tái)上，去除其胸、腹部體毛并用碘伏對(duì)去毛區(qū)進(jìn)行消 毒，鋪無(wú)菌洞巾，沿腹正中線打開腹腔，分離出肝組織，取出大小約1.0x1.0x0.2cm的肝左葉 相同部位，無(wú)菌生理鹽水洗凈血液后存放于10%甲醛溶液固定，送成都里來生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn) 中心作肝組織常規(guī)HE染色。
[0063] (2)本發(fā)明藥物組合物的免疫機(jī)制研究
[0064] 亞組2大鼠斷頸處死，取肝組織送常規(guī)HE染色的同時(shí)，另取出大小約 1.0 xl. 0x0.2cm的肝左葉相同部位并置于冰塊上，以PBS緩沖液清洗干凈后存放于凍存管 中，快速轉(zhuǎn)移至液氮中速凍后立即存放于_70°C冰箱中保存，送上海艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心， 采用半定量訂-?0?法檢測(cè)!《^1、1'1^4、即-1〇8、〇38?386-3 1111?熟表達(dá)水平，采用免疫組織化 學(xué)染色法檢測(cè)PCNA表達(dá)水平。
[0065] 3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
[0066] 本實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)處理均采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以i±s表示，組間 差異比較采用單因素方差分析，方差齊性用LSD法，方差不齊采用Dunnett ' s法；應(yīng)用 Kaplan-Meier法估計(jì)各組大鼠的生存時(shí)間，并釆用log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行組間生存分布比較。 所有P值均為雙向，且P<〇.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0067] 4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0068] (1)主要藥效研究結(jié)果
[0069] 一般情況:模型組于造模后12h出現(xiàn)進(jìn)食及活動(dòng)減少，反應(yīng)遲鈍，毛蓬松、豎立，或 全身皮毛為汗液浸濕，部分伴尿失禁、尿黃，精神萎糜、嗜睡，也可呈激惹狀態(tài);40h可發(fā)展至 昏睡狀態(tài)，痛覺反應(yīng)遲鈍或消失，尿深黃;終末期可見四肢或全身抽搐，口腔、四肢末端出 血。美能組及實(shí)驗(yàn)組大鼠，出現(xiàn)上述癥狀的次數(shù)較少，程度較輕，且持續(xù)時(shí)間更短更重要的 是，在治療過程中沒有發(fā)現(xiàn)與藥物相關(guān)的不良反應(yīng)。
[0070] a、生存期實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。
[0071] 結(jié)果顯示，經(jīng)過Kaplan-Meier分析，估計(jì)模型組的平均生存時(shí)間為64.6小時(shí)，美能 組的平均生存時(shí)間為71.9小時(shí)，本發(fā)明藥物組的平均生存時(shí)間為88.6小時(shí)，同時(shí)經(jīng)過log-rank 檢驗(yàn)提示，實(shí)驗(yàn)組的累積生存率高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P〈0.05)，表明本發(fā)明 藥物組合物能夠延長(zhǎng)生存時(shí)間，降低死亡率。
[0072] b、肝功能和凝血功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。
[0073] 表1血清 ALT、AST、TBIUALB、CHE、PT 水平
[0075] ΛΡ〈0 · 05vs空白組；▲?〈0 · 05vs模型組;★?〈0 · 05vs美能組。
[0076] 結(jié)果顯示，模型組大鼠血清ALT、AST、TBIL及PT水平顯著升高，同時(shí)血清ALB、CHE水 平顯著下降，與空白組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈〇.〇5);實(shí)驗(yàn)組在血清ALT、AST、TBIL及 PT水平上顯著下降，而在血清ALB、CHE水平上明顯上升，與模型組和美能組相比，差異均有 統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈〇.05)，表明本發(fā)明藥物組合物改善肝功能和凝血功能的藥效顯著，甚至比 陽(yáng)性藥物美能更好。
[0077] c、肝組織病理鏡下觀察結(jié)果見圖2。
[0078]結(jié)果顯示:空白組肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝索及肝竇清楚，肝細(xì)胞以中央靜脈為中心呈 放射狀排列，肝竇狀隙未見擴(kuò)張;肝細(xì)胞大小較均勻，肝細(xì)胞質(zhì)豐富，細(xì)胞核圓形、豐滿，匯 管區(qū)結(jié)構(gòu)正常。模型組肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝索及肝竇形態(tài)不清楚，部分肝細(xì)胞極度腫脹或有 脂肪空泡，并進(jìn)一步胞核消失、肝細(xì)胞壞死，壞死區(qū)域呈大片狀分布，壞死灶內(nèi)有孤立成團(tuán) 炎細(xì)胞，殘余匯管區(qū)內(nèi)亦可見炎細(xì)胞。美能組肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，部分肝細(xì)胞明顯腫脹或有脂 肪空泡，細(xì)胞間界限不清，胞漿淡染，肝細(xì)胞呈灶狀壞死、崩解，壞死灶內(nèi)有孤成團(tuán)立炎細(xì) 胞。實(shí)驗(yàn)組肝小葉結(jié)構(gòu)大致正常，肝索及肝竇較清楚，部分肝細(xì)胞漿輕度濁腫，細(xì)胞間尚有 界限，胞漿淡染;肝小葉內(nèi)可見散在的肝細(xì)胞壞死，匯管區(qū)結(jié)構(gòu)正常，個(gè)別匯管區(qū)內(nèi)有少許 炎細(xì)胞分布，其中以本發(fā)明藥物組病變最輕，效果最佳。
[0079] 肝組織病理評(píng)分見表2。
[0080] 表2肝組織病理積分
[0082] ΛΡ〈0 · 05vs空白組；▲?〈0 · 05vs模型組；★?〈0 · 05vs美能組。
[0083] 結(jié)果顯示，模型組大鼠肝組織病理?yè)p害積分顯著高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P〈0.05);與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組肝組織損害程度積分明顯下降(P〈0.01)，表明本發(fā)明藥物 組合物可明顯減少肝細(xì)胞的凋亡及壞死，能有效促進(jìn)肝臟再生能力的恢復(fù)，其藥效甚至比 陽(yáng)性藥物美能更好(P〈〇. 05)。
[0084] (2)免疫機(jī)制研究結(jié)果
[0085] a、HMGBl、TLR4、NF_K B、Caspase_3 mRNA表達(dá)水平，見表3〇
[0086] 表3腿681、1'1^4、陬-1〇8、〇38口386-3
1111?熟表達(dá)水平
[0088] ΛΡ〈0 · 05vs空白組；▲?〈0 · 05vs模型組；★?〈0 · 05vs美能組。
[0089] 結(jié)果顯示，在肝組織圓681、1'1^4、陬-1〇8、0&8? &86-3 1111?祖表達(dá)上，實(shí)驗(yàn)組低于模 型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈〇. 05);表明本發(fā)明藥物組合物可明顯抑制HMGB1-TLR4-NF-K B 信號(hào)通路，減少肝細(xì)胞的凋亡及壞死，其藥效甚至比陽(yáng)性藥物美能更好(P〈〇. 05)。
[0090] b、PCNA表達(dá)水平，見圖3、表4。
[0091] 表4PCNA表達(dá)水平
[0093] ΛΡ〈〇 · 05vs空白組；▲?〈0 · 05vs模型組；★?〈0 · 05vs美能組。
[0094] 結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組、美能組及實(shí)驗(yàn)組肝組織PCNA表達(dá)水平均有不同 程度的升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈〇.05);其中，實(shí)驗(yàn)組分別高于模型組和美能組，差異 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈〇.〇5)。
[0095]綜上，本發(fā)明藥物組合物可顯著減輕D-GalN誘導(dǎo)急性肝衰竭大鼠肝臟的炎癥反 應(yīng)，改善肝功能、凝血功能及肝臟病理，并延長(zhǎng)生存時(shí)間，降低死亡率。其發(fā)揮作用的機(jī)制可 能是抑制HMGB1-TLR4-NF-KB信號(hào)通路，減少肝細(xì)胞的凋亡及壞死，并有利于使受到抑制的 肝臟再生能力得以恢復(fù)，為中醫(yī)藥治療肝衰竭提供新的治法和制劑，具有廣闊的市場(chǎng)前景。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種治療肝衰竭的藥物組合物，其特征在于：它是由含有如下重量配比的原料藥制 備而成的制劑： 赤芍80-120份、桃仁40-60份、紅花40-60份、水蛭10-20份、全蝎5-15份、玄明粉5-15份、 大黃20-40份。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其特征在于:它是由下述重量配比的原料藥制備 而成的制劑： 赤芍100份、桃仁50份、紅花50份、水蛭15份、全蝎10份、玄明粉10份、大黃30份。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的藥物組合物，其特征在于：它是由赤芍、桃仁、紅花、水蛭、 全蝎、玄明粉、大黃的原生藥粉或水或有機(jī)溶劑提取物為活性成分，加入藥學(xué)上可接受的輔 料或輔助性成分制備而成的制劑。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的藥物組合物，其特征在于:所述的制劑是口服制劑。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的藥物組合物，其特征在于：所述口服制劑為顆粒劑、散劑、丸 劑、膠囊劑、片劑或口服液。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥物組合物，其特征在于:所述口服制劑為滴丸劑、軟膠囊劑。7. 權(quán)利要求1~6任意一項(xiàng)所述的藥物組合物的制備方法，其特征在于：它包括如下操 作步驟： (1) 按重量配比取原料藥； (2) 直接打粉，或取赤芍、桃仁、紅花、水蛭、全蝎先煎，再加入大黃煎煮，最后下玄明粉， 收集水煎液，濃縮，加上藥學(xué)上可用的輔料或輔助性成分制備成常規(guī)制劑。8. 權(quán)利要求1~6任意一項(xiàng)所述的藥物組合物在制備治療肝衰竭的藥物中的用途。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于:所述藥物是治療肝衰竭之瘀熱互結(jié)證的藥 物。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種治療肝衰竭的藥物組合物，它是由含有如下重量配比的原料藥制備而成的制劑：赤芍80-120份、桃仁40-60份、紅花40-60份、水蛭10-20份、全蝎5-15份、玄明粉5-15份、大黃20-40份。本發(fā)明還提供了所述藥物組合物的制備方法和用途，本發(fā)明藥物組合物可有效防治肝衰竭的并發(fā)癥，降低患者的病死率，具有較好的肝臟保護(hù)作用，為臨床用藥提供了一種新的選擇。
【IPC分類】A61K33/04, A61K35/646, A61K36/736, A61P1/16, A61K35/62
【公開號(hào)】CN105687383
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610080971
【發(fā)明人】扈曉宇, 張揚(yáng), 陳云鳳, 扈曉剛, 駱建興
【申請(qǐng)人】成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院
【公開日】2016年6月22日
【申請(qǐng)日】2016年2月4日