用將細(xì)胞懸浮液 從接種瓶轉(zhuǎn)移進(jìn)入生物反應(yīng)器。
[0179] 在Ce Iligen生物反應(yīng)器中產(chǎn)生粘附細(xì)胞(PLX-C)
[0180] 生物反應(yīng)器之描述
[0181] 使用如圖2所示的自動(dòng)化CelliGenPlus?或BIOFLO 310生物反應(yīng)器系統(tǒng)[(New Brunswick Scientific(NBS)]進(jìn)行3D生長(zhǎng)期。生物反應(yīng)器系統(tǒng)用于培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)物，其中 的條件適合于高細(xì)胞濃度。以灌注模式使用生物反應(yīng)器進(jìn)行培養(yǎng)過(guò)程。實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的生物 反應(yīng)器由兩個(gè)主系統(tǒng)構(gòu)成一控制系統(tǒng)和生物反應(yīng)器本身(管和附件）。通過(guò)控制臺(tái)監(jiān)視并控 制過(guò)程的參數(shù)，所述控制臺(tái)包括探測(cè)器、發(fā)動(dòng)機(jī)和栗的連接器，溶解氧(D0)、pH、灌注和攪拌 (具有發(fā)動(dòng)機(jī))的操縱系統(tǒng)、氣體控制系統(tǒng)、用于溫度控制的水循環(huán)和加熱系統(tǒng)以及操作界 面。受控的過(guò)程參數(shù)(例如溫度、pH、D0等)可以顯示于操作界面上并由指定的控制人員進(jìn)行 監(jiān)視。
[0182] 生物反應(yīng)器中的細(xì)胞培養(yǎng)物生長(zhǎng)程序
[0183]如以上的部分所述，將來(lái)自冷凍保存的2DCS的150 ± 50x IO6個(gè)細(xì)胞解凍，清洗并接 種于無(wú)菌生物反應(yīng)器中。生物反應(yīng)器含有30-50gr由聚酯和聚丙烯制成的載體(FibmCel? disks，NBS)和1.5 ± 0.1 L 3D-培養(yǎng)基。生物反應(yīng)器中的生長(zhǎng)培養(yǎng)基保持在以下條件：37 °C， 70 %溶解氧(DO)和pH 7.3。供應(yīng)由控制系統(tǒng)決定的經(jīng)過(guò)濾的氣體(空氣、CO2、N2和O2 )，以將 DO值保持在70 %，將pH值保持在7.3。對(duì)于前24個(gè)小時(shí)，以50轉(zhuǎn)/分(RPM)攪拌培養(yǎng)基，并在第 二天增大至200RPM。對(duì)于前2-3天，細(xì)胞以批式模式生長(zhǎng)。當(dāng)培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度下降至 低于500mg/L時(shí)啟動(dòng)灌注。使用無(wú)菌硅膠管將培養(yǎng)基從加料器栗至生物反應(yīng)器。所有的管的 連接都在層流凈化柜中使用無(wú)菌連接器進(jìn)行。每日調(diào)整灌注，以使葡萄糖濃度恒定保持在 大約550±50mg/L。每1-2天取出生長(zhǎng)培養(yǎng)基的樣品以測(cè)定葡萄糖、乳酸鹽、谷氨酰胺、谷氨 酸和銨濃度(BioProfile 400分析儀，Nova Biomedical)。細(xì)胞培養(yǎng)物的葡萄糖消耗速率和 乳酸鹽形成速率能夠測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)速率。這些參數(shù)用于基于積累的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)確定收獲時(shí) 間。
[0184] 從生物反應(yīng)器中收獲3D生長(zhǎng)的PLX-C細(xì)胞
[0185] 在生長(zhǎng)期的末尾(4-12天)開始細(xì)胞收獲過(guò)程。收集生長(zhǎng)培養(yǎng)基的2個(gè)樣品。制備一 個(gè)樣品以送去經(jīng)批準(zhǔn)的GLP實(shí)驗(yàn)室根據(jù)USP和EU標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行支原體測(cè)試。該培養(yǎng)基樣品被認(rèn)為 是最終產(chǎn)物的支原體測(cè)試的一部分，結(jié)果被認(rèn)為是產(chǎn)物釋放標(biāo)準(zhǔn)的一部分。
[0186] 在3DP室中在Class-100層流區(qū)收獲3D-生長(zhǎng)培養(yǎng)物，如下所述：
[0187] 通過(guò)重力作用通過(guò)管道將生物反應(yīng)器的管排空至廢液容器。然后以1.5L預(yù)熱的 PBS(37°C)重新充滿生物反應(yīng)器的管。將攪拌速率增加至150RPM，持續(xù)2分鐘。通過(guò)壓力或重 力使PBS通過(guò)管道引流進(jìn)入廢液瓶。清洗程序重復(fù)兩次。
[0188] 為了使細(xì)胞從載體上釋放，將I . 5L預(yù)熱至3 7 °C的胰蛋白酶-EDTA (胰蛋白酶 0.25%，EDTA ImM)加入到生物反應(yīng)器的管中，在37°C以150RPM將載體攪拌1-4分鐘。將 250ml FBS加入到生物反應(yīng)器的管中，將細(xì)胞懸浮液收集到5L無(wú)菌容器中。將細(xì)胞懸浮液分 裝入500ml無(wú)菌離心管，離心（1200RPM，10分鐘，4°C)，然后以5-30~10 6個(gè)細(xì)胞/毫升的濃度 重懸于冷凍保存溶液。將細(xì)胞以無(wú)菌方式注入并冷凍保存，作為PLX-C。
[0189] 實(shí)施例3
[0190] W0/2007/108003 (PLX)的粘附細(xì)胞與本發(fā)明的粘附細(xì)胞的比較
[0191] 將如以上實(shí)施例1所描述的通過(guò)W0/2007/108003產(chǎn)生的粘附細(xì)胞(在本文中稱作 PLX)與本發(fā)明的新的粘附細(xì)胞(在本文中稱作PLX-C)進(jìn)行比較。
[0192] 材料和實(shí)驗(yàn)方法
[0193] 細(xì)胞周期分析-將通過(guò)Celligen獲得的PLX-C細(xì)胞和通過(guò)Plurix獲得的PLX細(xì)胞以 70%Et0H 0.N固定，離心并重懸于含有2μg/ml PI(Sigma)、0.2mg/ml Rnase A(Sigma)和 0.1 % (v/v) Triton(Sigma)的碘化丙啶(PI)溶液中30分鐘。通過(guò)FACS分析細(xì)胞周期。
[0194] 基因表達(dá)陣列（微陣列）-從人足月胎盤獲得粘附細(xì)胞并通過(guò)Plurix或通過(guò) Celligen擴(kuò)增。從每種擴(kuò)增方法獲得三個(gè)不同批次的細(xì)胞，用于進(jìn)一步檢查。
[0195] 從細(xì)胞中提取RNA( Qiagen-Rneasy微試劑盒）并應(yīng)用至Affymetrix全基因組表達(dá) 陣列。芯片使用GeneChip?Human Exon I .OST Array(Affymetrix，Santa Clara, California,USA)〇
[0196] 膜標(biāo)志物的FACS分析-按照之前的描述以單克隆抗體將細(xì)胞染色。簡(jiǎn)而言之，將 400，000-600，000個(gè)細(xì)胞懸于5ml試管中的0.1 ml流式細(xì)胞術(shù)緩沖液中，并在室溫(RT)在黑 暗中與下列單克隆抗體(MAb)中的每一種一起孵育15分鐘：FITC-綴合的抗-人CD29MAb (eBioscience)、PE綴合的抗人CD73MAb(BectonDickinson)、PE綴合的抗人CD105MAb (eBioscience)，PE綴合的抗人CD90MAb(Becton Dickinson)、FITC_綴合的抗-人CD45MAb (IQProducts )、PE-綴合的抗-人CD19MAb (IQProducts)、PE綴合的抗人CD14MAb (IQProducts)、FITC綴合的抗人HLA-DR MAb(IQProduct)、PE綴合的抗人CD34MAb (IQProducts)、FITC綴合的抗人CD31MAb(eBioscience)、FITC綴合的抗人KDR MAb(R&D systems)、抗人成纖維細(xì)胞標(biāo)志物(D7-FIB)MAb(ACRIS)、FITC-綴合的抗-人 CD80MAb(BD)、 FITC-綴合的抗-人 CD86MAb(BD)、PE 綴合的抗-人 CD200MAb(BD)、FITC-綴合的抗-人 CD40MAb (BD)、FITC-綴合的抗-人HLA-ABC MAb(K))、FITC綴合的同種型IgGl(IQ Products)、PE綴合 的同種型IgGl(IQ Products)。
[0197] 使用流式細(xì)胞術(shù)緩沖液將細(xì)胞清洗2次，重懸于500μ1流式細(xì)胞術(shù)緩沖液并使用 FC-500流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。使用相關(guān)的同種型焚光 分子制備陰性對(duì)照。
[0198] 混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)
[0199] 將2xIO5個(gè)源自外周血(PB)的MNC(來(lái)自供體A)使用等量的經(jīng)輻射(3000Rad)的源 自I 3B的MNC (來(lái)自供體B)進(jìn)行刺激。向培養(yǎng)物中加入數(shù)量漸增的PLX-C。將每個(gè)組一式三份接 種于96孔板。將細(xì)胞培養(yǎng)于含有20%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中。在5-天培養(yǎng)期的最后18個(gè) 小時(shí)使用IyC 3H-胸苷對(duì)平板進(jìn)行脈沖。通過(guò)纖維玻璃過(guò)濾器收獲細(xì)胞，并使用閃爍計(jì)數(shù)器 定量胸苷攝取量。
[0200] 對(duì)于CFSE染色，在培養(yǎng)前將I3B-MNC細(xì)胞進(jìn)行CFSE(Molecular Probes)染色以測(cè)定 增殖。5天后收集細(xì)胞并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CFSE染色的強(qiáng)度。
[0201] ELISA
[0202] 按照之前的描述進(jìn)行ELISA。簡(jiǎn)而言之，在存在PLX-C的情況下，在37°C在加濕的 5%C02空氣下以5μg/ml ConA(Sigma)、0.5μg/ml LPS(SIGMA)或 10μg/ml PHA(SIGMA)刺激 MNC(分離自外周血）。收集上清液并使用針對(duì)IFN γ (DIACLONE)、TNFa(DIACL0NE)和IL-10 (DIACL0NE)的ELISA試劑盒進(jìn)行細(xì)胞因子分析。
[0203]實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0204] 與使用Plurix相比，使用Celligen制備中的改變產(chǎn)生了數(shù)個(gè)主要差異（總結(jié)于下 表1) 〇
[0205] 表1=Plurix系統(tǒng)(W0/2007/108003)和Celligen系統(tǒng)(本發(fā)明的教導(dǎo))之間的比較



[0210]生產(chǎn)過(guò)程中的改變導(dǎo)致所獲得的粘附細(xì)胞的特性的改變。這些區(qū)別總結(jié)如下。 [0211] 通過(guò)Plurix制備的PLX與通過(guò)Celligen制備的PLX-C的細(xì)胞周期分析之對(duì)比-將通 過(guò)Celligen獲得的PLX-C細(xì)胞與通過(guò)Plurix獲得的PLX細(xì)胞進(jìn)行比較，以檢測(cè)在細(xì)胞周期的 不同階段的細(xì)胞分布。如圖3A-B所清楚地顯示，通過(guò)Celligen擴(kuò)增的PLX-C細(xì)胞顯示出典型 的增殖模式(細(xì)胞周期的不同階段的細(xì)胞分布）。具體而言，28%的細(xì)胞處于S和G2/M期（圖 3A)。這些結(jié)果表明細(xì)胞是在增殖過(guò)程中被收獲的，并且Celligen生物反應(yīng)器條件支持細(xì)胞 生長(zhǎng)。
[0212] 通過(guò)Plurix和Cel Iigen獲得的細(xì)胞之間的微陣列比較-基因表達(dá)陣列能夠同時(shí)監(jiān) 視通過(guò)Plurix(PLX)或通過(guò)Celligen(PLX-C)擴(kuò)增的來(lái)自人足月胎盤的粘附細(xì)胞的整個(gè)基 因組范圍的表達(dá)模式。這些結(jié)果能夠評(píng)估通過(guò)這些不同生長(zhǎng)方法獲得的細(xì)胞之間表型差異 的分子機(jī)理(見(jiàn)下表2)。
[0213] 表2:Plurix細(xì)胞(W0/2007/108003)和Celligen細(xì)胞(本發(fā)明的教導(dǎo)）的基因表達(dá) 的比較



















苷摻入法所測(cè)定。此外，淋巴細(xì)胞增殖的減少(通過(guò)CPM測(cè)定來(lái)估計(jì)）隨著PLX-C細(xì)胞數(shù)目的 增加而增大（以劑量依賴性方式）ILX-C還減少有絲分裂刺激物例如刀豆素 A(Con A，圖6B) 和植物血細(xì)胞凝集素(PHA)刺激后的淋巴細(xì)胞增殖，以及抗-CD3、抗-CD28的非特異性刺激 后的淋巴細(xì)胞增殖(數(shù)據(jù)未顯示）。
[0239]為了研究PLX-C免疫調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞增殖的作用機(jī)理，并且確定該作用是否通過(guò)細(xì) 胞與細(xì)胞的相互作用或細(xì)胞因子的分泌來(lái)介導(dǎo)，通過(guò)transwell方法(其阻止細(xì)胞與細(xì)胞的 接觸但使細(xì)胞因子能夠在兩個(gè)室之間擴(kuò)散)使用PHA刺激源自I 3B的單核細(xì)胞(MNC)。結(jié)果顯 示即使當(dāng)細(xì)胞與細(xì)胞的接觸被抑制時(shí)，仍然維持了增殖的抑制(數(shù)據(jù)未顯示）。
[0240] 細(xì)胞因子分泌-如上文所顯示，PLX-C減少淋巴細(xì)胞的增殖率，可能是通過(guò)可溶性 因子進(jìn)行。進(jìn)行了關(guān)于淋巴細(xì)胞響應(yīng)于PLX-C而分泌的細(xì)胞因子的進(jìn)一步研究，以闡釋PLX-C的作用機(jī)理。如圖7A-B所示，將單核細(xì)胞與PLX-C-起培養(yǎng)稍許減少了促炎性細(xì)胞因子IFN γ的分泌并顯著降低了TNFa的分泌（即使是在存在少量的PLX-C的情況下）。此外，以脂多糖 (LPS)刺激后，在存在PLX-C的情況下，源自PB的麗C分泌的IL-10增加，而TNFa的分泌水平下 降，其為劑量依賴性方式(圖7C)。
[0241] 實(shí)施例4
[0242] 本發(fā)明的2D粘附細(xì)胞和骨髓細(xì)胞的骨細(xì)胞分化之比較
[0243] 使本發(fā)明的新的粘附細(xì)胞(來(lái)自胎盤)在其2D粘附細(xì)胞階段生長(zhǎng)于骨細(xì)胞分化刺 激條件下，與源自骨髓的細(xì)胞進(jìn)行比較。
[0244] 材料和實(shí)驗(yàn)方法
[0245] 骨生成
[0246] 根據(jù)Chemicon骨生成試劑盒（cat no·scr028,Millipore，MA,USA)進(jìn)行骨生成。
[0247] 骨生成誘導(dǎo)培養(yǎng)基
[0248] 使用試劑盒的成分(見(jiàn)下表3)，在每次更換培養(yǎng)基之前新鮮制備骨生成誘導(dǎo)培養(yǎng) 基。
[0249]表3:骨生成培養(yǎng)基成分
[0251] 為了獲得ImM地塞米松溶液，將900μ1乙醇加至100μΙ地塞米松IOmM溶液中。將貯液 與試劑盒的其余成分儲(chǔ)存于_20°C。將50ml血清管熱滅活，分成5ml的等份并保存在-20 °C直 至使用。
[0252] 包被24孔組織培養(yǎng)板
[0253]通過(guò)使用lx PBS稀釋玻連蛋白和膠原制備包含12μg/ml玻連蛋白和12μg/ml膠原 (二者都包括在試劑盒中）的包被混合物。
[0254] 然后將包被混合物加入到孔中以覆蓋孔表面(制備2個(gè)平板，每個(gè)平板5個(gè)孔）。將 平板在室溫過(guò)夜溫育。然后除掉包被混合物，并使用PBS將孔潤(rùn)洗1次。在臨近使用前將平板 中液體吸出。
[0255] 細(xì)胞生長(zhǎng)
[0256] 將源自胎盤的細(xì)胞(plcll-3-l)或源自骨髓的細(xì)胞(BM108)植于(200，000個(gè)細(xì)胞/ 孔）Iml生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，其包含DMEM(Invitrogen ,Gibco)，10%FCS( Invitrogen,Gibco)，2Mm L-谷氨酰胺（Sigma-Aldrich)，45μg/ml慶大霉素_IKA(Teva Medical)和0 · 25μg/ml兩性霉 素 （Invitrogen ,Gibco)。使源自胎盤的細(xì)胞(2個(gè)平板，每個(gè)平板4個(gè)孔)或源自骨髓的細(xì)胞 (2個(gè)平板，每個(gè)平板1個(gè)孔)生長(zhǎng)至100%匯合度(通常是過(guò)夜），然后啟動(dòng)骨生成分化。
[0257] 當(dāng)細(xì)胞達(dá)到100%匯合度時(shí)，吸出生長(zhǎng)培養(yǎng)基并替換為Iml骨生成誘導(dǎo)培養(yǎng)基(分 化第1天）。每2-3天將骨生成誘導(dǎo)培養(yǎng)基更換為新鮮培養(yǎng)基，總共持續(xù)14-17天。
[0258] 作為對(duì)照，兩個(gè)平板中的一個(gè)(對(duì)于每種細(xì)胞類型）不以骨生成分化培養(yǎng)基溫育， 而是以生長(zhǎng)培養(yǎng)基(如上文所述)溫育。
[0259] 在第17天，將骨細(xì)胞固定并以茜素紅(Alizarin Red)溶液染色，如下文詳述。
[0260] 染色步驟
[0261] 骨細(xì)胞的染色這樣進(jìn)行:首先小心地將培養(yǎng)基從每個(gè)孔中吸出（要小心，以免吸出 細(xì)胞）。然后通過(guò)將細(xì)胞在室溫在冰冷的70%乙醇中溫育1小時(shí)而將細(xì)胞固定。然后小心地 吸出乙醇，使用水將細(xì)胞潤(rùn)洗2次(每次潤(rùn)洗5-10分鐘）。然后吸出水，并將茜素紅溶液(500-ΙΟΟΟμΙ)加入到細(xì)胞中。然后將細(xì)胞與茜素紅溶液在室溫溫育30分鐘。除掉茜素紅，以Iml水 清洗細(xì)胞4次，每次清洗后吸出液體。最后，向每個(gè)孔中加入I -1.5ml水以防止細(xì)胞干燥。通 過(guò)Nikon倒置顯微鏡鏡檢平板。
[0262] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0263] 源自胎盤的或源自骨髓的粘附細(xì)胞在骨生成誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的骨細(xì)胞分化產(chǎn)生了 50%以上的骨髓細(xì)胞的分化，如陽(yáng)性茜素紅染色所示（圖8B)。相反，本發(fā)明的源自胎盤的細(xì) 胞沒(méi)有顯示任何骨生成分化的跡象(見(jiàn)圖8E和下表4)。
[0264] 表4:分化總結(jié)
[0266] 實(shí)施例5
[0267] 本發(fā)明的2D粘附細(xì)胞和骨髓細(xì)胞在改良的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的骨細(xì)胞分化之比較
[0268] 使本發(fā)明的粘附細(xì)胞(來(lái)自胎盤，在其2D粘附細(xì)胞階段)或源自骨髓的細(xì)胞在骨細(xì) 胞分化刺激條件下生長(zhǎng)于包含維生素 D和較高濃度的地塞米松的改良的骨生成培養(yǎng)基中。
[0269] 材料和實(shí)驗(yàn)方法 [0270]骨生成誘導(dǎo)培養(yǎng)基
[0271]使用下表5列出的成分以及維生素 D，在每次更換培養(yǎng)基之前新鮮制備骨生成誘導(dǎo) 培養(yǎng)基。
[0272]表5:骨生成培養(yǎng)基成分
[0274] 將50ml血清管熱滅活，分成5ml的等份并保存在-20 °C直至使用。
[0275] 包被48孔組織培養(yǎng)板
[0276]通過(guò)使用lx PBS稀釋玻連蛋白和膠原制備包含12μg/ml玻連蛋白和12μg/ml膠原 (二者都來(lái)自Chemicon)的包被混合物。
[0277] 然后將包被混合物加入到孔中以覆蓋孔表面(制備2個(gè)平板，每個(gè)平板5個(gè)孔）。將 平板在室溫過(guò)夜溫育。然后除掉包被混合物，并使用PBS將孔潤(rùn)洗1次。在臨近使用前將平板 中液體吸出。
[0278] 細(xì)胞生長(zhǎng)
[0279] 將源自胎盤的細(xì)胞(PLC 8-2-1，PLC 15 3-4-2或PLC 19-4-3-1胎兒細(xì)胞）植于 (100,000