基于表達(dá)HBsAg和HBcAg的熱失活全重組漢遜酵母細(xì)胞的乙肝治療疫苗的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[00011本發(fā)明屬基因工程領(lǐng)域，涉及疫苗為熱失活全重組漢遜酵母細(xì)胞表達(dá)HBsAg和 HBcAg治療乙肝疫苗。
【背景技術(shù)】
[0002] 乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。據(jù)世 界衛(wèi)生組織(World Health 0ganization，WH0)報(bào)道，全球60億人口中，約20億人曾感染過(guò) HBV，其中3.5億人為慢性HBV感染，每年約有100萬(wàn)人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和 原發(fā)性肝細(xì)胞癌(肝癌）。全球肝癌患者中，75 %以上是由HBV所致。我國(guó)屬HBV感染地方性流 行區(qū)。我國(guó)衛(wèi)生部于1992年將乙型肝炎疫苗納入計(jì)劃免疫管理。2001年12月國(guó)務(wù)院正式批 準(zhǔn)將乙型肝炎疫苗納入兒童計(jì)劃免疫，要求各省市自治區(qū)從2002年起，除收取少量手續(xù)費(fèi) 外，給所有新生兒免費(fèi)接種乙型肝炎疫苗。按照2005年3月制訂的計(jì)劃免疫條例，自2005年6 月1日起，所有新生兒乙型肝炎疫苗免疫完全免費(fèi)。經(jīng)過(guò)近15年的努力，我國(guó)一般人群，尤其 是15歲以下兒童，乙型肝炎病毒感染率明顯下降。據(jù)2006年全國(guó)乙型肝炎血清流行病學(xué)調(diào) 查表明，全人群乙型肝炎表面抗原(HBsAg)攜帶率己由1992年9.75%降至7.18%，5歲以下 兒童的乙型肝炎表面抗原攜帶率已由原來(lái)9.67%降至0.96%。據(jù)此推算，我國(guó)現(xiàn)有的慢性 HBV感染者約9300萬(wàn)人，其中慢性乙型肝炎患者約2000萬(wàn)例。每年因 HBV導(dǎo)致的肝硬化和肝 癌死亡30余萬(wàn)例，新發(fā)乙型肝炎病例50萬(wàn)-100萬(wàn)例。因此，本病是我國(guó)當(dāng)前和今后相當(dāng)長(zhǎng)時(shí) 期內(nèi)危害人民健康、阻礙社會(huì)發(fā)展、影響社會(huì)穩(wěn)定的重要因素，是一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn) 題，也是我國(guó)在建立以人為本的和諧社會(huì)過(guò)程中，需要優(yōu)先解決的一個(gè)重大健康問(wèn)題。我國(guó) 人群HBV感染的流行率高，給國(guó)家?guī)?lái)了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。據(jù)調(diào)查.我國(guó)每年因慢性乙肝(包 括肝硬化、肝癌）的直接和間接醫(yī)療費(fèi)用約6800億元。乙肝疫苗免疫預(yù)防與治療是降低疾病 負(fù)擔(dān)最有效的方法。
[0003] 基因重組技術(shù)是現(xiàn)代生物技術(shù)的核心技術(shù)；也是規(guī)?；a(chǎn)乙肝疫苗主要組 份--病毒樣顆粒乙肝表面抗原(HBsAg VLP)的唯一技術(shù)。本專(zhuān)利權(quán)人從1995年開(kāi)始從事 漢遜酵母重組乙肝疫苗研發(fā)工作。1998-2002年在大連高新生物制藥有限公司，主持開(kāi)發(fā)的 漢遜酵母重組HBsAg adw2乙肝疫苗，HBsAg VLP抗原純品（原液)產(chǎn)率為40mg/升；于2002年 起經(jīng)國(guó)家審批上市。2003-2006年本人為北京天壇生物制品股份有限公司協(xié)議開(kāi)發(fā)的重組 漢遜酵母HBsAg-adr2乙型肝炎疫苗。其HBsAg VLP抗原純品（原液)產(chǎn)率為85mg/升以上；已 于2015年申報(bào)國(guó)家新藥審評(píng)，以該疫苗為基礎(chǔ)申請(qǐng)的中國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)號(hào)為CN104232661A。
[0004] 根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)查明的乙型肝炎發(fā)病機(jī)制如下:人感染HBV后，一般可分為免疫耐受 期、免疫清除期和非活動(dòng)或低(非)復(fù)制期。免疫耐受期的特點(diǎn)是HBV復(fù)制活躍，血清HBsAg和 HBeAg陽(yáng)性，HBV DNA滴度較高（>105拷貝/ml)，血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)水平正常，肝 組織學(xué)無(wú)明顯異常。免疫清除期表現(xiàn)為血清HBV DNA滴度>105拷貝/ml，但一般低于免疫耐 受期，天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)持續(xù)或間歇升高，肝組織學(xué)有壞死炎癥等表現(xiàn)。非活動(dòng) 或低（非）復(fù)制期表現(xiàn)為HBeAg陰性，抗-HBe陽(yáng)性，HBV DNA檢測(cè)不到(PCR)法或低于檢測(cè)下 限，水平正常，肝組織學(xué)無(wú)明顯炎癥。但在青少年和成人期感染HBV，一般無(wú)免疫耐受期，一 開(kāi)始即為免疫清除期，表現(xiàn)為急性乙型肝炎，其中僅5%_10%發(fā)展成慢性。但其確切的發(fā)病 機(jī)制仍不了解。
[0005] 抗乙型肝炎病毒治療是目前對(duì)乙肝病毒感染者及乙肝患者的主要治療手段。目前 抗乙型肝炎病毒藥物主要有以干擾素類(lèi)為主的免疫調(diào)節(jié)劑和針對(duì)HBV DNA多聚酶的核苷酸 類(lèi)似物兩大類(lèi)，雖有一定療效，但尚不滿(mǎn)意，多數(shù)患者不能被治愈。干擾素雖可使少數(shù)患者 HBsAg消失或血清學(xué)轉(zhuǎn)化，但費(fèi)用較高，需要注射，且有一定副作用;核苷酸類(lèi)似物則作用于 HBV DNA聚合酶，只能抑制病毒復(fù)制，不能徹底清除HBV和cccDNA，且長(zhǎng)期應(yīng)用易導(dǎo)致病毒耐 藥變異。
[0006] 因此，為了徹底清除HBV和cccDNA，亟待開(kāi)發(fā)新的更有效的HBV治療乙肝疫苗。人體 肝臟為一免疫耐受器官;肝臟移植免疫排斥反應(yīng)低充分表明這一點(diǎn)。乙型肝炎病毒(HBV)感 染人的部位為肝臟；因此對(duì)HBV的免疫耐受為其主要特征。逆轉(zhuǎn)HBV免疫耐受是開(kāi)發(fā)慢性乙 型肝炎患者(CHB)免疫治療疫苗的立足點(diǎn)。HBV免疫耐受不僅體現(xiàn)在肝臟局部anti-HBV免疫 應(yīng)答不能有效清除病毒，導(dǎo)致持續(xù)感染;也體現(xiàn)在HBV持續(xù)存在，進(jìn)而誘導(dǎo)全身性免疫系統(tǒng) 對(duì)HBV無(wú)應(yīng)答，如HBV耐受期病人對(duì)HBsAg疫苗無(wú)應(yīng)答。這也是當(dāng)前治療性疫苗在CHB病人中 難以成功的主要原因。肝臟誘導(dǎo)的免疫耐受及其逆轉(zhuǎn)機(jī)制研究將為研制治療乙肝疫苗提供 了理論依據(jù)。
[0007] 2005年Bowen提出：肝內(nèi)的免疫環(huán)境與誘導(dǎo)耐受性相關(guān)，但仍保持了維持對(duì)病原體 有效反應(yīng)的能力。這種二分法的機(jī)制尚不清楚。最近的數(shù)據(jù)表明，初始CD8+T(CTL)細(xì)胞活化 在肝臟內(nèi)發(fā)生，同時(shí)肝臟預(yù)先有炎癥（即天然免疫活化）；則存活的CTLs增多，CTLs更有效， 導(dǎo)致肝臟免疫應(yīng)答，清除感染的HBV;而在預(yù)先肝臟無(wú)炎癥（即天然免疫未活化，如嬰幼兒 時(shí)），則CTL功能受損和CTL半壽命短，導(dǎo)致肝臟對(duì)HBV免疫耐受。然而，初始HBV抗原相遇免疫 誘導(dǎo)高效的主要激活HBV CTLs存在于肝臟外的淋巴結(jié)內(nèi)，然后再進(jìn)入肝臟，則也使存活的 CTLs增多，CTLs更有效，也導(dǎo)致肝臟免疫應(yīng)答，清除感染的HBV。這一關(guān)于兩個(gè)部位的免疫機(jī) 制為研制皮下、肌肉注射治療乙肝疫苗，導(dǎo)致肝臟免疫應(yīng)答、清除感染的HBV提供了理論依 據(jù)。
[0008] 2014年美國(guó) Thomas Η · King報(bào)道："A Who 1 e Recomb inant Yeas t-Based Therapeutic Vaccine that is comprised of heat-inactivated,whole recombinant Saccharomyces cerevisiae yeast cells expressing disease-related antigens"；為 一種由熱失活、全重組釀酒酵母細(xì)胞-表達(dá)與疾病相關(guān)抗原為基礎(chǔ)的治療性疫苗。該研究開(kāi) 創(chuàng)了以胞內(nèi)重組表達(dá)蛋白為抗原，以釀酒酵母細(xì)胞為佐劑的治療性疫苗平臺(tái)。在此平臺(tái)下 已有編號(hào)為GS4774為乙型肝炎治療性疫苗，其他表達(dá)的HBV抗原為一種作為融合蛋白的X-s-core抗原。這一酵母載體可以提供多種抗原進(jìn)入MHC I類(lèi)和II類(lèi)抗原提呈途徑，刺激強(qiáng)有 力的CD4+和CD8+細(xì)胞反應(yīng)，并能打破免疫學(xué)小鼠模型中抗原的耐受性。該酵母載體也不容 易在體內(nèi)被中和，因此適合于重復(fù)用藥，使之獲得長(zhǎng)期的免疫壓力，理想地清除慢性細(xì)胞內(nèi) 感染，如HCV和HBV。
[0009] 2010年Huang報(bào)道：啤酒酵母細(xì)胞壁純化而得的β-葡聚糖顆粒(GPS)，其中具有1， 3-D-glucan聚合物>85%，2%甲殼素，1%脂類(lèi)和蛋白質(zhì)，與其余的大部分是灰和水分。進(jìn)行 的體外T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，將卵清蛋白（OVA)復(fù)合至空心GPS殼內(nèi)（GP-OVA)組成的疫苗，并采 用游離OVA為對(duì)照抗原。GPS-0VA在從0.03到0.5μ克/毫升的濃度范圍內(nèi)，刺激0T-I或0T-II Τ細(xì)胞增殖;相反，游離OVA未能刺激0Τ-Ι或ΟΤ-ΙΙ Τ細(xì)胞性增殖。為了實(shí)現(xiàn)GP-0VA相似的刺 激效應(yīng)，要求游離OVA濃度提高百倍至數(shù)百倍。這些結(jié)果表明：（1)病毒樣顆粒GPS是Dectin-1受體的高效激動(dòng)劑；（2)病毒樣顆粒GP-OVA傳遞的抗原與游離OVA抗原相比，能被DCs (樹(shù)突 細(xì)胞)更高效地處理和提呈。
[0010] 2003-2005年期間美國(guó)科學(xué)家報(bào)道了：乙肝病毒感染黑猩猩系列研究結(jié)果?？刂萍?病的機(jī)制是肝細(xì)胞核HBV池的共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)。由于產(chǎn)生IFN- γ的HBV特異性⑶8 +Τ，即CTL細(xì)胞，大量涌入肝內(nèi)，靶向感染HBV的肝細(xì)胞;對(duì)cccDNA的清除、肝細(xì)胞感染HBV逆 轉(zhuǎn)都與肝臟⑶8+T細(xì)胞產(chǎn)生的IFN- γ涌入等相關(guān)。集合這些結(jié)果表明，cccDNA的清除是一個(gè) 由細(xì)胞免疫反應(yīng)介導(dǎo)的兩步的過(guò)程:第一步非細(xì)胞損傷地減少90%以上cccDNA分子池，從 而消除HBV松弛的環(huán)狀脫氧核糖核酸的前體。第二步提高了這個(gè)過(guò)程中損毀受感染的肝細(xì) 胞，并觸發(fā)免疫逆轉(zhuǎn)。
[0011] 2014年中國(guó)科技大學(xué)博士曾筑天報(bào)道:通過(guò)水動(dòng)力法建立了 HBV持續(xù)攜帶小鼠來(lái) 模擬HBV慢性感染者的免疫耐受狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)IL-12預(yù)處理與IL-12同HBsAg VLP疫苗共注射的 聯(lián)合治療方式，稱(chēng)為基于IL-12的疫苗療法，可以有效逆轉(zhuǎn)HBV系統(tǒng)性免疫耐受，進(jìn)而導(dǎo)致 HBV清除。發(fā)現(xiàn)HBV小鼠經(jīng)歷過(guò)基于IL-12的疫苗療法之后，淋巴結(jié)內(nèi)濾泡樣輔助T細(xì)胞(Tfh) 以及生發(fā)中心B細(xì)胞(GC B)都發(fā)生顯著擴(kuò)增，與之相對(duì)應(yīng)地，脾細(xì)胞中HBsAg特異性IgG生成 細(xì)胞也顯著增加，大部分小鼠在治療后期血清中出現(xiàn)保護(hù)性抗體anti-HBs;此外，T細(xì)胞體 外對(duì)HBsAg刺激的增殖能力在IL-12聯(lián)合疫苗治療之后也得到顯著恢復(fù)。這些結(jié)果充分證實(shí) HBV耐受小鼠在IL-12聯(lián)合治療過(guò)程中，對(duì)外周HBsAg疫苗的應(yīng)答得以恢復(fù)，從而提示HBV誘 導(dǎo)的系統(tǒng)性免疫耐受已被逆轉(zhuǎn)。基于現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)可以得出提供一種具有更好療效的乙肝 治療疫苗成為現(xiàn)有技術(shù)中亟待解決的問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 為解決前述技術(shù)問(wèn)題，提供一種具有更好療效的乙肝治療疫苗，本發(fā)明采用的技 術(shù)方案為：
[0013] 提供一種基于表達(dá)HBsAg和HBcAg的熱失活全重組漢遜酵母細(xì)胞的乙肝治療疫苗， 其特征在于:所述乙肝治療疫苗以重組漢遜酵母細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的HBsAg及HBcAg為抗原;含有 19個(gè)HBsAg特異性CTL表位和19個(gè)HBcAg特異性CTL表位;所述乙肝治療疫苗以熱滅全重組漢 遜酵母細(xì)為佐劑。
[0014] 所述乙肝治療疫苗，其特征是所述重組漢遜酵母表達(dá)的HBsAg為adw