飲片A組、對比黃芪粉碎飲片B組，另 取同批正常10只大鼠作為正常對照，各組每天灌胃給藥一次，灌胃容積5mL/kg，丹那唑組每 日100mg/kg丹那唑灌胃；本發(fā)明黃芪超微飲片組、對比黃芪超微飲片A組、對比黃芪粉碎飲 片B組，每日均為5g/kg灌胃。正常組和模型組給予等容量的生理鹽水，均于造模術(shù)后35d開 始給藥，每日1次，連續(xù)30 d。
[0030] 2.3指標(biāo)測定 于末次給藥后1 h，各組動物用戊巴比妥鈉麻醉，頸動脈取血，離心（2000 r/min)30 min，分離血清，待檢。繼之處死動物，剖取正常組子宮內(nèi)膜及各造膜組的異位內(nèi)膜組織，制 作組織石蠟標(biāo)準(zhǔn)切片（厚3 μπι)。切片分5組，用于檢測ER、PR、VEGF、NK細(xì)胞活性及HE 染色，剖腹測量大鼠異位內(nèi)膜體積，計算抑制率。
[0031] (1)放射免疫法測定血清E2、p:按試劑藥盒測定步驟進(jìn)行操作。
[0032] (2)免疫組化法測定ER、PR、VEGF、NK細(xì)胞:按照SABC免疫組化染色試劑盒操作 常規(guī)進(jìn)行。顯微鏡檢。圖像分析:每張經(jīng)免疫組織化學(xué)染色后的標(biāo)本，采用美國CMS800彩 色圖像分析系統(tǒng)，在腺上皮細(xì)胞表面隨意取3個視野的光密度(光密度/面積)的平均值表示 該切片腺上皮細(xì)胞中ER、PR、VEGF、NK細(xì)胞的含量。
[0033] 3結(jié)果 3.1對子宮內(nèi)膜異位癥大鼠血清E2、P的影響(見表1 -1) 表1-1對子宮內(nèi)膜異位癥大鼠 E2、P的影響(I土s，n =10)
注：與模型對照組比較，#P〈〇 · 05，##P〈0 · 01，###P〈0 · 001; 與正常對照組比較，*P〈〇 · 05，#P〈0 · 01，*#P〈0 · 001 實驗結(jié)果表明，本發(fā)明黃芪超微飲片組的作用效果與陽性藥物丹那唑組相當(dāng)，明顯優(yōu) 于對比黃芪超微飲片A組和對比黃芪粉碎飲片B組。
[0034] 3.2對實驗性異位子宮內(nèi)膜組織ER、PR含量的影響(見表1-2) 表1-2對實驗性異位子宮內(nèi)膜組織ER、PR含量的影響(g土s，n =10)
注：與模型對照組比較，#p〈〇 · 05，##P〈0 · 01，###P〈0 · 001; 與正常對照組比較，*P〈〇 · 05，#P〈0 · 01，*#P〈0 · 001 實驗結(jié)果表明，本發(fā)明黃芪超微飲片組的作用效果與陽性藥物丹那唑組相當(dāng)，明顯優(yōu) 于對比黃芪超微飲片A組和對比黃芪粉碎飲片B組。
[0035] 3.3本發(fā)明黃芪超微飲片對實驗性異位子宮內(nèi)膜組織VEGF、NK細(xì)胞活性的影響（見 表 1-3) 表1-3對實驗性異位子宮內(nèi)膜組織VEGF、NK細(xì)胞的影響(i:土s，n =10)
注：與模型對照組比較，#P〈〇 · 05，##P〈0 · 01，###P〈0 · 001; 與正常對照組比較，*P〈〇 · 05，#P〈0 · 01，*#P〈0 · 001 實驗結(jié)果表明，本發(fā)明黃芪超微飲片組的作用效果與陽性藥物丹那唑組相當(dāng)，明顯優(yōu) 于對比黃芪超微飲片A組和對比黃芪粉碎飲片B組。
[0036] 3.4光學(xué)顯微鏡下各組子宮內(nèi)膜形態(tài)觀察 (1)正常組:正常組大鼠子宮內(nèi)膜為單層柱狀上皮，可見腺體、血管、間質(zhì)等正常結(jié)構(gòu)。 [0037] (2)模型對照組:橫紋肌旁有子宮內(nèi)膜組織，腺體擴(kuò)張，腺上皮為單層柱狀、矮立方 狀或扁平狀;間質(zhì)血管豐富，擴(kuò)張充血，可見少量含鐵血黃素及中性粒細(xì)胞浸潤。
[0038] (3)丹那唑組：與模型組比較，腺腔縮?。婚g質(zhì)及腺腔內(nèi)有數(shù)量不等的粒細(xì)胞浸潤 及含鐵血黃素。
[0039] (4)本發(fā)明黃芪超微飲片組:部分腺腔縮小，部分腺上皮脫落，部分腺腔內(nèi)可見較 多中性粒細(xì)胞及泡沫細(xì)胞，間質(zhì)相對減小，其中血管數(shù)量及管徑相對減小，可見較多含鐵血 黃素。
[0040] (5)對比黃芪超微飲片A組:部分腺腔相對縮小，部分腺腔內(nèi)見中性粒細(xì)胞，間質(zhì)血 管擴(kuò)張充血，其中可見含鐵血黃素及少量淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞。
[0041] (6)對比黃芪粉碎飲片B組:部分腺上皮脫落，腺腔內(nèi)可見中性粒細(xì)胞及組織細(xì)胞， 間質(zhì)血管數(shù)量及管徑相對減小，間質(zhì)中炎細(xì)胞減少，可見含鐵血黃素。
[0042] 實驗結(jié)果表明，本發(fā)明黃芪超微飲片組的作用效果與陽性藥物丹那唑組相當(dāng)，明 顯優(yōu)于對比黃芪超微飲片A組和對比黃芪粉碎飲片B組。
[0043 ] 3.5本發(fā)明黃芪超微飲片對大鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型的影響(見表1 -4) 表1-4對大鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型的影響($土s，n =10)
注:與用藥前比較，*P〈〇 · 05，#Ρ〈0 · 01;與模型組比較，#P〈0 · 05，##Ρ〈0 · 01。
[0044] 實驗結(jié)果表明，本發(fā)明黃芪超微飲片組的作用效果與陽性藥物丹那唑組相當(dāng)，明 顯優(yōu)于對比黃芪超微飲片A組和對比黃芪粉碎飲片B組。
[0045] 4 討論 子宮內(nèi)膜異位癥是一種性激素依賴性疾病，手術(shù)及術(shù)后應(yīng)用GnRH、內(nèi)美通等女性性腺 軸抑制劑以期造成體內(nèi)低雌、孕激素環(huán)境，使殘留異位灶萎縮消失是目前主要治療方法。中 醫(yī)藥對其研究尚處于起步階段。
[0046] 4.1調(diào)節(jié)內(nèi)分泌 4.1.1降低雌、孕激素水平 越來越多的實驗證明子宮內(nèi)膜異位癥是雌激素依賴性疾病。近年來，還發(fā)現(xiàn)孕激素在 子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生發(fā)展中同樣具有不可忽視的作用:P可促進(jìn)異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞的增 生及分化。雌、孕激素均可以促進(jìn)VEGF mRNA的表達(dá)，異位內(nèi)膜VEGF的高表達(dá)有助于內(nèi)膜利 用VEGF介導(dǎo)的血管形成獲取必需的營養(yǎng)物質(zhì)而生存。本實驗中，模型對照組血清雌、孕激 素含量明顯高于正常組，丹那唑和本發(fā)明黃芪超微飲片組都能有效降低子宮內(nèi)膜異位癥大 鼠血清E 2、P水平，說明本發(fā)明黃芪超微飲片可以通過抑制大鼠雌、孕激素的異常分泌達(dá)到 治療子宮內(nèi)膜異位癥的目的，作用結(jié)果與丹那唑相似。
[0047] 4.1.2降低雌、孕激素受體含量 異位內(nèi)膜生長和維持所必需的性激素需要通過性激素受體發(fā)揮作用。異位內(nèi)膜組織中 有ER、PR表達(dá)，其含量隨月經(jīng)周期而變化。本實驗中，子宮內(nèi)膜異位癥大鼠動情期ER、PR的 表達(dá)略低于同期正常子宮內(nèi)膜。本發(fā)明黃芪超微飲片可以通過降低異位內(nèi)膜中ER、PR的表 達(dá)，從而阻斷異位內(nèi)膜對E 2、P的反應(yīng)，抑制異位內(nèi)膜生長。
[0048] 4.2改善免疫功能 4.2.1提高NK細(xì)胞活性 NK細(xì)胞是一類在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生過程中發(fā)揮著重要免疫監(jiān)視作用的免疫細(xì)胞。NK 細(xì)胞對異位子宮內(nèi)膜細(xì)胞特異識別和殺傷作用的缺陷是子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病機(jī)制中的關(guān) 鍵環(huán)節(jié)之一。在實驗中，本發(fā)明黃芪超微飲片對NK細(xì)胞的活性具有顯著升提作用，效果與 丹那唑相似。NK細(xì)胞免疫活性的提高有助于對異位內(nèi)膜的識別和清除，這也是本發(fā)明黃芪 超微飲片治療子宮內(nèi)膜異位癥的機(jī)理之一。
[0049] 4.2.2抑制異位病灶的血管生成 新的血管網(wǎng)絡(luò)的建立是逆流的子宮內(nèi)膜種植成活及發(fā)展為子宮內(nèi)膜異位癥的關(guān)鍵。 VEGF是目前發(fā)現(xiàn)的最為關(guān)鍵的血管形成刺激因子，可直接而特異的刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞，誘 導(dǎo)其增殖、迀移，并增加血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性，誘導(dǎo)新生血管形成。研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜異位 癥患者異位內(nèi)膜VEGF mRNA呈高表達(dá)，而雌、孕激素可以促進(jìn)VEGF的表達(dá)。為此，在動物實 驗中對VEGF進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示：實驗大鼠異位內(nèi)膜組織中VEGF表達(dá)增強(qiáng);光鏡下觀察 子宮內(nèi)膜形態(tài):模型對照組間質(zhì)中血管豐富，擴(kuò)張充血，證實異位內(nèi)膜的成活需要血管網(wǎng)絡(luò) 的支持。而本發(fā)明黃芪超微飲片組及丹那唑組均能降低VEGF的表達(dá)，光鏡下各治療組血管 數(shù)量減少不明顯，但管徑縮小，提示異位內(nèi)膜血管的擴(kuò)張充血得到抑制，與經(jīng)GnRH-a治療后 血管表面積減少的結(jié)果相一致。考慮可能是藥物通過抑制雌、孕激素的分泌，降低了 VEGF的 生成，從而使異位內(nèi)膜血管的形成受到了抑制。
[0050]實驗二:HPLC法測定本發(fā)明超微飲片中羽扇烯酮的含量 1儀器與試藥 LC-10A型高效液相色譜儀;Sro-ΙΟΑ紫外檢測器;Anastar色譜工作站。乙腈為色譜純， 水為蒸餾水，其他試劑均為分析純。羽扇烯酮對照品（天津丹溪國藥研究所，含量>98%)。本 發(fā)明超微飲片按照本發(fā)明說明書【具體實施方式】中的實施例1制備。
[0051 ] 2方法與結(jié)果 2.1檢測波長的確定 取適量羽扇烯酮對照品，加入甲醇制成一定質(zhì)量濃度的對照品溶液，以甲醇為空白，用 紫外一可見分光光度計于200~400nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行波長掃描。掃描結(jié)果表明，羽扇烯酮 在21 Onm附近有最大吸收，故選定21 Onm為檢測波長。
[0052] 2.2色譜條件 色譜柱：迪馬公司Diamonsi 1 Ci8(規(guī)格：250mm X 4 · 6mm，5μηι);流動相：乙腈-0 · 5%磷酸 溶液(83:17);流速：1. OmL/min;檢測波長:210nm;柱溫:35 °C ;進(jìn)樣量:20yL。理論板數(shù)按羽 扇稀酮計算應(yīng)不低于5000。
[0053] 2.3溶液制備 2.3.1對照品溶液的制備 取羽扇烯酮對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每lmL含0.0773mg的溶液，作為對照品 儲備液。再精密吸取對照品儲備液2mL至25mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。
[0054] 2.3.2供試品溶液的制備 取本發(fā)明超微飲片，研細(xì)，取適量，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25mL，密 塞，稱定重量，超聲處理30min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù) 濾液，即得。精密量取對照品溶液、供試品溶液各20yL，按"2. Γ項下色譜條件進(jìn)樣測定，記 錄色譜圖，見圖1。
[0055] 2.4線性關(guān)系考查 取0.0773mg/mL羽扇烯酮對照品儲備液，精密吸取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0和 10.0 mL置25mL量瓶中，以甲醇稀釋至刻度，搖勻。按上述色譜條件分別進(jìn)樣，測定峰面積值。 以濃度（yg/mL)為橫坐標(biāo)，相應(yīng)峰面積值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y = 570352.3Χ - 47.58，（r=0.9998)。結(jié)果表明羽扇烯酮在1.546~30.92yg/mL范圍內(nèi)呈良好的