用于治療糖尿病的靶向dpp-4疫苗的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及用于預(yù)防或治療糖尿病的疫苗，其包含DPP-4(二肽基肽酶4)的特定部 分氨基酸序列作為免疫原，本發(fā)明還涉及用于糖尿病的預(yù)防或治療劑，其包含識別上述 DPP-4的部分氨基酸序列的DPP-4中和抗體。
【背景技術(shù)】
[0002] 糖尿病是一種由于體內(nèi)胰島素數(shù)量不足或作用不足而使血糖相比健康對象升高 的代謝疾病，其轉(zhuǎn)而引起腎、視網(wǎng)膜、神經(jīng)等中的微血管病變以及大血管病變?nèi)鐒用}硬化等 以顯著損害健康生活。迄今為止，降血糖劑如胰島素、胰島素促泌劑、胰島素增敏劑、糖苷 酶抑制劑等已廣泛應(yīng)用作臨床治療方法。雖然這些降血糖劑的有效性已得到認(rèn)同，但它們 各自具有許多問題。例如，胰島素當(dāng)以不適當(dāng)方法或劑量給藥時具有引起低血糖的風(fēng)險。在 顯示出顯著降低的胰腺胰島素分泌能力的糖尿病患者中，胰島素促泌劑和胰島素增敏劑的 有效性降低。在具有顯著胰島素抵抗的糖尿病患者中，胰島素和胰島素促泌劑的有效性降 低。
[0003] 已知糖尿病病原學(xué)中涉及多種因素。作為其中之一，GLP-1(胰高血糖素樣肽-1) (一種已知的作為胃腸道激素的腸降血糖素)參與葡萄糖代謝。GLP-1不但刺激胰島素分泌， 還刺激骨骼肌、脂肪組織和肝以改善胰島素敏感性，并可控制血糖水平。然而，其被DPP-4 (絲氨酸蛋白酶)快速降解(非專利文獻(xiàn)1)。因此，為治療糖尿病，已研究了靶向DPP-4的藥物 研發(fā)，且迄今已有一些DPP-4抑制劑上市。然而，由于給藥頻率和劑量傾向于增加，因此患者 存在經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)大的問題。
[0004] [文獻(xiàn)列表]
[0005] [非專利文獻(xiàn)]
[0006] 非專利文獻(xiàn)1:J Biol Chem 1996;271(38) :23222-23229

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明解決的問題
[0008] 本發(fā)明的目的是提供用于治療或預(yù)防糖尿病的疫苗，其包含DPP-4的特定部分氨 基酸序列，以及用于糖尿病的預(yù)防或治療劑，其包含識別上述DPP-4的部分氨基酸序列的 DPP-4中和抗體，其將用于預(yù)防或治療糖尿病的方法，其在劑量和給藥頻率方面優(yōu)于常規(guī) DPP-4抑制劑。
[0009] 解決問題的方法
[0010]本發(fā)明人從DPP-4的三維結(jié)構(gòu)信息推測多個氨基酸部分對于結(jié)合及裂解GLP-1而 言是重要的，并設(shè)計所述部分作為能夠誘導(dǎo)DPP-4中和活性的抗原候選物。上述合成的多種 抗原侯選物與KLH接合(連接）（conjugate)并連同弗氏佐劑(Freund's adjuvant)給藥至小 鼠。結(jié)果，指明了顯示出顯著抗體增加的兩種抗原侯選物。對給藥所述兩種抗原侯選物的小 鼠進(jìn)一步喂食高脂膳食。結(jié)果，采用一種抗原侯選物免疫的小鼠相比于對照顯示出高DPP-4 活性抑制率，以及胰島素分泌和葡萄糖耐量的改善。在給藥所述抗原侯選物3次的小鼠中誘 導(dǎo)的抗體滴度增加維持約3個月。此后通過再給藥所述抗原侯選物再次通過增強(qiáng)效應(yīng)而輕 易增加抗體滴度。
[0011]基于這些發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明人已進(jìn)行進(jìn)一步研究并完成了本發(fā)明。
[0012]即，本發(fā)明提供了
[0013] [1]用于預(yù)防或治療糖尿病的疫苗，其包含任意以下（1)-(3)中的任意物質(zhì)：
[0014] (1)多肽，其包含SEQ ID N0:2所示氨基酸序列或?qū)?yīng)于SEQ ID N0:2的非人哺乳 動物氨基酸序列；
[0015] (2)多肽，其包含在SEQ ID N0:2所示氨基酸序列或?qū)?yīng)于SEQ ID N0:2的非人哺 乳動物氨基酸序列中一個或數(shù)個氨基酸殘基被取代、缺失、插入或添加的氨基酸序列;和
[0016] (3)能夠表達(dá)上述(1)或(2)多肽的表達(dá)載體；
[0017] [ 2 ][ 1 ]所述疫苗，其包含載體蛋白質(zhì)；
[0018] [3][1]或[2]所述疫苗，其包含佐劑；
[0019] [4]用于糖尿病的預(yù)防或治療劑，其包含識別以下（1)或(2)多肽，并抑制DPP-4的 功能的抗體：
[0020] (1)多肽，其包含SEQ ID N0:2所示氨基酸序列或?qū)?yīng)于SEQ ID N0: 2的非人哺乳 動物氨基酸序列;和
[0021] (2)多肽，其包含在SEQ ID N0:2所示氨基酸序列或?qū)?yīng)于SEQ ID N0:2的非人哺 乳動物氨基酸序列中一個或數(shù)個氨基酸殘基被取代、缺失、插入或添加的氨基酸序列；
[0022] [5]用于預(yù)防或治療糖尿病的方法，其包括給藥有效量的以下（1)-(3)中的任意物 質(zhì)至對象：
[0023] (1)多肽，其包含SEQ ID N0:2所示氨基酸序列或?qū)?yīng)于SEQ ID N0: 2的非人哺乳 動物氨基酸序列；
[0024] (2)多肽，其包含在SEQ ID N0:2所示氨基酸序列或?qū)?yīng)于SEQ ID N0:2的非人哺 乳動物氨基酸序列中一個或數(shù)個氨基酸殘基被取代、缺失、插入或添加的氨基酸序列;和 [0025] (3)能夠表達(dá)上述(1)或(2)多肽的表達(dá)載體；
[0026] [ 6 ][ 5 ]所述方法，其包括給藥載體蛋白質(zhì)；
[0027] [ 7 ] [ 5 ]或[6 ]所述方法，其包括給藥佐劑；
[0028] [8]用于預(yù)防或治療糖尿病的方法，其包括給藥有效量的識別以下（1)或(2)多肽， 并抑制DPP-4的功能的抗體至對象：
[0029] (1)多肽，其包含SEQ ID N0:2所示氨基酸序列或?qū)?yīng)于SEQ ID N0: 2的非人哺乳 動物氨基酸序列;和
[0030] (2)多肽，其包含在SEQ ID N0:2所示氨基酸序列或?qū)?yīng)于SEQ ID N0:2的非人哺 乳動物氨基酸序列中一個或數(shù)個氨基酸殘基被取代、缺失、插入或添加的氨基酸序列；
[0031] [9]用于預(yù)防或治療糖尿病的方法中的以下（1)-(3)中的任意物質(zhì)：
[0032] (1)多肽，其包含SEQ ID N0:2所示氨基酸序列或?qū)?yīng)于SEQ ID N0: 2的非人哺乳 動物氨基酸序列；
[0033] (2)多肽，其包含在SEQ ID N0:2所示氨基酸序列或?qū)?yīng)于SEQ ID N0:2的非人哺 乳動物氨基酸序列中一個或數(shù)個氨基酸殘基被取代、缺失、插入或添加的氨基酸序列;和
[0034] (3)能夠表達(dá)上述(1)或(2)多肽的表達(dá)載體；
[0035] [ 10] [9]所述物質(zhì)，其包含載體蛋白質(zhì)；
[0036] [11][9]或[10]所述物質(zhì)，其包含佐劑；
[0037] [12]用于預(yù)防或治療糖尿病的方法的抗體，其識別以下（1)或(2)多肽并抑制DPP- 4的功能：
[0038] (1)多肽，其包含SEQ ID N0:2所示氨基酸序列或?qū)?yīng)于SEQ ID N0: 2的非人哺乳 動物氨基酸序列;和
[0039] (2)多肽，其包含在SEQ ID N0:2所示氨基酸序列或?qū)?yīng)于SEQ ID N0:2的非人哺 乳動物氨基酸序列中一個或數(shù)個氨基酸殘基被取代、缺失、插入或添加的氨基酸序列；
[0040] [13]由SEQ ID N0:2所示氨基酸序列組成的多肽。
[0041] 發(fā)明效果
[0042]使用本發(fā)明的DPP-4部分氨基酸序列作為疫苗，可誘導(dǎo)抑制DPP-4活性的中和抗 體、可通過所述抗體抑制GLP-1降解，并可改善胰島素分泌。此外，使用識別DPP-4部分氨基 酸序列的中和抗體可直接獲得上述效果。此外，因?yàn)樗鲋泻涂贵w的半衰期長于常規(guī)DPP-4 抑制劑的半衰期，所以可預(yù)期給藥至患者的所述疫苗和抗體的給藥頻率相比于常規(guī)DPP-4 抑制劑可減小。
[0043] 附圖簡述
[0044]圖1提供了顯示以下的圖表：
[0045] A:采用El、E2、E3或KLH疫苗免疫的小鼠中針對DPP-4的抗體滴度，*: P〈0.05，#: P〈 0.01，: P〈0.0013:來源于El或E3疫苗組血清的抗體與重組DPP-4蛋白的結(jié)合。
[0046]圖2提供了顯示以下的圖表：
[0047] A:采用E1或E3疫苗誘導(dǎo)的抗DPP-4抗體對采用E1或E3疫苗免疫的第56天小鼠的血 漿中的DPP-4的功能的抑制率，*:P〈0·05。B:采用El疫苗(20μg/小鼠）或E3疫苗(20μg/小鼠） 免疫的第56天小鼠的血清對DPP-4功能的體外抑制率，*: P〈0.05X:采用KLH、E1或E3疫苗免 疫的小鼠中給予葡萄糖后的血衆(zhòng)GLP-1水平，*: P〈0.05。
[0048]圖3提供了顯示以下的圖表：
[0049] A:采用E3疫苗誘導(dǎo)的抗DPP-4抗體對采用E3疫苗免疫的第28、42、56天小鼠的血漿 中的DPP-4的功能的抑制率，*:P〈0.05。B:采用E3疫苗（20μg/小鼠）免疫的第28、42、56天小 鼠的血清對DPP-4功能的體外抑制率，*: P〈0.05。
[0050]圖4提供了顯示以下的圖表：
[0051] A:在正常膳食條件下，采用E3或KLH疫苗免疫的小鼠在膳食負(fù)荷后的血糖水平。B: 在正常膳食條件下，采用E3或KLH疫苗免疫的小鼠在膳食負(fù)荷后的胰島素水平。C:在高脂膳 食條件下，采用E3或KLH疫苗免疫的小鼠中口服膳食耐量試驗(yàn)(MTT)的實(shí)施計劃。D:在高脂 膳食條件下，采用E3或KLH疫苗免疫的小鼠在膳食負(fù)荷后的血糖水平。E:在高脂膳食條件 下，采用E3或KLH疫苗免疫的小鼠在膳食負(fù)荷后0-120分鐘的總血糖水平，*:P〈0.05。
[0052]圖5提供了顯示以下的圖表：
[0053] A:在高脂膳食條件下，采用E3或KLH疫苗免疫的小鼠的胰島素水平，^ΡΜ.ΟδαΒ: 在高脂膳食條件下，采用Ε3或KLH疫苗免疫的小鼠的!101^-11?，*:?〈0.05。(：:在高脂膳食條件 下，采用E3或KLH疫苗免疫以及在腹腔內(nèi)胰島素給藥后的小鼠的血糖水平。胰島素給藥時的 血糖水平視為100%，*:P〈〇. 05』:在高脂膳食條件下，采用E3或KLH疫苗免疫以及在腹腔內(nèi) 胰島素給藥后的小鼠的GLP-1水平，*: P〈0.05。
[0054]圖6提供了顯示以下的圖表：
[0055] A:采用E3疫苗免疫的小鼠的抗體滴度的時程改變。B:在高脂膳食條件下，采用E3 或KLH疫苗免疫的小鼠的DPP-4水平，***: P〈0.001X:在高脂膳食條件下，采用E3或KLH疫苗 免疫的小鼠的體重。D:在高脂膳食條件下，采用E3或KLH疫苗免疫的小鼠的膳食消耗量。 [0056]圖7提供了顯示以下的圖表：
[0057] A:在高脂膳食條件下，在采用E3或KLH疫苗免疫的糖尿病模型小鼠中的口服膳食 耐量試驗(yàn)(MTT)的實(shí)施計劃。B:在高脂膳食條件下，采用E3或KLH疫苗免疫以及在膳食負(fù)荷 后的糖尿病模型小鼠的血糖水平，*: P〈〇. 05 X:在高脂膳食條件下，采用E3或KLH疫苗免疫 的糖尿病模型小鼠的膳食負(fù)荷后的0-120分鐘總血糖水平，*: P〈0.05。
[0058]圖8提供了顯示以下的圖表：
[0059] A:非免疫db/db小鼠、采用E3或KLH疫苗免疫的db/db小鼠的膳食負(fù)荷后血糖水 平，*: P〈0.05 A:非免疫db/db小鼠、采用E3或KLH疫苗免疫的db/db小鼠的膳食負(fù)荷后的0-120分鐘總血糖水平，*: P〈0.05 X:非免疫db/db小鼠、采用E3或KLH疫苗免疫的db/db小鼠的 膳食負(fù)荷后胰島素水平，*: P〈〇. 05。0:非免疫db/db小鼠、采用E3或KLH疫苗免疫的db/db小 鼠的膳食負(fù)荷后胰腺胰島素含量，*: P〈〇. 05A:來源于采用E3或KLH疫苗免疫以及在膳食負(fù) 荷后的db/db小鼠的胰腺的免疫組化染色切片的顯微圖像。
[0060]圖9提供了顯示以下的圖表：
[0061 ] A:非免疫db/db小鼠、采用E3或KLH疫苗免疫的db/db小鼠的GLP-1水平，*:P〈0.05。 B:采用E3或KLH疫苗免疫的db/db小鼠的DPP-