來(lái)自胎盤組織的粘附細(xì)胞及其在治療中的用圖
【專利說(shuō)明】來(lái)自胎盤組織的粘附細(xì)胞及其在治療中的用途
[0001] 本申請(qǐng)是2010年7月1日提交的題為"長(zhǎng)效凝固因子及產(chǎn)生其的方法"的中國(guó)專利 申請(qǐng)201080040296. X的分案申請(qǐng)。
[0002] 相關(guān)申請(qǐng)
[0003] 本申請(qǐng)要求2009年1月23日提交的臨時(shí)專利申請(qǐng)61/202，050和2008年9月2日提交 的臨時(shí)專利申請(qǐng)61 /136，375的優(yōu)先權(quán)的益處。
[0004] 所有以上文獻(xiàn)的內(nèi)容通過(guò)引用并入，如同在本文中完整呈現(xiàn)。
[0005] 發(fā)明領(lǐng)域和背景
[0006] 在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及胎盤組織的粘附細(xì)胞，更具體而言但不 排除其它的，本發(fā)明涉及培養(yǎng)胎盤組織的粘附細(xì)胞和將其用于治療的方法。
[0007] 近些年以來(lái)，相當(dāng)多的工作集中于間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞(MSC)在多個(gè)醫(yī)學(xué)應(yīng)用包括受 損器官例如腦、心臟、骨和肝臟的組織修復(fù)以及在支持骨髓移植(BMT)中的治療潛力。MSC是 獲自例如骨髓、脂肪組織、胎盤和血液的異質(zhì)細(xì)胞群體，其能夠分化為不同類型的細(xì)胞(例 如網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、骨生成性祖細(xì)胞），這取決于來(lái)自多個(gè)生物活性因 子的影響。因此，在再生醫(yī)學(xué)中已經(jīng)廣泛研究了 MSC，作為建立新組織例如骨、軟骨和脂肪的 基礎(chǔ)，以修復(fù)損傷或替換病理性組織并作為遺傳性和獲得性疾病的治療[Fibbe和Noort， Ann N Y Acad Sci(2003)996:235-44;Horwitz等人，Cytotherapy(2005)7(5):393-5; 21_6七和他代，8&8化1^8031(1丨01(2005)100(6):471-81]。此外，]\^(：的多潛能的能力、其 易于分離和培養(yǎng)以及其高度的離體擴(kuò)增潛力，使其成為吸引人的治療工具[Fibbe和Noort， 見上;Minguell等人Exp Biol Med(Maywood)(2001 )226(6):507-20]。
[0008] 越來(lái)越多的數(shù)據(jù)表明MSC逃脫同種異體反應(yīng)性細(xì)胞的識(shí)別并被認(rèn)為具有免疫豁免 特權(quán)（immune-privileged) [Le Blanc等人，Exp Hematol (2003)31 (10): 890-6]。由于具有 低免疫原性，所以MSC不被患者的免疫系統(tǒng)排斥，因此被認(rèn)為不需要HLA匹配。
[0009] 源自胎盤的MSC顯示出具有與分離自其它組織的MSC的很多共同的標(biāo)志物，例如 CD105、CD73、⑶90和⑶29，并且顯示出缺乏造血、內(nèi)皮和滋養(yǎng)層特異性細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)。 在適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)源自胎盤的MSC之后，實(shí)現(xiàn)了脂肪生成性、骨生成性和神經(jīng)生成性分化 [Yen等人，Stem Cells(2005)23(l):3-9]。此外，已經(jīng)證明分離自胎盤并在體外培養(yǎng)的MSC 具有類似于MSC的免疫豁免特權(quán)[Li等人，Ce 11 Res (2005) 15 (7): 539-47 ]。因此，胎盤提供 了倫理上無(wú)爭(zhēng)議的和容易獲得的MSC來(lái)源，以用于實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用[Zhang等人，Exp Hematol(2004)32(7):657-64]。另外，本發(fā)明人以前發(fā)明了適合于擴(kuò)增源自胎盤的MSC的三 維（3D)培養(yǎng)條件(W0/2007/108003)。
[0010] 發(fā)明概述
[0011] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式的一個(gè)方面，提供了培養(yǎng)來(lái)自胎盤或脂肪組織的粘附 細(xì)胞的方法，所述方法包括在允許細(xì)胞擴(kuò)增的三維(3D)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)來(lái)自胎盤或脂肪組 織的粘附細(xì)胞，所述條件包括灌注。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式的一個(gè)方面，提供了根據(jù)以上方法產(chǎn)生的細(xì)胞的群 體。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式的一個(gè)方面，提供了包含基本上如本文描述的基因表 達(dá)模式的細(xì)胞的群體。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式的一個(gè)方面，提供了細(xì)胞群體在制備鑒定為用于治療 可以從細(xì)胞或器官移植中獲益的病況的藥物中的用途。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式的一個(gè)方面，提供了在有此需要的受試者中誘導(dǎo)耐受 和/或免疫抑制的方法，所述方法包括向所述受試者給予治療上有效量的粘附細(xì)胞，從而在 所述受試者中誘導(dǎo)耐受和/或免疫抑制。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，根據(jù)培養(yǎng)基的葡萄糖濃度調(diào)整灌注。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，將培養(yǎng)基維持在大約550mg/L的葡萄糖濃度。
[0018]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，所述3D培養(yǎng)條件包括3D生物反應(yīng)器。
[0019]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，所述3D培養(yǎng)條件包含選自玻璃和塑料；聚酯、聚丙 烯、聚苯乙烯、葡聚糖和膠原的粘附材料。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，進(jìn)行所述3D培養(yǎng)條件至少3天。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)直至至少10%的細(xì)胞處于增殖中。
[0022] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，至少10%的粘附細(xì)胞處于增殖期。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，粘附細(xì)胞能夠抑制免疫反應(yīng)。
[0024] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，粘附細(xì)胞包含選自CD73、CD90、CD29、CD105和D7-fib 的陽(yáng)性標(biāo)志物表達(dá)。
[0025] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，粘附細(xì)胞包含選自⑶11b、⑶34、HLA-DR、⑶14、⑶19、 ⑶45、⑶31、⑶200和KDR的陰性標(biāo)志物表達(dá)。
[0026] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，粘附細(xì)胞包含基本上如本文描述的基因表達(dá)模式。
[0027] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，與來(lái)自骨髓并在相同條件下生長(zhǎng)和分化的粘附細(xì)胞 相比，所述粘附細(xì)胞向骨生成性譜系的定向較差。
[0028] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，與來(lái)自骨髓并在相同條件下生長(zhǎng)和分化的粘附細(xì)胞 相比，所述粘附細(xì)胞向脂肪生成性譜系的定向較差。
[0029] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，所述病況選自局部缺血、外周動(dòng)脈疾病(PAD)、臨界 性肢體缺血(critical limb ischemia) (CLI)、下肢遠(yuǎn)端缺血、缺血性血管疾病、腎臟的血 管疾病、缺血性心臟病、心肌缺血、冠狀動(dòng)脈疾病(CAD)、動(dòng)脈粥樣硬化心血管病、冠狀動(dòng)脈 左總干病、動(dòng)脈阻塞性疾病、外周缺血、外周血管病、動(dòng)脈硬化、缺血性腦部疾病、中風(fēng)、腦缺 血、腦血管疾病、視網(wǎng)膜病、視網(wǎng)膜修復(fù)、重塑性病癥、希佩爾-林道綜合征、遺傳性出血性毛 細(xì)血管擴(kuò)張性缺血性血管病、Buerger氏病、缺血性腎病、缺血性胎盤、生殖相關(guān)的病癥、移 植物抗宿主病、實(shí)體器官移植、造血干細(xì)胞移植、糖尿病、結(jié)締組織損傷、癌癥、癌前、骨癌、 骨肉瘤、骨轉(zhuǎn)移瘤、骨折、燒傷、關(guān)節(jié)軟骨缺損、創(chuàng)傷愈合、深傷、創(chuàng)傷愈合延遲、潰瘍愈合延 遲、軟骨下骨囊腫、骨質(zhì)疏松癥、骨關(guān)節(jié)炎、骨退化、軟骨損傷、關(guān)節(jié)軟骨缺損、腱受損、自身 免疫疾病、代謝病、牛皮癬、神經(jīng)痛、外周神經(jīng)損傷、腎移植的支撐物和炎性疾病。
[0030] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方式，所述病況選自炎性腸病（IBD)和克羅恩病。
[0031]除非另有指明，否則本文使用的所有技術(shù)和/或科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明相關(guān)技術(shù)領(lǐng) 域普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。雖然相似于或等同于本文描述的那些的方法和材料 可用于實(shí)施或測(cè)試本發(fā)明的實(shí)施方式，但是以下描述了示例性方法和/或材料。在出現(xiàn)沖突 的情況下，以專利說(shuō)明書(包括定義)為準(zhǔn)。此外，材料、方法和實(shí)施例僅為解釋目的，不是意 在必要性的限制。
【附圖說(shuō)明】
[0032] 僅通過(guò)舉例的方式，通過(guò)參考以下附圖，本文描述了本發(fā)明的一些實(shí)施方式?，F(xiàn)在 通過(guò)詳細(xì)地特別參考附圖，旨在說(shuō)明所顯示的詳細(xì)內(nèi)容僅是舉例方式并且是為了解釋性討 論本發(fā)明的實(shí)施方式的目的。在此意義上，說(shuō)明書以及附圖使本領(lǐng)域技術(shù)人員明白可以如 何實(shí)施本發(fā)明的實(shí)施方式。
[0033] 在附圖中：
[0034]圖1是流程圖，其顯示了根據(jù)本文教導(dǎo)從胎盤產(chǎn)生3D粘附細(xì)胞(稱作PLX-C細(xì)胞）。 [0035] 圖2是從The New Brunswick Scientific網(wǎng)站改編而來(lái)的示例性的生物反應(yīng)器的 管和端口的示意圖。
[0036] 圖3A-B顯示了通過(guò)Plurix制備的3D粘附細(xì)胞(稱作PLX，圖3B)和通過(guò)本文教導(dǎo)制 備的3D粘附細(xì)胞(稱作PLX-C，圖3A)的細(xì)胞周期分析。將細(xì)胞固定于70 %的EtOH 0. N，離心 并重懸于碘化丙啶(PI)溶液，然后通過(guò)FACS分析。
[0037]圖4A-D顯示:在PLX-C上存在成纖維細(xì)胞典型性的標(biāo)志物的表達(dá)，但沒有內(nèi)皮細(xì)胞 典型性的標(biāo)志物的表達(dá)。圖4A顯示了內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物⑶31的陰性表達(dá)；圖4B顯示了內(nèi)皮細(xì) 胞標(biāo)志物KDR的陰性表達(dá)；圖4C顯示了人成纖維細(xì)胞標(biāo)志物(D7-FIB)的陽(yáng)性表達(dá)，其中同種 型IgGl(FITC)的紅色柱狀圖代表陰性對(duì)照；藍(lán)色柱狀圖代表陽(yáng)性染色的細(xì)胞；圖4D顯示了 人⑶200標(biāo)志物的陰性表達(dá)(同種型IgGl(PE)的粉紅色柱狀圖代表陰性對(duì)照;綠色柱狀圖代 表陽(yáng)性染色的細(xì)胞）。
[0038]圖5A-D顯示了PLX-C細(xì)胞上的刺激性和共刺激分子的表達(dá)。圖5A顯示了PLX-C的 ⑶80的表達(dá)；圖5B顯示了PLX-C的⑶86的表達(dá)；圖5C顯示了PLX-C的⑶40的表達(dá)；圖顯示了 PLX-C的HLA-A/B/C的表達(dá)。以相關(guān)的同種型熒光分子制備陰性對(duì)照。值得注意的是，紅色柱 狀圖代表表達(dá)PLX-C標(biāo)志物的細(xì)胞群體，藍(lán)色柱狀圖代表表達(dá)骨髓(BM)標(biāo)志物的細(xì)胞群體， 綠色柱狀圖代表表達(dá)單核細(xì)胞(MNC)標(biāo)志物的細(xì)胞群體。
[0039] 圖6A-B顯示了PLX-C對(duì)于淋巴細(xì)胞增殖的抑制。圖6A顯示了以2xl05個(gè)源自外周血 (PB)的單核細(xì)胞(麗C，供體A)(其經(jīng)過(guò)等量的經(jīng)輻射的（3000Rad)源自I3B的MNC(供體B)的刺 激，然后向培養(yǎng)物中加入數(shù)量漸增的PLX-C細(xì)胞)進(jìn)行的混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)測(cè)試。每組 一式三份接種于96孔平板。通過(guò)[ 3H]胸苷摻入測(cè)定增殖速率；圖6B顯示了以ConA(1.5mg/ ml)刺激的源自外周血(PB)的MNC。向培養(yǎng)物中加入數(shù)量漸增的PLX-C細(xì)胞。每組一式三份接 種于96孔平板。通過(guò)[ 3H ]胸苷摻入測(cè)定增殖速率。
[0040]圖7A-C顯示了與外周血細(xì)胞共培養(yǎng)之后，PLX-C對(duì)于促炎性和抗炎性細(xì)胞因子分 泌的調(diào)節(jié)。圖7A-B顯示了源自人的MNC(分離自外周血，經(jīng)過(guò)ConA刺激)與PLX-C共培養(yǎng)之后， IFN γ (圖7A)和TNFa(圖7B)的分泌；圖7C顯示了源自人的MNC(分離自外周血，經(jīng)過(guò)LPS刺激） 與PLX-C共培養(yǎng)之后，IFNγ、TNFa和IL-10的分泌。收集上清液并通過(guò)ELISA分析細(xì)胞因子。 [0041]圖8A-F是照片，其顯示了在骨生成或脂肪生成的分化條件下，骨髓和胎盤細(xì)胞的 生長(zhǎng)。將源自骨髓的細(xì)胞（圖8A-C)或源自胎盤的細(xì)胞（圖8D-F)植板于包被了玻連蛋白 (vitronection)和膠原的24孔板中的生長(zhǎng)培養(yǎng)基（圖8A和8D)、骨生成分化培養(yǎng)基（圖8B和 8E)或脂肪生成分化培養(yǎng)基（圖8C和8F)。每3-4天更換培養(yǎng)基。在生長(zhǎng)期末尾，按照以下實(shí)施 例部分的詳細(xì)描述將細(xì)胞固定、染色并照相。
[0042]圖9A-F是照片，其顯示了在修改的骨生成或脂肪生成的分化條件下，骨髓和胎盤 細(xì)胞的生長(zhǎng)。將源自骨髓的細(xì)胞（圖9A-C)或源自胎盤的細(xì)胞（圖9D-F)植板于包被了玻連蛋 白和膠原的24孔板中的生長(zhǎng)培養(yǎng)基（圖9A和9D)、骨生成分化培養(yǎng)基（圖9B和9E)或脂肪生成 分化培養(yǎng)基（圖9C和9F)。每3-4天更換培養(yǎng)基。在生長(zhǎng)期末尾，按照以下實(shí)施例部分的詳細(xì) 描述將細(xì)胞固定、染色并照相。
[0043]圖10顯示了用于感染PLX-C細(xì)胞的螢光素酶表達(dá)載體。在本文中使用的是來(lái)自 OmicsLink的表達(dá)載體Lv33。將螢光素酶基因克隆進(jìn)入0RF。
[0044]圖11顯示了經(jīng)感染的PLX-C細(xì)胞中螢光素酶的高度表達(dá)。以螢光素酶表達(dá)載體感 染細(xì)胞，在感染后48小時(shí)通過(guò)IVIS系統(tǒng)顯示。值得注意的是:細(xì)胞顯示出高水平的螢光素酶 表達(dá)。
[0045] 圖12A-D顯示了將2xl06個(gè)表達(dá)螢光素酶的PLX-C細(xì)胞注射進(jìn)入SCID/Beige小鼠。 一只小鼠通過(guò)IM方式注射，一只通過(guò)IV方式注射。使用IVIS系統(tǒng)監(jiān)視經(jīng)注射的小鼠，以測(cè)定 PLX-C的體內(nèi)生物分布。顯示了第1天（圖12A)、第4天（圖12B)、第6天（圖12C)和第22天（圖 12D)的IVIS結(jié)果。
[0046]本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】的描述
[0047]在本發(fā)明的一些【具體實(shí)施方式】中，本發(fā)明涉及胎盤組織的粘附細(xì)胞，更具體而言 但不排除其它的，本發(fā)明涉及培養(yǎng)胎盤組織的粘附細(xì)胞和將其用于治療的方法。
[0048]通過(guò)參考附圖和隨附的說(shuō)明書可以更好地理解本發(fā)明的原理和操作。
[0049] 在詳細(xì)解釋本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施方式之前，應(yīng)該理解，本發(fā)明不是一定要限制 在如以下描述中記載或通過(guò)實(shí)施例例示的細(xì)節(jié)上的應(yīng)用。本發(fā)明具有其它實(shí)施方式或者可 以以多種方式實(shí)施或進(jìn)行。同樣應(yīng)該理解，本文使用的術(shù)語(yǔ)和命名是為了描述的目的，不應(yīng) 該被認(rèn)為是限制。
[0050] 在將本發(fā)明付諸實(shí)施時(shí)，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn):在包括灌注的三維（3D)培養(yǎng)條件下培養(yǎng) 源自胎盤的粘附細(xì)胞，產(chǎn)生了大量的具有以下特征的粘附細(xì)胞:獨(dú)特的基因表達(dá)模式、能夠 抑制免疫應(yīng)答并且是高度增殖性的。因此，這些胎盤粘附細(xì)胞可用于治療性應(yīng)用。
[0051] 如下文和隨后的實(shí)施例部分的實(shí)施例1-8所解釋，本發(fā)明人能夠在3D條件下擴(kuò)增 源自胎盤的粘附細(xì)胞。本發(fā)明的3D條件包括生物反應(yīng)器內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)基的灌注(見實(shí)施例 2)。如實(shí)施例3所示，本發(fā)明的胎盤粘附細(xì)胞具有基質(zhì)干細(xì)胞特性，例如，它們表達(dá)基質(zhì)干細(xì) 胞的典型性細(xì)胞標(biāo)志物，并且具有免疫抑制特性。此外，這些細(xì)胞是高度增殖性的（28%的 細(xì)胞處于S和G2/M期)并且在施用之后在體內(nèi)保持?jǐn)?shù)周(見實(shí)施例3和8)，這說(shuō)明這些細(xì)胞可 用于治療。
[0052]另外，在其2D階段，本發(fā)明的源自胎盤的粘附細(xì)胞不分化為骨細(xì)胞(實(shí)施例4-5)或 脂肪細(xì)胞(實(shí)施例6-7)，這與骨髓粘附細(xì)胞截然相反：當(dāng)在相同條件下生長(zhǎng)時(shí)，有高比例(超 過(guò)50 % )的骨髓粘附細(xì)胞進(jìn)行分化。
[0053]因此，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了培養(yǎng)來(lái)自胎盤或脂肪組織的粘附細(xì)胞的方 法，所述方法包括在允許細(xì)胞擴(kuò)增的三維(3D)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)來(lái)自胎盤或脂肪組織的粘附 細(xì)胞，所述條件包括灌注。
[0054] 如本文使用的詞語(yǔ)"粘附細(xì)胞"是指同質(zhì)或異質(zhì)的細(xì)胞群體，其是錨定依賴性的， 即需要附著至表面以在體外生長(zhǎng)。
[0055] 如本文使用的詞語(yǔ)"脂肪組織"是指包括脂肪細(xì)胞(脂細(xì)胞)的結(jié)締組織。
[0056] 如本文使用的術(shù)語(yǔ)"胎盤組織"是指哺乳動(dòng)物器官的任何部分，其沿著子宮壁并且 在妊娠過(guò)程中包被胎兒，與胎兒通過(guò)臍帶連接。出生之后，胎盤被排出（其被稱作產(chǎn)后胎 盤）。在示例性的實(shí)施方式中，胎盤是指整個(gè)胎盤。
[0057]根據(jù)本文的教導(dǎo)，使用三維(3D)培養(yǎng)條件繁殖源自胎盤或脂肪組織的粘附細(xì)胞。
[0058]如本文使用的詞語(yǔ)"三維培養(yǎng)物"是指這樣的培養(yǎng)物:其中細(xì)胞被置于與細(xì)胞生長(zhǎng) 相容的條件下，所述條件包括支架，該支架允許細(xì)胞與細(xì)胞的三維接觸。熟知的是，活的生 物體(或組織）中的細(xì)胞的原位環(huán)境是在三維架構(gòu)中。細(xì)胞被其它細(xì)胞所環(huán)繞。它們被保持 在細(xì)胞外基質(zhì)納米級(jí)纖維的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)中，這允許建立多個(gè)局部微環(huán)境。它們的細(xì)胞外配體 不僅介導(dǎo)與基底膜的連接，而且介導(dǎo)通向多個(gè)血管和淋巴管。氧氣、激素和營(yíng)養(yǎng)物被運(yùn)送至 細(xì)胞;廢物被排出。本發(fā)明的三維培養(yǎng)物的條件被設(shè)計(jì)為模擬此環(huán)境，如以下進(jìn)一步所例 不。
[0059]將認(rèn)識(shí)到，三維培養(yǎng)物的條件是能夠擴(kuò)增粘附細(xì)胞。
[0000]如本文使用的術(shù)語(yǔ)"擴(kuò)增（expanding)"和"擴(kuò)增（expans ion)"是指基本上無(wú)分化 的細(xì)胞維持和最終的(ultimately)細(xì)胞生長(zhǎng)，即細(xì)胞群體的增長(zhǎng)(例如至少2倍），此增長(zhǎng)不 伴隨分化。
[0061 ] 如本文使用的術(shù)語(yǔ)"維持(maintaining)"和"維持(maintenance)"是指基本上無(wú) 分化的細(xì)胞更新，即基本上穩(wěn)態(tài)的細(xì)胞群體，此穩(wěn)態(tài)不伴隨分化。
[0062] 如上所述，本發(fā)明的這個(gè)方面的粘附細(xì)胞獲自胎盤或脂肪組織。
[0063] 胎盤細(xì)胞可以獲自足月的或不足月的胎盤。優(yōu)選地，在胎盤完成出血（ex blooded)之