的目的片段DNA稱為Inset DNA6〇
[0082] 將酶切鑒定正確的質(zhì)粒pHMPT-02用EcoR I/BamH I雙酶切，切膠回收后所得到的 載體DNA稱為Vector DNA6。
[0083] 使用TaKaRa DNA Ligation Kit(Code No.D6022)中的Solution，將Inset DNA6與 Vector DNA6連接后，熱轉(zhuǎn)化至E.coli Competent Cell JM109(Code N〇.D9052)中，涂布平 板過夜培養(yǎng)菌體。從轉(zhuǎn)化平板上挑選單菌落，提取質(zhì)粒DNA后用EcoR I/BamH I雙酶切，酶切 結(jié)果表明：MC407A+B+C+D-77c〇80均為陽性克隆。
[0084] 將 MC407A+B+C+D-77 號質(zhì)粒分別用引物 RV-M，M13-47，MC407P1，MC407P2，MC407P3， MC407P4，MC407P5，MC407P6，MC407P7，MC407P8，MC407P9，MC407BF11，MC407BR11 測序，證明 質(zhì)粒pMPT-HBS-adw結(jié)果正確。
[0085] 以同樣的方法，基于所述SEQ ID從):3構(gòu)建的?1031'-耶(：質(zhì)粒。
[0086] 實施例2
[0087] 重組漢遜酵母HBsAg工程菌株的構(gòu)建。
[0088]重組漢遜酵母乙型肝炎疫苗的轉(zhuǎn)化與篩選圖示說明：重組漢遜酵母的轉(zhuǎn)化與篩選 過程如圖5所示：
[0089] 具體包括
[0090] 1)應(yīng)用細(xì)胞電穿孔法，將pMPT-HBS-adw質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化作為宿主細(xì)胞的URA3-營養(yǎng)缺陷 型漢遜酵母細(xì)胞株HU-11 (CGMCC No. 1218)。采用選擇培養(yǎng)基(MD液體培養(yǎng)基)平皿培養(yǎng)。在 MD選擇培養(yǎng)系平皿上挑取生長的單菌落轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)接MD液體培養(yǎng)基后連續(xù)傳代培養(yǎng)，使 adw2亞型HBsAg基因及相應(yīng)調(diào)控組件多拷貝、外源整合入宿主漢遜酵母細(xì)胞染色體中。
[0091] 2)菌株篩選包括以下步驟
[0092] (1)選擇尿嘧啶原養(yǎng)型轉(zhuǎn)化子單菌落
[0093]挑選菌體生長速度快的菌落，應(yīng)用PCR技術(shù)檢測HBsAg基因條帶亮度后，挑選拷貝 數(shù)多的菌落，采用選擇培養(yǎng)基對單菌落進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，連續(xù)傳代培養(yǎng)20~400個世代；
[0094] (2)篩選多拷貝異源整合轉(zhuǎn)化克隆株，
[0095] 經(jīng)過步驟（1)傳代培養(yǎng)后，經(jīng)甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)72小時后，采用/放射免疫分析(Radio immunoassay or radioimmunoassay，RIA)測定轉(zhuǎn)化子細(xì)胞破碎后釋放出HBsAg的表達(dá)水 平；
[0096] (3)篩選去除游離質(zhì)粒的高拷貝、高表達(dá)克隆株
[0097]將經(jīng)過步驟(2)篩選的克隆株，采用YPD完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時后，轉(zhuǎn)接選擇培養(yǎng) 基平皿克隆化培養(yǎng)，并采用定量PCR檢測HBsAg基因拷貝數(shù)，以RIA檢測HBsAg表達(dá)水平。 [0098] (4)在步驟(3)的檢測結(jié)果基礎(chǔ)上，選擇遺傳穩(wěn)定的重組漢遜酵母HBsAg工程菌的 原代菌株。
[0099]按照同樣的方法，構(gòu)建并篩選重組漢遜酵母HBcAg工程菌株。
[0100] 實施例3、30升中試發(fā)酵(重組漢遜酵母HBcAg工程菌株和重組漢遜酵母HBsAg工程 菌株采用相同的發(fā)酵工藝方法）
[0101 ]主要工藝過程和操作要點：
[0102] 1)以200ml種子培養(yǎng)基解凍貯存菌種，接種至培養(yǎng)基中，均分兩個0.5L搖瓶，31°C 培養(yǎng)22小時作為一級種子；
[0103] 2)以1600ml種子培養(yǎng)基將一級種子轉(zhuǎn)接入二級種子培養(yǎng)基中，均分6個1L搖瓶，31 °(：培20小時作為二級種子；
[0104] 3)將12L發(fā)酵培養(yǎng)基調(diào)pH至5.5加入30L發(fā)酵罐中，將二級種子接入后，30-31°C經(jīng) 甘油、甲醇兩碳源，生長、去阻遏和誘導(dǎo)三時相，共培養(yǎng)85-96小時，在停止誘導(dǎo)2-3小時后收 獲細(xì)胞。將冷凍的細(xì)胞勻漿。
[0105] 操作要點：
[0106] (1)生長時相的補(bǔ)料操作要待溶氧有明顯下降，基礎(chǔ)培養(yǎng)基消耗時開始進(jìn)行，并且 隨著基礎(chǔ)培養(yǎng)基消耗量的增加逐步提高流加速度，待溶氧回升前2-3小時流加完畢。
[0107] (2)生長時相的后期要注意溶氧回升，記錄溶氧最低值，溶氧回升至70-80%時開 始流加，進(jìn)入去阻遏時相。
[0108] (3)去阻遏時相后期，流加結(jié)束后，溶氧開始回升。溶氧回升至70-80% %時開始流 加甲醇誘導(dǎo)溶液，將甲醇濃度控制在3-5%。，由甲醇檢測流加控制器控制流加速度。
[0109] 發(fā)酵結(jié)束前2-3小時停止甲醇流加，以減少細(xì)胞收獲時甲醇?xì)埩簟?br>[0110] 培養(yǎng)基
[0111] 1.氯化鈣溶液的配制
[0112]準(zhǔn)確稱量CaCl2 11.33g，放入洗凈的三角瓶中，加適量去離子水溶解后定容至 200ml〇
[0113] 2.微量元素溶液的配制
[0114] 準(zhǔn)確稱量以下試劑：
[0116] 將稱量后的試劑放入洗凈的三角瓶中，加適量去離子水溶解后定容至200ml。
[0117] 3.維生素溶液的配制
[0118] 準(zhǔn)確稱量以下試劑：
[0119] d-Biotin 6mg
[0120] Thiamin HC1 2000mg
[0121] 將生物素首先溶解在10ml的50%異丙醇中，待溶解后再加入Thiamin HC1，然后加 適量去離子溶解后水定容至l〇〇ml。
[0122] 4.痕量元素溶液的配制
[0123] 準(zhǔn)確稱量以下試劑：
[0125]將稱量后的試劑放入洗凈的三角瓶中，加適量去離子溶解后水定容至50ml。
[0126] 以上四種溶液分別除菌過濾備用。
[0127] 5.種子鹽溶液的配制
[0128] 準(zhǔn)確稱量以下試劑：
[0130]將稱量后的試劑放入洗凈的三角瓶中，加適量去離子水溶解后定容至1600ml。
[0131] 6.用2000ml三角瓶稱取甘油27g，混合鹽溶液360mL，加去離子水定容至1800ml，等 量分裝于兩個2000ml三角瓶中，110°C、30分鐘高壓蒸汽滅菌。
[0132] 110°C、30分鐘高壓蒸汽滅菌空消500ml三角瓶2個，1000ml三角瓶6個，100ml和 500ml量筒各一個。
[0133] 7.-級種子培養(yǎng)基在超凈臺中，無菌操作量取滅菌后的甘油水溶液各100ml，分別 置于滅菌后的2個500ml三角瓶中，并分別加入： 氯化鈣溶液 1ml Γ ? 微量元素溶液 1ml
[0134] 維生素溶液 0.5ml 痕量元素溶液 0.25ml
[0135] 將加入的溶液搖勻。
[0136] 8.二級種子培養(yǎng)基
[0137] 在超凈臺中以無菌操作技術(shù)取滅菌后的甘油水溶液1600ml置于滅菌后的2000ml 三角瓶中，并分別加入： 氯化鈣溶液 16ml 微量元素溶液 〗6ml
[0138] 維生素溶液 8ml 痕量元素溶液 4ml
[0139] 9.發(fā)酵培養(yǎng)基
[0140] 準(zhǔn)確稱量以下試劑并溶解于2000ml去離子水中。
[0142] 取一個500ml小燒杯稱取520g甘油，加泡敵10ml在線滅菌，然后加： 氯化鈣溶液 175ml 微量元素溶液 〗75ml
[0143] 維生素溶液 88ml 痕量元素溶液 44ml
[0144] 10.補(bǔ)料培養(yǎng)基
[0145] 取一個1000ml三角瓶，量取87g NH4H2P〇4、260g甘油，加去離子水500ml，加入包裹 好的補(bǔ)料管線，ll〇°C、30分鐘滅菌。
[0146] 11.去阻遏溶液
[0147] 用5000ml三角瓶，量取甘油1800g，加去離子水660ml，加入包裹好的補(bǔ)料管線，110 °C、30分鐘滅菌，冷卻后無菌操作加入過濾除菌的鹽溶液540ml。
[0148] 12.誘導(dǎo)溶液
[0149] 用1000ml三角瓶，量取甘油400ml，加入包裹好的補(bǔ)料管線，110°C、30分鐘滅菌，冷 卻后無菌操作加入甲醇1600ml。
[0150] 實施例4
[0151] 純化，HBsAg和HBcAg采用同樣的純化工藝，以HBsAg為例，工藝如下：
[0152] 將實施例3得到的重組漢遜酵母HBsAg工程菌株發(fā)酵液經(jīng)收獲細(xì)胞并洗滌細(xì)胞，純 化的詳細(xì)步驟可參見參考文獻(xiàn):李津，孔艷.重組乙型肝炎疫苗生產(chǎn)工藝.見李津，俞詠霆， 董德祥主編：生物制藥設(shè)備和分離純化技術(shù).第1版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2003 : 348-349.。其中可將上述收獲的細(xì)胞經(jīng)過勻漿器破碎，釋放出HBsAg;以0.22μπι微孔濾器過濾去 除細(xì)胞碎片;再以300Κ超微濾器超濾去除小分子雜質(zhì)；以硅膠吸附處理法提取HBsAg;最后 以丁基瓊脂糖疏水層析方法精制純化。
[0153] 實施例5
[0154] 熱失活重組漢遜酵母細(xì)胞最佳條件試驗
[0155] 為了確定熱失活重組漢遜酵母的最佳條件應(yīng)滿足以下要求：
[0156] (1)熱失活重組漢遜酵母的成活率盡可降低;使之小于5%。
[0157] (2)保持完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu);發(fā)揮多價位熱失活重組漢遜酵母佐劑活性作用；
[0158] (3)保持重組漢遜酵母細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的病毒樣顆粒(VLP)完整，使其抗原性不下降。
[0159] 以上三點是熱失活重組漢遜酵表達(dá)HBsAg和HBcAg生產(chǎn)工藝主要條件;將為制定疫 苗制造及檢定規(guī)程提供依據(jù)。其中熱失活重組漢遜酵母細(xì)胞內(nèi)病毒樣顆粒(VLP)的熱穩(wěn)定 性成為首次要解決的問題。
[0160] (1)、優(yōu)化條件的熱失活重組漢遜酵母細(xì)胞制備。
[0161] 重組漢遜酵母HBsAg工程菌(HS604-5株)細(xì)胞培養(yǎng)經(jīng)發(fā)酵或搖瓶誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)束后。 細(xì)胞用離心法在磷酸鹽緩沖液(PBS)中洗滌三次，將沉淀的漢遜酵母懸浮在計算體積的PBS 中。細(xì)胞使用〇D6QQnm計數(shù)，PBS稀釋為100D6QQnm/i%升，每支試管2毫升;每試驗組設(shè)破碎與不 破碎2支試管；16個試驗組共需制備32支細(xì)胞樣品試管