有的DNA。
[0124] 本發(fā)明多肽的獲得是通過(guò)研究DPP-4活性孔穴(active hole)周圍的氨基酸序列。 因此，本發(fā)明抗體識(shí)別DPP-4、抑制其功能(GLP-1降解）、并預(yù)期顯示出胰島素分泌促進(jìn)作 用。因此可預(yù)防和治療糖尿病。
[0125] 只要可提供上述效應(yīng)，本發(fā)明預(yù)防或治療劑中上述抗體的量沒有特別限制。其通 常為本發(fā)明預(yù)防或治療劑整體的0.001-90重量％，優(yōu)選0.005-50重量％，更優(yōu)選0.01-10重 量％。
[0126] 除了作為活性成分的上述抗體以外，本發(fā)明預(yù)防或治療劑還可包含藥學(xué)上可接受 的載體。作為此載體，可使用藥物領(lǐng)域通常使用的載體。其實(shí)例包括但不限于，賦性劑如蔗 糖、淀粉、甘露醇、山梨醇、乳糖、葡萄糖、磷酸鈣、碳酸鈣等，防腐劑如苯甲酸鈉、亞硫酸氫 鈉、尼泊金甲酯、尼泊金丙酯等，穩(wěn)定劑如檸檬酸、檸檬酸鈉、醋酸等，助懸劑如甲基纖維素、 聚乙烯吡咯烷酮、硬脂酸鋁等，分散劑如表面活性劑等，稀釋劑如水、鹽水等，底蠟如甘油、 聚乙二醇等。
[0127] 本發(fā)明預(yù)防或治療劑的給藥劑型的實(shí)例包括但不限于液體、注射制劑等。本發(fā)明 預(yù)防或治療劑的劑型可為控釋制劑如立即釋放制劑、持續(xù)釋放制劑等。因?yàn)榭贵w通常在水 性溶劑中可溶，所以其在任意上述劑型中易于被吸收。還可通過(guò)本身已知的方法進(jìn)一步增 加抗體的溶解性。
[0128] 可根據(jù)本身已知為制劑生產(chǎn)方法的手段使用上述抗體作為活性成分生產(chǎn)可用于 預(yù)防、治療或緩解糖尿病的本發(fā)明預(yù)防或治療劑。
[0129] 例如，優(yōu)選用于系統(tǒng)給藥的本發(fā)明預(yù)防或治療劑的生產(chǎn)可通過(guò)將有效量的本發(fā)明 抗體溶于水性或非水性等滲無(wú)菌注射劑(例如，注射制劑）中。其生產(chǎn)可通過(guò)冷凍干燥本發(fā) 明抗體(例如，凍干制劑)并將其同樣溶于水性或非水性等滲無(wú)菌稀釋溶液中。優(yōu)選用于局 部給藥的本發(fā)明預(yù)防或治療劑的生產(chǎn)可通過(guò)將本發(fā)明抗體溶于稀釋溶液如水和鹽水（例 如，液體）中。還可通過(guò)使用噴霧器將所述液體用于吸入治療入支氣管、肺等。這些試劑可包 含抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑、等滲劑等。本發(fā)明的這些預(yù)防或治療劑可密封在單位劑量或 多劑量容器如安飯或小瓶中。
[0130] 雖然本發(fā)明預(yù)防或治療劑的劑量可根據(jù)作為活性成分包含的抗體的活性、種類或 用量、給藥對(duì)象、給藥途徑、給藥對(duì)象年齡和體重等而適當(dāng)確定，但以抗體量計(jì)的成人(體重 60kg)每日劑量(有效量）例如為0 · lmg-1 OOOmg，優(yōu)選0 · lmg-500mg，更優(yōu)選0 · lmg-300mg。本 發(fā)明預(yù)防或治療劑可按照需要以每天一份或若干份的形式給藥，且還可在若干天內(nèi)給藥。 [0131]本發(fā)明預(yù)防或治療劑可與已知的糖尿病預(yù)防或治療劑組合使用。此類已知的糖尿 病預(yù)防或治療劑的實(shí)例包括DPP-4抑制劑如西格列汀、維格列汀、阿格列汀、利格列汀、特力 利汀、阿拉格列汀等，抗糖尿病藥物如胰島素、甲苯磺丁脲、格列吡脲、格列本脲、二甲雙胍、 依帕司他、伏格列波糖、阿卡波糖、曲格列酮等，等等。僅有一種可用于組合，或其多種可用 于組合。在本說(shuō)明書中，"組合使用"是指本發(fā)明預(yù)防或治療劑和已知的糖尿病預(yù)防或治療 劑組合使用，且其使用形式?jīng)]有特別限制。例如，其包括給藥包含本發(fā)明預(yù)防或治療劑和已 知的糖尿病預(yù)防或治療劑的藥物組合物，或未經(jīng)混合單獨(dú)配制、同時(shí)或以交錯(cuò)方式給藥兩 者。
[0132] 實(shí)施例
[0133] 以下通過(guò)參考實(shí)施例更詳細(xì)地解釋本發(fā)明。無(wú)需多言，本發(fā)明不受其限制。
[0134] 疫苗設(shè)計(jì)和合成
[0135] 為產(chǎn)生中和抗體，設(shè)計(jì)了DPP-4的N末端序列中的一部分(E1;SEQ ID N0:5)以及在 DPP-4活性孔穴周圍的兩個(gè)序列(E2;SEQ ID N0:6、E3;SEQ ID N0:4)。將可存在增加免疫原 性所需的各種T細(xì)胞表位并有助于破壞針對(duì)作為疫苗的肽序列的耐受性的鑰孔戚血藍(lán)素 (KLH)(Wako Pure Chemical Industries)接合至3個(gè)候選肽的Ν末端。獲得高質(zhì)量合成肽(> 98%純度），并通過(guò)反相HPLC(Peptide Institute有限公司）進(jìn)行純化。
[0136] 動(dòng)物研究和免疫
[0137] 購(gòu)買八周齡雄性C57/BL6J小鼠和六周齡雄性db/db小鼠 （Oriental Yeast公司）并 將其喂養(yǎng)在自由攝食水和食物的溫度和光照循環(huán)控制裝置中。在高脂膳食小鼠模型中，8周 齡〇57/81^61小鼠喂食高脂膳食(冊(cè)060 :18.2%蛋白、62.2%脂肪和19.6%碳水化合物， Oriental Yeast公司）。免疫前將肽溶液與等體積弗氏佐劑(CFA/IFA，Wako Pure Chemical Industries)混合。小鼠組(n = 6)在第0、14、28、84和119天皮下注射2yg或20yg的候選多肽。 小鼠對(duì)照組皮下注射與等體積弗氏佐劑混合的等質(zhì)量的KLH。從尾靜脈采集血清，每次增強(qiáng) 后通過(guò)ELISA測(cè)定針對(duì)免疫肽的抗體滴度。
[0138] ELISA
[0139]用5mg/ml的各候選肽涂覆ELISA板，4°C過(guò)夜，所述候選肽已接合至載體蛋白質(zhì)即 牛血清白蛋白（BSA Peptide Institute有限公司）。使用包含3%脫脂牛奶的roS封閉所有 孔。采用封閉緩沖液經(jīng)100至325000倍范圍稀釋血清。培養(yǎng)所述板和血清(4°C過(guò)夜）后并在 洗滌后，在室溫下采用小鼠 IgG特異性辣根過(guò)氧化物酶(HRP)接合抗體(GE Hea 1 thcare)培 養(yǎng)板3小時(shí)。在IgG亞類測(cè)定試驗(yàn)中，使用抗小鼠 Ig亞類-特異性HRP接合抗體(IgGl、IgG2b和 IgG2c)。洗滌后，將過(guò)氧化物酶顯色底物3，3 ' -5，5 ' -四甲基聯(lián)苯胺(TMB; Sigma)加入ELISA 板孔中以發(fā)展反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀(Bio-Rad有限公司）在450nm分析所有板。通過(guò)各樣本稀釋 范圍內(nèi)的最高0D450值測(cè)定半數(shù)最大抗體滴度。
[0140] DPP-4 試驗(yàn)
[0141] 在第28天、42天和56天膳食負(fù)荷的15min后評(píng)估血漿中的DPP-4活性。為評(píng)估DPP-4 活性，將5μ1血清與DPP-4-GloTM試劑溶液(DPP_4Glo蛋白酶測(cè)定;Promega，Madison，WI)和 測(cè)定緩沖液（l〇〇mM HEPES，pH 7.6，0. lmg/ml牛血清白蛋白）混合，總?cè)莘e為60μ1。為評(píng)估抗 DPP-4抗體的中和活性，采用重組DPP-4 (R&D Systems有限公司）在4 °C培養(yǎng)1μ 1血清1小時(shí)， 然后加入如上所述的DPP-4-GloTM試劑溶液。使用SpectraFluor每1分鐘記錄所釋發(fā)光30分 鐘。數(shù)據(jù)表示為如下計(jì)算的％抑制：
[0142] %抑制= 100(l-(Vi/Vc))，其中Vi是免疫樣本的反應(yīng)速率且Vc是對(duì)照樣本的反應(yīng) 速率。在血漿DPP-4抗原測(cè)量中，根據(jù)小鼠 DPP-4ELISA試劑盒所附方法在ELISA板（R&D Systems有限公司）中培養(yǎng)血清，并在酶標(biāo)儀(Bio-Rad有限公司）上讀數(shù)。
[0143] 蛋白印跡(Western blot)試驗(yàn)
[0144] 通過(guò)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)重組DPP-4和BSA-DPP-4接合物進(jìn)行 電泳分離并印跡到聚偏二氟乙烯(PVDF)薄膜上。用血清和商業(yè)抗DPP-4抗體(CD26(T-19): sc-7044，Santa Cruz Biotechnology有限公司）分別培養(yǎng)轉(zhuǎn)印的膜。小鼠 IgG特異性HRP接 合抗體培養(yǎng)后，將轉(zhuǎn)印的膜可視化并定量電化學(xué)發(fā)光信號(hào)。
[0145] 膳食耐量試驗(yàn)和血漿參數(shù)
[0146] 將小鼠禁食過(guò)夜，以2g CH0/kg劑量口服給予膳食（14%蛋白質(zhì)、脂肪31.5%、CH0 54.5 % Ensure Η，Me i j i，東京，日本）溶液。在各指定時(shí)間點(diǎn)測(cè)量血漿胰島素濃度（小鼠 ELI SA胰島素試劑盒，Morinaga，日本）、血漿活性GLP-1 (EMD Mi 11 ipore有限公司，USA)和血 糖水平。血糖通過(guò)血糖儀測(cè)自膳食負(fù)荷后0、30、60、90和120分鐘所采尾血。使用丨=0至七= 120分鐘的血糖波動(dòng)概貌以積分曲線下面積(AUC0-2h)。各處理的百分?jǐn)?shù)抑制值生成自歸一 化至膳食負(fù)荷禁食小鼠的AUC數(shù)據(jù)。
[0147] 胰腺胰島素含量和組織分析
[0148] 立即分離整個(gè)胰腺以便將不附上脂肪和其它胰腺組織。在胰島素含量測(cè)定中，測(cè) 定濕重以后，將經(jīng)分離胰腺凍結(jié)在液氮中并在-80°C貯存直至使用。解凍胰腺并用包含蛋白 酶抑制劑混合物的PBS均化。離心（1000g，10分鐘，4°C)勻漿并準(zhǔn)備上清液用于胰島素測(cè)定 (小鼠 ELISA胰島素試劑盒，Morinaga)。在免疫組織化學(xué)分析中，將經(jīng)分離胰腺固定在4%多 聚甲醛中24小時(shí)并埋入石蠟中，切成4μπι切片。使切片與一級(jí)抗體（豚鼠抗胰島素抗體， Dako)和二級(jí)抗體(生物素化抗豚鼠 IgG抗體)反應(yīng)。最后用蘇木精對(duì)載片進(jìn)行復(fù)染并將其置 于顯微觀察。在組織學(xué)檢查試驗(yàn)中，切開空腸、肝和腎，在4%多聚甲醛中固定過(guò)夜并埋入石 錯(cuò)中。用Masson三色染色法對(duì)肝和腎的4μηι切片進(jìn)行染色。
[0149] Τ細(xì)胞增殖試驗(yàn)
[0150] 在實(shí)驗(yàn)期最后處死免疫小鼠，將脾細(xì)胞（106細(xì)胞/孔)培養(yǎng)在RPMI 1640培養(yǎng)基中 并用lOμg/ml的候選肽、KLH和植物凝集素(PHA)(Wako Pure Chemical Industries)進(jìn)行刺 激。37°C培養(yǎng)48小時(shí)后，將lyCi[3H]胸苷(Perkin Elmer)加至各板并另外培養(yǎng)所述板8小 時(shí)。使用MicroBeta 1450TriLux閃爍計(jì)數(shù)器(Wallac 0y)測(cè)定[3H]胸苷攝取。
[0151] ELISP0T 試驗(yàn)
[0152] 分別用抗小鼠 IFN-α抗體和抗小鼠 IL-4捕捉抗體涂覆96孔ELI SPOT板，4 °C過(guò)夜。培 養(yǎng)后，用包含〇.〇5%TWeen 20的PBS(PBS-T)溶液洗滌板并用包含1%BSA和5%蔗糖的roS封 閉。然后，將來(lái)自免疫小鼠的脾細(xì)胞懸浮液接種在孔中（1〇 6細(xì)胞/孔），并用l〇μg/ml候選肽、 KLH和PHA在37°C再刺激48小時(shí)。培養(yǎng)后，用PBS-Τ洗滌板。然后用生物素化抗小鼠 IFN-a抗體 或生物素化抗小鼠 IL-4抗體在4°C培養(yǎng)各孔過(guò)夜并用PBS-Τ洗滌。將鏈霉親和素-AP加入各 孔中并在室溫下培養(yǎng)2小時(shí)。用roS-T洗滌后，用BCIP/NBT溶液在室溫下培養(yǎng)板30分鐘。最 后，用水沖洗板，在室溫下風(fēng)干，并使用解剖顯微鏡(Olympus)對(duì)色斑進(jìn)行計(jì)數(shù)。
[0153] 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
[0154] 所有數(shù)據(jù)表示為均值土SEM。使用Prism GraphPad 5.01版(GraphPad軟件有限公 司）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。當(dāng)P〈〇. 05時(shí)認(rèn)為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異是顯著的。
[0155] 實(shí)施例1用于DPP-4疫苗的適當(dāng)抗原序列的選擇和篩選
[0156] 基于三維結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)了3個(gè)肽:DPP-4的N末端序列中的一部分(E1;SEQ ID N0:5)， 以及兩個(gè)其它序列(E2;SEQIDN0:6，E3;SEQIDN0 :4)。因?yàn)榻?jīng)誘導(dǎo)抗體可與DPP-4的活性 孔穴重疊，所以預(yù)期其用作DPP-4中和抗體。三個(gè)候選肽(El，E2，E3)接合至KLH，并以低劑量 (2yg肽/小鼠）和高劑量(20yg肽/小鼠）以2周間隔注射至雄性C57BL/6J小鼠（8周齡，η = 6/ 組）3次（圖1Α)。針對(duì)DPP-4的抗體滴度（以半數(shù)最大數(shù)顯示)在首次免疫后14天未增加。然 而，在采用E1或E3疫苗免疫的小鼠（以下有時(shí)分別描述為E1疫苗組、E3疫苗組）中，抗體滴度 在第28天時(shí)以劑量依賴性方式顯著升高，在第42天和56天進(jìn)一步增加，并在第70天時(shí)逐漸 降低。在僅采用KLH或E2疫苗免疫的小鼠（以下有時(shí)分別描述為KLH疫苗組、E2疫苗組）中，抗 體未增加。這些結(jié)果表明在E1和E3疫苗組中抗DPP-4抗體的平均半衰期為約42天，其高于全 部現(xiàn)有DPP-4抑制化合物的半衰期。自免疫起始后第56天，高劑量疫苗小鼠（20yg