本申請要求2013年12月30日提交的國際申請?zhí)朠CT/CN2013/090923的優(yōu)先權(quán)，所述國際申請以引用的方式整體并入本文中。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及多價和多特異性結(jié)合蛋白以及制備和使用多價和多特異性結(jié)合蛋白的方法。有關(guān)以電子方式提交的文本文件的說明以電子方式與本申請一起提交的文本文件的內(nèi)容以引用的方式整體并入本文中：序列表的計算機可讀格式的副本(文件名：EPBI_001_01WO_SeqList_ST25.txt，記錄日期：2014年12月2日，文件大?。?8KB)。發(fā)明背景已經(jīng)嘗試產(chǎn)生雙特異性或多特異性抗體以制備可用于治療各種炎性疾病、癌癥和其它病癥的分子。已基于表達具有雙特異性抗體所需的特異性的鼠單克隆抗體的兩個不同雜交瘤細胞系的體細胞融合，使用四源雜交瘤(quadroma)技術(shù)(參見Milstein,C.和A.C.Cuello,Nature,1983.305(5934):第537-40頁)制造出雙特異性抗體。也可以通過化學(xué)方式偶聯(lián)兩種不同的mAb來制造雙特異性抗體(參見Staerz,U.D.等,Nature,1985.314(6012):第628-31頁)。其它方法使用了以化學(xué)方式偶聯(lián)兩種不同的單克隆抗體或較小的抗體片段(參見Brennan,M.等,Science,1985.229(4708):第81-3頁)。另一種方法是用異雙功能交聯(lián)劑偶合兩種親本抗體。具體地，將兩個不同的Fab片段在其鉸鏈半胱氨酸殘基處以定點方式通過化學(xué)方法交聯(lián)(參見Glennie,M.J.等,JImmunol,1987.139(7):第2367-75頁)。近年來，開發(fā)出來了其它重組雙特異性抗體形式(參見Kriangkum,J.等,BiomolEng,2001.18(2):第31-40頁)。其中，串聯(lián)單鏈Fv分子和雙價抗體(diabody)，及其各種衍生物已被用于構(gòu)建重組雙特異性抗體。這些分子的構(gòu)建通常由識別不同抗原的兩個單鏈Fv(scFv)片段開始(參見Economides,A.N.等,NatMed,2003.9(1):第47-52頁)。串聯(lián)scFv分子(taFv)代表以另外的肽連接子簡單地連接兩個scFv分子的一種簡單形式。這些串聯(lián)scFv分子中存在的兩個scFv片段形成獨立的折疊實體?？梢允褂酶鞣N連接子來連接這兩個scFv片段，其中連接子長度多達63個殘基(參見Nakanishi,K.等,AnnuRevImmunol,2001.19:第423-74頁)。在近期的研究中，報導(dǎo)了通過轉(zhuǎn)基因兔和牛在體內(nèi)表達針對CD28和黑素瘤相關(guān)蛋白聚糖的串聯(lián)scFv(參見Gracie,J.A.等,JClinInvest,1999.104(10):第1393-401頁)。在這一構(gòu)建體中，通過CH1連接子連接兩個scFv分子，并且發(fā)現(xiàn)雙特異性抗體的血清濃度高達100mg/L?，F(xiàn)有少數(shù)研究報導(dǎo)了在細菌中使用極短的Ala3連接子或富含甘氨酸/絲氨酸的較長連接子的可溶性串聯(lián)scFv分子的表達(參見Leung,B.P.等,JImmunol,2000.164(12):第6495-502頁；Ito,A.等,JImmunol,2003.170(9):第4802-9頁；Karni,A.等,JNeuroimmunol,2002.125(1-2):第134-40頁)。在近期的研究中，使用了含有長度是3或6個殘基的隨機化中間連接子的串聯(lián)scFv庫的噬菌體展示來富集在細菌中以可溶性和活性形式產(chǎn)生的那些分子。這一方法使得分離出具有6個氨基酸殘基的連接子的優(yōu)選的串聯(lián)scFv分子(參見Arndt,M.和J.Krauss,MethodsMolBiol,2003.207:第305-21頁)。雙特異性雙價抗體(Db)利用了雙價抗體形式進行表達。雙價抗體是由scFv片段，通過將連接VH和VL結(jié)構(gòu)域的連接子的長度減小到約5個殘基來制備(參見Peipp,M.和T.Valerius,BiochemSocTrans,2002.30(4):第507-11頁)。這種連接子大小的減小有利于通過VH和VL結(jié)構(gòu)域的交叉配對進行兩條多肽鏈的二聚化。雙特異性雙價抗體通過在同一細胞內(nèi)表達具有結(jié)構(gòu)VHA-VLB和VHB-VLA(VH-VL構(gòu)型)或VLA-VHB和VLB-VHA(VL-VH構(gòu)型)的兩條多肽鏈而產(chǎn)生。近期的比較性研究證實，可變結(jié)構(gòu)域的取向會影響活性結(jié)合位點的表達和形成(參見Mack,M.,G.Riethmuller及P.Kufer,ProcNatlAcadSciUSA,1995.92(15):第7021-5頁)。一種促使產(chǎn)生雙特異性雙價抗體的方法是產(chǎn)生鈕入孔(knob-into-hole)雙價抗體(參見Holliger,P.,T.Prospero及G.Winter,ProcNatlAcadSciUSA,1993.90(14):第6444-8.18頁)。針對HER2和CD3的雙特異性雙價抗體證實了這一點。在抗HER2可變結(jié)構(gòu)域或抗CD3可變結(jié)構(gòu)域中，通過Val37與Phe交換以及Leu45與Trp交換在VH結(jié)構(gòu)域中引入大鈕，并且通過使Phe98突變成Met且使Tyr87突變成Ala而在VL結(jié)構(gòu)域中產(chǎn)生互補孔。通過使用這種方法，雙特異性雙價抗體的產(chǎn)生可以從由親本雙價抗體得到的72％增加到由鈕入孔雙價抗體得到的90％以上。單鏈雙價抗體(scDb)代表改善類雙特異性雙價抗體分子的形成的一種替代性策略(參見Holliger,P.和G.Winter,CancerImmunolImmunother,1997.45(3-4):第128-30頁；Wu,A.M.等,Immunotechnology,1996.2(1):第21-36頁)。雙特異性單鏈雙價抗體是通過用長度為約15個氨基酸殘基的另外的中間連接子連接兩個形成雙價抗體的多肽鏈而產(chǎn)生。因此，分子量對應(yīng)于單價單鏈雙價抗體(50-60kDa)的所有分子都是雙特異性的。若干研究已經(jīng)證實，雙特異性單鏈雙價抗體在細菌中以可溶性和活性形式表達，其中大多數(shù)純化的分子以單體形式存在(參見Holliger,P.和G.Winter,CancerImmunolImmunother,1997.45(3-4):第128-30頁；Wu,A.M.等,Immunotechnology,1996.2(1):第21-36頁；Pluckthun,A.和P.Pack,Immunotechnology,1997.3(2):第83-105頁；Ridgway,J.B.等,ProteinEng,1996.9(7):第617-21頁)。雙價抗體與Fc融合產(chǎn)生更類似Ig的分子，稱為雙雙價抗體(參見Lu,D.等,JBiolChem,2004.279(4):第2856-65頁)。此外，也已描述了在IgG的重鏈中包含兩個Fab重復(fù)并且能夠結(jié)合四個抗原分子的多價抗體構(gòu)建體(參見美國專利8,722,859B2，及Miller,K.等,JImmunol,2003.170(9):第4854-61頁)。最近的實例是四價IgG–單鏈可變片段(scFv)融合物(DongJ等,2011MAbs3:273–288；ColomaMJ,MorrisonSL1997NatBiotechnol15:159–163；LuD等,2002JImmunolMethods267:213–226)、三功能大鼠/小鼠雜交雙特異性表皮細胞粘附分子-CD3抗體卡妥索單抗(catumaxomab)(LindhoferH等,1995JImmunol155:219–225)、雙特異性CD19-CD3scFv抗體比那妥莫單抗(blinatumomab)(BargouR等,2008Science321:974–977)、“雙效Fab”(DAF)抗體(BostromJ等,2009Science323:1610–1614)、與催化性抗體共價連接的藥效團肽(DoppalapudiVR等,2010ProcNatlAcadSciUSA107:22611–22616)、在一半IgG4分子之間使用動態(tài)交換產(chǎn)生雙特異性抗體(vanderNeutKolfschotenM等,2007Science317:1554–1557；StubenrauchK等,2010DrugMetabDispos38:84–91)或通過在一半雙特異性抗體的抗原結(jié)合片段(Fab)內(nèi)交換重鏈結(jié)構(gòu)域與輕鏈結(jié)構(gòu)域(交叉Mab形式)(SchaeferW等,2011ProcNatlAcadSci108:11187-92)。本領(lǐng)域中需要具有雙重抗原結(jié)合功能的單分子實體，以及產(chǎn)生此類多價和多特異性結(jié)合蛋白的方法。本發(fā)明滿足了這些和其它需求。發(fā)明概述本發(fā)明提供了多價和多特異性結(jié)合蛋白以及制備和使用此類結(jié)合蛋白的方法。在一個實施方案中，本文提供的多價和多特異性結(jié)合蛋白是串聯(lián)Fab免疫球蛋白(FIT-Ig)，并且能夠結(jié)合兩個或更多個抗原，或同一抗原的兩個或更多個表位，或同一表位的兩個或更多個拷貝。本文提供的多價和多特異性結(jié)合蛋白可用于治療和/或預(yù)防急性和慢性炎性疾病和病癥、自體免疫性疾病、癌癥、脊髓損傷、敗血癥及其它疾病、病癥和病狀。本文提供了包含所述多價和多特異性結(jié)合蛋白的藥物組合物。此外，本文還提供了用于制備此類FIT-Ig的核酸、重組表達載體及宿主細胞。使用本發(fā)明的FIT-Ig在體內(nèi)或體外檢測特定抗原的方法也涵蓋在本發(fā)明中。本發(fā)明提供了一組能夠例如以高親和力結(jié)合兩個或更多個抗原的結(jié)合蛋白。在一方面，本發(fā)明提供了一種使用兩種親本單克隆抗體構(gòu)建雙特異性結(jié)合蛋白的方法：結(jié)合抗原A的mAbA和結(jié)合抗原B的mAbB。在一個實施方案中，本文公開的結(jié)合蛋白能夠結(jié)合抗原、細胞因子、趨化因子、細胞因子受體、趨化因子受體、細胞因子或趨化因子相關(guān)分子，或細胞表面蛋白。因此，在一方面，提供了能夠結(jié)合兩個或更多個抗原的結(jié)合蛋白。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種包含至少兩條多肽鏈的結(jié)合蛋白，其中所述多肽鏈配對形成能夠結(jié)合兩個或更多個抗原的類IgG分子。在一個實施方案中，所述結(jié)合蛋白包含兩條、三條、四條、五條或更多條的多肽鏈。在一個實施方案中，所述結(jié)合蛋白包含至少一個VLA、至少一個VLB、至少一個VHA、至少一個VHB、至少一個CL及至少一個CH1，其中VL是輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，VH是重鏈可變結(jié)構(gòu)域，CL是輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域，CH1是重鏈的第一恒定結(jié)構(gòu)域，A是第一抗原，并且B是第二抗原。在另一實施方案中，所述第一多肽鏈包含VLA、CL、VHB及CH1。在另一實施方案中，所述結(jié)合蛋白另外包含F(xiàn)c。在另一實施方案中，F(xiàn)c區(qū)是變體Fc區(qū)。在另一實施方案中，變體Fc區(qū)展現(xiàn)出改進的效應(yīng)功能，如ADCC或CDC。在另一實施方案中，變體Fc區(qū)展現(xiàn)出針對一個或多個FcγR的改進的親和力或親合力。在一個實施方案中，所述結(jié)合蛋白包含三條多肽鏈，其中第一多肽鏈包含VLA、CL、VHB及CH1，第二多肽鏈包含VHA和CH1，并且第三多肽鏈包含VLB和CL。在另一實施方案中，所述結(jié)合蛋白的第一多肽鏈另外包含F(xiàn)c。在另一實施方案中，所述結(jié)合蛋白包含兩條多肽鏈，其中第一多肽鏈包含VLA、CL、VHB及CH1，第二多肽鏈包含VHA、CH1、VLB及CL。在另一實施方案中，第一多肽鏈另外包含F(xiàn)c。在一個實施方案中，所述結(jié)合蛋白包含三條多肽鏈，并且其相應(yīng)cDNA在共轉(zhuǎn)染期間是以1:1:1、1:1.5:1、1:3:1、1:1:1.5、1:1:3、1:1.5:1.5、1:3:1.5、1:1.5:3或1:3:3的第一:第二:第三摩爾比存在。在另一實施方案中，所述結(jié)合蛋白包含兩條多肽鏈，并且通過優(yōu)化，其相應(yīng)cDNA在共轉(zhuǎn)染期間是以1:1、1:1.5或1:3，或任何其它比率的第一:第二摩爾比存在，以使任何給定轉(zhuǎn)染中單體FIT-Ig分數(shù)最大。在一個實施方案中，本發(fā)明的結(jié)合蛋白不包含肽連接子。在一個實施方案中，本發(fā)明的結(jié)合蛋白包含至少一個氨基酸或多肽連接子。在另一實施方案中，所述連接子選自由以下組成的組：G、GS、SG、GGS、GSG、SGG、GGG、GGGS、SGGG、GGGGS、GGGGSGS、GGGGSGS、GGGGSGGS、GGGGSGGGGS、GGGGSGGGGSGGGGS、AKTTPKLEEGEFSEAR、AKTTPKLEEGEFSEARV、AKTTPKLGG、SAKTTPKLGG、AKTTPKLEEGEFSEARV、SAKTTP、SAKTTPKLGG、RADAAP、RADAAPTVS、RADAAAAGGPGS、RADAAAA(G4S)4、SAKTTP、SAKTTPKLGG、SAKTTPKLEEGEFSEARV、ADAAP、ADAAPTVSIFPP、TVAAP、TVAAPSVFIFPP、QPKAAP、QPKAAPSVTLFPP、AKTTPP、AKTTPPSVTPLAP、AKTTAP、AKTTAPSVYPLAP、ASTKGP、ASTKGPSVFPLAP、GENKVEYAPALMALS、GPAKELTPLKEAKVS及GHEAAAVMQVQYPAS。所述連接子也可以是在體內(nèi)可裂解的肽連接子、蛋白酶(如MMP)敏感性連接子、如先前所描述的可以通過還原進行裂解的基于二硫鍵的連接子等(FusionProteinTechnologiesforBiopharmaceuticals:ApplicationsandChallenges,由StefanR.Schmidt編輯)或本領(lǐng)域中已知的任何可裂解的連接子。這些可裂解的連接子可以用于在體內(nèi)釋放頂部的Fab用于各種目的，以便改善組織/細胞滲透和分布，增進與靶標(biāo)的結(jié)合，減少潛在副作用，以及調(diào)節(jié)2個不同的Fab區(qū)的體內(nèi)功能和物理半衰期。在一個實施方案中，所述結(jié)合蛋白包含：第一多肽，從氨基末端到羧基末端，其包含VLA-CL-VHB-CH1-Fc；第二多肽鏈，從氨基末端到羧基末端，其包含VHA-CH1；及第三多肽鏈，從氨基末端到羧基末端，其包含VLB-CL；其中VL是輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，CL是輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域，VH是重鏈可變結(jié)構(gòu)域，CH1是重鏈的第一恒定結(jié)構(gòu)域，A是第一表位或抗原，并且B是第二表位或抗原。在一個實施方案中，F(xiàn)c區(qū)是人IgG1。在另一實施方案中，F(xiàn)c區(qū)是變體Fc區(qū)。在另一實施方案中，F(xiàn)c區(qū)的氨基酸序列與SEQIDNO:20具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性。在另一實施方案中，第一多肽鏈的CL與VHB直接融合。在另一實施方案中，第一多肽鏈的CL經(jīng)由氨基酸或寡肽連接子連接至VHB。在另一實施方案中，所述連接子是GSG(SEQIDNO:26)或GGGGSGS(SEQIDNO:28)。在另一實施方案中，所述結(jié)合蛋白包含：第一多肽，從氨基末端到羧基末端，其包含VHB-CH1-VLA-CL-Fc；第二多肽鏈，從氨基末端到羧基末端，其包含VHA-CH1；及第三多肽鏈，從氨基末端到羧基末端，其包含VLB-CL；其中VL是輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，CL是輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域，VH是重鏈可變結(jié)構(gòu)域，CH1是重鏈的第一恒定結(jié)構(gòu)域，A是第一表位或抗原，并且B是第二表位或抗原。在一個實施方案中，F(xiàn)c區(qū)是人IgG1。在另一實施方案中，F(xiàn)c區(qū)是變體Fc區(qū)。在另一實施方案中，F(xiàn)c區(qū)的氨基酸序列與SEQIDNO:20具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性。在一個實施方案中，第一多肽鏈的CH1與VLA直接融合。在另一實施方案中，第一多肽鏈的CH1經(jīng)由氨基酸或寡肽連接子連接至VLA。在另一實施方案中，所述連接子是GSG(SEQIDNO:26)或GGGGSGS(SEQIDNO:28)。在另一實施方案中，所述結(jié)合蛋白包含：第一多肽，從氨基末端到羧基末端，其包含VLA-CL-VHB-CH1-Fc；及第二多肽鏈，從氨基末端到羧基末端，其包含VHA-CH1-VLB-CL；其中VL是輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，CL是輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域，VH是重鏈可變結(jié)構(gòu)域，CH1是重鏈的第一恒定結(jié)構(gòu)域，A是第一表位或抗原，并且B是第二表位或抗原。在一個實施方案中，F(xiàn)c區(qū)是人IgG1。在另一實施方案中，F(xiàn)c區(qū)是變體Fc區(qū)。在另一實施方案中，F(xiàn)c區(qū)的氨基酸序列與SEQIDNO:20具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性。在另一實施方案中，第一多肽鏈的CL與VHB直接融合。在另一實施方案中，第一多肽鏈的CL經(jīng)由氨基酸或寡肽連接子連接至VHB。在另一實施方案中，所述連接子是GSG(SEQIDNO:26)或GGGGSGS(SEQIDNO:28)。在另一實施方案中，結(jié)合蛋白包含第一多肽，從氨基末端到羧基末端，其包含VHB-CH1-VLA-CL-Fc；及第二多肽鏈，從氨基末端到羧基末端，其包含VLB-CL-VHA-CH1；其中VL是輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，CL是輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域，VH是重鏈可變結(jié)構(gòu)域，CH1是重鏈的第一恒定結(jié)構(gòu)域，A是第一表位或抗原，并且B是第二表位或抗原。在一個實施方案中，F(xiàn)c區(qū)是人IgG1。在另一實施方案中，F(xiàn)c區(qū)是變體Fc區(qū)。在另一實施方案中，F(xiàn)c區(qū)的氨基酸序列與SEQIDNO:20具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％同一性。在一個實施方案中，第一多肽鏈的CH1與VLA直接融合。在另一實施方案中，第一多肽鏈的CH1經(jīng)由氨基酸或寡肽連接子連接至VLA。在另一實施方案中，所述連接子是GSG(SEQIDNO:26)或GGGGSGS(SEQIDNO:28)。本發(fā)明的結(jié)合蛋白能夠結(jié)合細胞因子對。舉例來說，本發(fā)明的結(jié)合蛋白能夠結(jié)合選自由以下組成的組的細胞因子對：IL-1α和IL-1β；IL-12和IL-18；TNFα和IL-23；TNFα和IL-13；TNF和IL-18；TNF和IL-12；TNF和IL-1β；TNF和MIF；TNF和IL-6；TNF和IL-6受體；TNF和IL-17；IL-17和IL-20；IL-17和IL-23；TNF和IL-15；TNF和VEGF；VEGFR和EGFR；PDGFR和VEGF；IL-13和IL-9；IL-13和IL-4；IL-13和IL-5；IL-13和IL-25；IL-13和TARC；IL-13和MDC；IL-13和MIF；IL-13和TGF-β；IL-13和LHR激動劑；IL-13和CL25；IL-13和SPRR2a；IL-13和SPRR2b；IL-13和ADAM8；及TNFα和PGE4；IL-13和PED2；TNF和PEG2。在一個實施方案中，本發(fā)明的結(jié)合蛋白能夠結(jié)合IL-17和IL-20。在一個實施方案中，本發(fā)明的結(jié)合蛋白能夠結(jié)合IL-17和IL-20并且包含來源于抗IL-17抗體LY和抗IL-20抗體15D2的可變重鏈和可變輕鏈。在一個實施方案中，本發(fā)明的結(jié)合蛋白能夠結(jié)合IL-17和TNF。在一個實施方案中，本發(fā)明的結(jié)合蛋白能夠結(jié)合IL-17和TNF并且包含來源于抗IL-17抗體LY和TNF抗體戈利木單抗(golimumab)的可變重鏈和可變輕鏈。在一個實施方案中，本發(fā)明的結(jié)合蛋白結(jié)合IL-17和IL-20并且包含：第一多肽，其包含選自由SEQIDNO:15、25和27組成的組的氨基酸序列，基本上由所述序列組成或由所述序列組成；第二多肽鏈，其包含根據(jù)SEQIDNO:21的氨基酸序列，基本上由所述序列組成或由所述序列組成；及第三多肽鏈，其包含根據(jù)SEQIDNO:23的序列，基本上由所述序列組成或由所述序列組成。在另一實施方案中，本發(fā)明的結(jié)合蛋白結(jié)合IL-27和IL-20并且包含：第一多肽鏈，其包含選自由SEQIDNO:15、25和27組成的組的氨基酸序列，基本上由所述序列組成或由所述序列組成；及第二多肽鏈，其包含選自由SEQIDNO:29、30和31組成的組的氨基酸序列，基本上由所述序列組成或由所述序列組成。在一個實施方案中，本發(fā)明的結(jié)合蛋白結(jié)合TNF和IL-17并且包含：第一多肽，其包含根據(jù)SEQIDNO:87的氨基酸序列，基本上由所述序列組成或由所述序列組成；第二多肽鏈，其包含根據(jù)SEQIDNO:89的氨基酸序列，基本上由所述序列組成或由所述序列組成；及第三多肽鏈，其包含根據(jù)SEQIDNO:91的序列，基本上由所述序列組成或由所述序列組成。在另一實施方案中，所述結(jié)合蛋白能夠結(jié)合選自由以下組成的組的靶標(biāo)對：CD137和CD20；CD137和EGFR；CD137和Her-2；CD137和PD-1；CD137和PDL-1；VEGF和PD-L1；Lag-3和TIM-3；OX40和PD-1；TIM-3和PD-1；TIM-3和PDL-1；EGFR和DLL-4；CD138和CD20；CD138和CD40；CD19和CD20；CD20和CD3；CD3和CD33；CD3和CD133；CD47和CD20；CD38和CD138；CD38和CD20；CD20和CD22；CD38和CD40；CD40和CD20；CD-8和IL-6；CSPGs和RGMA；CTLA-4和BTNO2；IGF1和IGF2；IGF1/2和Erb2B；IGF-1R和EGFR；EGFR和CD13；IGF-1R和ErbB3；EGFR-2和IGFR；VEGFR-2和Met；VEGF-A和血管生成素-2(Ang-2)；IL-12和TWEAK；IL-13和IL-1β；PDGFR和VEGF；EpCAM和CD3；Her2和CD3；CD19和CD3；EGFR和Her3；CD16a和CD30；CD30和PSMA；EGFR和CD3；CEA和CD3；TROP-2和HSG；TROP-2和CD3；MAG和RGMA；NgR和RGMA；NogoA和RGMA；OMGp和RGMA；PDL-1和CTLA-4；CTLA-4和PD-1；PD-1和TIM-3；RGMA和RGMB；Te38和TNFα；TNFα和Blys；TNFα和CD-22；TNFα和CTLA-4結(jié)構(gòu)域；TNFα和GP130；TNFα和IL-12p40；及TNFα和RANK配體；因子IXa，因子X。在一個實施方案中，本發(fā)明的結(jié)合蛋白能夠結(jié)合CD3和CD20。在一個實施方案中，本發(fā)明的結(jié)合蛋白能夠結(jié)合CD3和CD20并且包含來源于抗CD3抗體OKT3和抗CD20抗體奧法木單抗(ofatumumab)的可變重鏈和可變輕鏈。在一個實施方案中，本發(fā)明的結(jié)合蛋白能夠結(jié)合CTLA-4和PD-1。在一個實施方案中，本發(fā)明的結(jié)合蛋白能夠結(jié)合CTLA-4和PD-1并且包含來源于CTLA-4抗體伊匹單抗(ipilimumab)和PD-1抗體納武單抗(nivolumab)的可變重鏈和可變輕鏈。在一個實施方案中，本發(fā)明的結(jié)合蛋白結(jié)合CD3和CD20并且包含：第一多肽鏈，其包含選自由SEQIDNO:41和48組成的組的氨基酸序列，基本上由所述序列組成或由所述序列組成；第二多肽鏈，其包含根據(jù)SEQIDNO:44的氨基酸序列，基本上由所述序列組成或由所述序列組成；及第三多肽鏈，其包含根據(jù)SEQIDNO:46的氨基酸序列，基本上由所述序列組成或由所述序列組成。在一個實施方案中，本發(fā)明的結(jié)合蛋白結(jié)合CTLA-4和PD-1并且包含：第一多肽鏈，其包含根據(jù)SEQIDNO:92的氨基酸序列，基本上由所述序列組成或由所述序列組成；第二多肽鏈，其包含根據(jù)SEQIDNO:95的氨基酸序列，基本上由所述序列組成或由所述序列組成；及第三多肽鏈，其包含根據(jù)SEQIDNO:97的氨基酸序列，基本上由所述序列組成或由所述序列組成。在一個實施方案中，本文提供的結(jié)合蛋白能夠結(jié)合CTLA-4上的一個或多個表位。在一個實施方案中，本文提供的結(jié)合蛋白能夠結(jié)合PD-1上的一個或多個表位。在一個實施方案中，所述結(jié)合蛋白能夠結(jié)合T細胞上的一種或多種免疫檢查點蛋白，如例如TIM-3、Lag3、ICOS、BTLA、CD160、2B4、KIR、CD137、CD27、OX40、CD40L及A2aR上的一個或多個表位。在另一實施方案中，所述結(jié)合蛋白能夠結(jié)合參與免疫檢查點路徑的一種或多種腫瘤細胞表面蛋白，如例如PD-L1、PD-L2、半乳糖凝集素9、HVEM、CD48、B7-1、B7-2、ICOSL、B7-H3、B7-H4、CD137L、OX40L、CD70及CD40上的一個或多個表位。在一方面，本發(fā)明提供藥物組合物，其包含本文所述的結(jié)合蛋白。在一個實施方案中，本文提供的藥物組合物包含如前述技術(shù)方案中任一項所述的結(jié)合蛋白及一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。在另一方面，本發(fā)明提供治療或預(yù)防有需要的受試者的炎性疾病、自體免疫性疾病、神經(jīng)退行性疾病、癌癥、敗血癥或脊髓損傷的方法。在一個實施方案中，所述方法包括向受試者施用有效量的一種或多種本文所提供的結(jié)合蛋白，或一種或多種包含本文提供的結(jié)合蛋白和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。本文還提供了本文所述的結(jié)合蛋白的用途，所述結(jié)合蛋白用于制造供治療或預(yù)防炎性疾病、自體免疫性疾病、神經(jīng)退行性疾病、癌癥或脊髓損傷的藥物。在一個實施方案中，所述炎性疾病、自體免疫性疾病或神經(jīng)退行性疾病選自由以下組成的組：哮喘、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、全身性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化、阿爾茨海默氏病或帕金森氏病。在一個實施方案中，本公開提供了用于治療或預(yù)防有需要的受試者的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、骨質(zhì)疏松癥、中風(fēng)、肝病或口腔癌的方法，所述方法包括向受試者施用本文所述的FIT-Ig結(jié)合蛋白，其中所述結(jié)合蛋白能夠結(jié)合IL-17和IL-20。在另一實施方案中，所述FIT-Ig結(jié)合蛋白包含選自SEQIDNO:15、25和27的氨基酸序列；和根據(jù)SEQIDNO:21的氨基酸序列；及根據(jù)SEQIDNO:23的氨基酸序列。在另一實施方案中，所述FIT-Ig結(jié)合蛋白包含選自SEQIDNO:15、25和27的氨基酸序列；和選自SEQIDNO:29、30和31的氨基酸序列。在一個實施方案中，本公開提供了用于治療或預(yù)防有需要的受試者的B細胞癌癥的方法，所述方法包括向受試者施用FIT-Ig結(jié)合蛋白，其中所述FIT-Ig結(jié)合蛋白能夠結(jié)合一個或多個B細胞抗原。在另一實施方案中，所述FIT-Ig結(jié)合蛋白能夠結(jié)合CD20。在另一實施方案中，所述FIT-Ig結(jié)合蛋白能夠結(jié)合CD20和另一抗原。在另一實施方案中，所述結(jié)合蛋白能夠結(jié)合CD3和CD20。在另一實施方案中，所述癌癥是B細胞癌癥。在又另一實施方案中，B細胞癌癥選自由以下組成的組：霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin'slymphoma)、非霍奇金氏淋巴瘤[NHL]、前體B細胞淋巴母細胞性白血病/淋巴瘤、成熟B細胞贅瘤、B細胞慢性淋巴細胞白血病/小淋巴細胞性淋巴瘤、B細胞幼淋巴細胞白血病、淋巴漿細胞淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、皮膚濾泡中心淋巴瘤、邊緣區(qū)B細胞淋巴瘤、毛細胞白血病、彌漫性大B細胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt'slymphoma)、漿細胞瘤、漿細胞性骨髓瘤、移植后淋巴增生病癥、移瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血癥(Waldenstrom'smacroglobulinemia)及間變性大細胞淋巴瘤。在一個實施方案中，本公開提供了用于治療或預(yù)防有需要的受試者的B細胞癌癥的方法，所述方法包括向受試者施用FIT-Ig結(jié)合蛋白，其中所述FIT-Ig結(jié)合蛋白包含根據(jù)SEQIDNO:41或48的氨基酸序列；和根據(jù)SEQIDNO:44的氨基酸序列；及根據(jù)SEQIDNO:46的氨基酸序列。在一個實施方案中，本公開提供了用于治療或預(yù)防有需要的受試者的自體免疫性疾病、炎性疾病或感染的方法，所述方法包括向受試者施用本文所述的FIT-Ig結(jié)合蛋白，其中所述結(jié)合蛋白能夠結(jié)合TNF和IL-17。在另一實施方案中，F(xiàn)IT-Ig結(jié)合蛋白包含根據(jù)SEQIDNO:87、89和91的序列。在另一實施方案中，本公開提供了用于治療或預(yù)防自體免疫或炎性疾病的方法，所述方法包括向受試者施用FIT-Ig結(jié)合蛋白，其中所述結(jié)合蛋白能夠結(jié)合TNF和IL-17，并且其中所述自體免疫或炎性疾病選自由以下組成的組：克羅恩氏病(Crohn'sdisease)、牛皮癬(包括斑塊狀牛皮癬)、關(guān)節(jié)炎(包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎或青少年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎)、多發(fā)性硬化、強直性脊椎炎、強直性關(guān)節(jié)病變(spondylosingarthropathy)、全身性紅斑狼瘡、葡萄膜炎、敗血癥、神經(jīng)退行性疾病、神經(jīng)元再生、脊髓損傷、原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性癌癥、呼吸道病癥、哮喘、過敏性和非過敏性哮喘、由感染引起的哮喘、由感染呼吸道合胞病毒(RSV)引起的哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、涉及氣道炎癥的病狀、嗜酸性粒細胞增多癥、纖維化和過量粘液產(chǎn)生、囊性纖維化、肺纖維化、異位性病癥、異位性皮炎、蕁麻疹、濕疹、過敏性鼻炎、過敏性腸胃炎、炎性和/或自體免疫性皮膚病狀、炎性和/或自體免疫性胃腸器官病狀、炎性腸病(IBD)、潰瘍性結(jié)腸炎、炎性和/或自體免疫性肝病、肝硬化、肝纖維化、由乙型和/或丙型肝炎病毒引起的肝纖維化、硬皮病。在另一實施方案中，在另一實施方案中，本公開提供了用于治療或預(yù)防有需要的受試者的癌癥的方法，所述方法包括向受試者施用本文所述的FIT-Ig結(jié)合蛋白，其中所述結(jié)合蛋白能夠結(jié)合TNF和IL-17。在另一實施方案中，所述癌癥是肝細胞癌；成膠質(zhì)細胞瘤；淋巴瘤；或霍奇金氏淋巴瘤。在另一實施方案中，本公開提供了用于治療或預(yù)防有需要的受試者的感染的方法，所述方法包括向受試者施用本文所述的FIT-Ig結(jié)合蛋白，其中所述感染是病毒感染、細菌感染、寄生蟲感染、HTLV-1感染。在一個實施方案中，本公開提供了用于抑制1型保護性免疫反應(yīng)的表達和抑制在疫苗接種期間1型保護性免疫反應(yīng)的表達的方法。在一個實施方案中，本公開提供了用于治療有需要的受試者的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的方法，所述方法包括向受試者施用FIT-Ig結(jié)合蛋白，其中所述結(jié)合蛋白包含根據(jù)SEQIDNO:87、89和91的序列。在一個實施方案中，本公開提供了用于治療或預(yù)防有需要的受試者的癌癥的方法，所述方法包括向受試者施用本文所述的FIT-Ig結(jié)合蛋白，其中所述結(jié)合蛋白能夠結(jié)合CTLA-4和PD-1。在另一實施方案中，F(xiàn)IT-Ig結(jié)合蛋白包含含有SEQIDNO:92、95和97的氨基酸序列。在另一實施方案中，本公開提供了用于治療或預(yù)防有需要的受試者的癌癥的方法，其中所述結(jié)合蛋白能夠結(jié)合CTLA-4和PD-1，并且其中所述癌癥是典型地對免疫療法有反應(yīng)的癌癥。在另一實施方案中，所述癌癥是與免疫療法無關(guān)的癌癥。在另一實施方案中，所述癌癥是作為難治性或復(fù)發(fā)性惡性疾病的癌癥。在另一實施方案中，所述結(jié)合蛋白抑制腫瘤細胞的生長或存活。在另一實施方案中，癌癥選自由以下組成的組：黑素瘤(例如，轉(zhuǎn)移性惡性黑素瘤)、腎癌(例如，透明細胞癌)、前列腺癌(例如，激素難治性前列腺腺癌)、胰腺癌、乳癌、結(jié)腸癌、肺癌(例如，非小細胞肺癌)、食道癌、頭頸鱗狀細胞癌、肝癌、卵巢癌、宮頸癌、甲狀腺癌、成膠質(zhì)細胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、白血病、淋巴瘤及其它贅生性惡性疾病。在一個實施方案中，本公開提供了用于治療或預(yù)防有需要的受試者的黑素瘤的方法，所述方法包括向受試者施用本文所述的FIT-Ig結(jié)合蛋白，其中所述結(jié)合蛋白能夠結(jié)合CTLA-4和PD-1。在另一實施方案中，本公開提供了用于治療或預(yù)防有需要的受試者的黑素瘤的方法，其中所述方法包括向受試者施用包含根據(jù)SEQIDNO:92、95和97的氨基酸序列的FIT-Ig結(jié)合蛋白。在另一實施方案中，本公開提供了用于治療或預(yù)防有需要的受試者的感染或感染性疾病的方法，所述方法包括向受試者施用本文所述的FIT-Ig結(jié)合蛋白，其中所述結(jié)合蛋白能夠結(jié)合CTLA-4和PD-1。在一個實施方案中，F(xiàn)IT-Ig結(jié)合蛋白是單獨施用或與疫苗組合施用，以刺激針對病原體、毒素及半抗原的免疫反應(yīng)。因此，在一個實施方案中，本文提供的結(jié)合蛋白可以用于刺激針對感染人的病毒(諸如但不限于人免疫缺陷病毒；甲型、乙型和丙型肝炎病毒；愛潑斯坦-巴爾病毒(EpsteinBarrvirus)；人巨細胞病毒；人乳頭瘤病毒；皰疹病毒)、細菌、真菌、寄生蟲或其它病原體的免疫反應(yīng)。附圖簡述圖1A顯示由三個構(gòu)建體，如FIT1-Ig、FIT2-Ig和FIT3-Ig構(gòu)成的FIT-Ig的結(jié)構(gòu)。圖1B顯示用于制備此類FIT1-Ig的三個構(gòu)建體。圖2A顯示由兩個構(gòu)建體構(gòu)成的FIT-Ig的基本結(jié)構(gòu)。圖2B顯示用于制備此類FIT-Ig的兩個構(gòu)建體。圖3提供了通過Biacore測量的FIT1-Ig的雙特異性抗原結(jié)合。圖3的上圖顯示了其中依序利用IL-17和IL-20使FIT1-Ig飽和的Biacore結(jié)合測定的結(jié)果。圖3的下圖顯示了其中依序利用IL-20和IL-17使FIT1-Ig飽和的Biacore測定的結(jié)果。圖4顯示了通過PEG誘導(dǎo)的沉淀所測量的抗IL-17/IL-20FITIg或單克隆抗體利妥昔單抗(rituximab)在一系列pH下的溶解度。圖5顯示了在DG44(5A和5B)和CHO-S(5C和5D)系統(tǒng)中穩(wěn)定CHO細胞系發(fā)育的穩(wěn)定性。圖6顯示了通過ELISA評估的FIT10-Ig或親本抗體伊匹單抗和納武單抗與CTLA-4(6A)或PD-1(圖6B)的結(jié)合。圖7顯示了FIT10-Ig針對CTLA-4和PD-1的多重結(jié)合研究。圖7中同時顯示依序與CTLA-4和PD-1結(jié)合；及依序與PD-1和CTLA-4結(jié)合。詳細說明本發(fā)明涉及多價和多特異性結(jié)合蛋白、制備所述結(jié)合蛋白的方法及其在預(yù)防和/或治療急性和慢性炎性疾病和病癥、癌癥及其它疾病方面的用途。本發(fā)明涉及能夠結(jié)合兩個或更多個抗原的多價和/或多特異性結(jié)合蛋白。具體地，本發(fā)明涉及串聯(lián)Fab免疫球蛋白(FIT-Ig)和其藥物組合物，以及用于制備此類FIT-Ig的核酸、重組表達載體和宿主細胞。本發(fā)明還涵蓋使用本發(fā)明的FIT-Ig在體外或體內(nèi)檢測特定抗原的方法。本文提供的新型結(jié)合蛋白家族能夠例如以高親和力結(jié)合兩個或更多個抗原。具體地，本發(fā)明提供一種使用2種親本單克隆抗體，即結(jié)合至抗原a的mAbA和結(jié)合至抗原b的mAbB構(gòu)建雙特異性結(jié)合蛋白的方法。在一方面，本發(fā)明提供了一種結(jié)合蛋白，其包含對第一抗原或表位具有特異性的可變輕鏈、第一輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域、對第二抗原或表位具有特異性的可變重鏈、第一重鏈CH1、對第一抗原或表位具有特異性的可變重鏈、第二重鏈CH1、對第二抗原或表位具有特異性的可變重鏈及第二輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域。在一個實施方案中，所述結(jié)合蛋白還包含F(xiàn)c區(qū)。所述結(jié)合蛋白可以還包含連接所述結(jié)合蛋白的兩種或更多種組分的一個或多個氨基酸或多肽連接子。舉例來說，所述結(jié)合蛋白可以包含將輕鏈可變區(qū)連接至輕鏈恒定區(qū)的多肽連接子。在一個實施方案中，本公開提供了一種結(jié)合蛋白，其包含含有VLA-CL-(X1)n-VHB-CH1-(X2)n的多肽鏈，其中VLA是mAbA的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，CL是輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域，X1表示氨基酸或寡肽連接子，VHB是mAbB的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，CH1是重鏈的第一恒定結(jié)構(gòu)域，X2表示Fc區(qū)或不同的二聚化結(jié)構(gòu)域，并且n是0或1。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種結(jié)合蛋白，其包含三條不同的多肽鏈(圖1)，其中第一多肽鏈(構(gòu)建體#1)包含VLA-CL-(X1)n-VHB-CH1-(X2)n，其中VLA是mAbA的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，CL是輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域，X1表示氨基酸或寡肽連接子，VHB是mAbB的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，CH1是重鏈的第一恒定結(jié)構(gòu)域，X2表示Fc區(qū)或不同的二聚化結(jié)構(gòu)域，并且n是0或1。第二多肽鏈(構(gòu)建體#2)包含VHA-CH1，其中VHA是mAbA的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，并且CH1是重鏈的第一恒定結(jié)構(gòu)域。第三多肽鏈(構(gòu)建體#3)包含VLB-CL，其中VLB是mAbB的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，并且CL是輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域。在另一實施方案中，本發(fā)明提供一種結(jié)合蛋白，其包含三條不同的多肽鏈，所述多肽鏈的總體分子設(shè)計類似于前一實施方案，例外是可變結(jié)構(gòu)域的次序顛倒。在所述實施方案中，第一多肽鏈包含VHB-CH1-(X1)n-VLA-CL-(X2)n，其中VLA是mAbA的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，CL是輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域，X1表示氨基酸或寡肽連接子，VHB是mAbB的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，CH1是重鏈的第一恒定結(jié)構(gòu)域，X2表示Fc區(qū)或不同的二聚化結(jié)構(gòu)域，并且n是0或1。第二多肽鏈包含VHA-CH1，其中VHA是mAbA的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，并且CH1是重鏈的第一恒定結(jié)構(gòu)域。第三多肽鏈包含VLB-CL，其中VLB是mAbB的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，并且CL是輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域。在另一實施方案中，本發(fā)明提供一種結(jié)合蛋白，其包含兩條不同的多肽鏈(圖2)，其中第一多肽鏈(構(gòu)建體#1)包含VLA-CL-(X1)n-VHB-CH1-(X2)n，其中VLA是mAbA的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，CL是輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域，X1表示氨基酸或寡肽連接子，VHB是mAbB的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，CH1是重鏈的第一恒定結(jié)構(gòu)域，X2表示Fc區(qū)或不同的二聚化結(jié)構(gòu)域，并且n是0或1。第二多肽鏈(構(gòu)建體#4)包含VHA-CH1-(X3)n-VLB-CL，其中VHA是mAbA的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，CH1是重鏈的第一恒定結(jié)構(gòu)域，X3表示不為恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸或多肽，n是0或1，VLB是mAbB的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，并且CL是輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域。在另一實施方案中，本發(fā)明提供一種結(jié)合蛋白，其包含兩條多肽鏈，所述多肽鏈的總體分子設(shè)計類似于前一實施方案，例外是可變結(jié)構(gòu)域的次序顛倒。在這一實施方案中，第一多肽鏈包含VHB-CH1-(X1)n-VLA-CL-(X2)n，其中VLA是mAbA的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，CL是輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域，X1表示氨基酸或寡肽連接子，VHB是mAbB的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，CH1是重鏈的第一恒定結(jié)構(gòu)域，X2表示Fc區(qū)或不同的二聚化結(jié)構(gòu)域，并且n是0或1。第二多肽鏈包含VLB-CL-(X3)n-VHA-CH1，其中VHA是mAbA的重鏈可變結(jié)構(gòu)域，CH1是重鏈的第一恒定結(jié)構(gòu)域，X3表示氨基酸或寡肽連接子，n是0或1，VLB是mAbB的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，并且CL是輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域。在一個實施方案中，所述結(jié)合蛋白中的VH和VL結(jié)構(gòu)域選自由以下組成的組：鼠重鏈/輕鏈可變結(jié)構(gòu)域、完全人重鏈/輕鏈可變結(jié)構(gòu)域、CDR移植的重鏈/輕鏈可變結(jié)構(gòu)域、人源化重鏈/輕鏈可變結(jié)構(gòu)域及其混合物。在一個優(yōu)選實施方案中，VHA/VLA和VHB/VLB能夠結(jié)合同一抗原。在另一實施方案中，VHA/VLA和VHB/VLB能夠結(jié)合不同抗原。在一個實施方案中，第一多肽鏈包含VLA-CL-VHB-CH1-Fc，并且第一多肽鏈的CL和VHB直接融合在一起。在另一實施方案中，CL和VHB通過氨基酸或寡肽連接子連接。在另一實施方案中，第一多肽鏈包含VHB-CH1-VLA-CL-Fc，并且CH1和VLA直接融合在一起。在另一實施方案中，CH1和VLA通過氨基酸或寡肽連接子連接。在另一實施方案中，寡肽或多肽連接子包含了提供柔性的任何合理序列的一個或多個氨基酸。優(yōu)選地，所述連接子選自由以下組成的組：G、GS、SG、GGS、GSG、SGG、GGG、GGGS、SGGG、GGGGS、GGGGSGS、GGGGSGS、GGGGSGGS、GGGGSGGGGS、GGGGSGGGGSGGGGS、AKTTPKLEEGEFSEAR、AKTTPKLEEGEFSEARV、AKTTPKLGG、SAKTTPKLGG、AKTTPKLEEGEFSEARV、SAKTTP、SAKTTPKLGG、RADAAP、RADAAPTVS、RADAAAAGGPGS、RADAAAA(G4S)4、SAKTTP、SAKTTPKLGG、SAKTTPKLEEGEFSEARV、ADAAP、ADAAPTVSIFPP、TVAAP、TVAAPSVFIFPP、QPKAAP、QPKAAPSVTLFPP、AKTTPP、AKTTPPSVTPLAP、AKTTAP、AKTTAPSVYPLAP、ASTKGP、ASTKGPSVFPLAP、GENKVEYAPALMALS、GPAKELTPLKEAKVS及GHEAAAVMQVQYPAS。在一個實施方案中，連接子的氨基酸序列可以選自由SEQIDNO.26、28和49-86組成的組。在一個實施方案中，所述連接子是GSG(SEQIDNO:26)或GGGGSGS(SEQIDNO:28)。所述連接子也可以是在體內(nèi)可裂解的肽連接子、蛋白酶(如MMP)敏感性連接子、如先前所描述的可以通過還原進行裂解的基于二硫鍵的連接子等(FusionProteinTechnologiesforBiopharmaceuticals:ApplicationsandChallenges,由StefanR.Schmidt編輯)或本領(lǐng)域中已知的任何可裂解的連接子。這些可裂解的連接子可以用于在體內(nèi)釋放頂部的Fab用于各種目的，以便改善組織/細胞滲透和分布，增進與靶標(biāo)的結(jié)合，減少潛在副作用，以及調(diào)節(jié)2個不同的Fab區(qū)的體內(nèi)功能和物理半衰期。在一個實施方案中，所述結(jié)合蛋白包含F(xiàn)c區(qū)。如本文所用，術(shù)語“Fc區(qū)”是指IgG重鏈的C末端區(qū)。含有人IgG1Fc區(qū)的氨基酸序列的實例是SEQIDNO:20。IgG的Fc區(qū)包含兩個恒定結(jié)構(gòu)域，即CH2和CH3。在一個實施方案中，F(xiàn)c區(qū)是變體Fc區(qū)。在一個實施方案中，相對于親本Fc區(qū)，變體Fc區(qū)具有一個或多個氨基酸修飾，如取代、缺失或插入。在另一實施方案中，相對于親本Fc區(qū)活性，F(xiàn)c區(qū)的氨基酸修飾改變了效應(yīng)功能活性。舉例來說，在一個實施方案中，變體Fc區(qū)可以具有改變的(即，增加的或降低的)抗體依賴性細胞毒性(ADCC)、補體介導(dǎo)的細胞毒性(CDC)、吞噬作用、調(diào)理作用或細胞結(jié)合。在另一實施方案中，相對于親本Fc區(qū)，F(xiàn)c區(qū)氨基酸修飾可以改變(即，增加或降低)變體Fc區(qū)對FcγR的親和力。舉例來說，變體Fc區(qū)可以改變對FcγRI、FcγRII、FcγRIII的親和力。在一個優(yōu)選實施方案中，本文提供的結(jié)合蛋白能夠結(jié)合一個或多個靶標(biāo)。在一個實施方案中，所述靶標(biāo)選自由以下組成的組：細胞因子、細胞表面蛋白、酶及受體。優(yōu)選地，所述結(jié)合蛋白能夠調(diào)節(jié)一個或多個靶標(biāo)的生物功能。更優(yōu)選地，所述結(jié)合蛋白能夠中和一個或多個靶標(biāo)。在一個實施方案中，本發(fā)明的結(jié)合蛋白能夠結(jié)合選自由淋巴因子、單核因子及多肽激素組成的組的細胞因子。在另一實施方案中，所述結(jié)合蛋白能夠結(jié)合選自由以下組成的組的細胞因子對：IL-1α和IL-1β；IL-12和IL-18；TNFα和IL-23；TNFα和IL-13；TNF和IL-18；TNF和IL-12；TNF和IL-1β；TNF和MIF；TNF和IL-6；TNF和IL-6受體；TNF和IL-17；IL-17和IL-20；IL-17和IL-23；TNF和IL-15；TNF和VEGF；VEGFR和EGFR；IL-13和IL-9；IL-13和IL-4；IL-13和IL-5；IL-13和IL-25；IL-13和TARC；IL-13和MDC；IL-13和MIF；IL-13和TGF-β；IL-13和LHR激動劑；IL-13和CL25；IL-13和SPRR2a；IL-13和SPRR2b；IL-13和ADAM8；及TNFα和PGE4；IL-13和PED2；TNF和PEG2。在另一實施方案中，本發(fā)明的結(jié)合蛋白能夠結(jié)合選自由以下組成的組的靶標(biāo)對：CD137和CD20；CD137和EGFR；CD137和Her-2；CD137和PD-1；CD137和PDL-1；VEGF和PD-L1；Lag-3和TIM-3；OX40和PD-1；TIM-3和PD-1；TIM-3和PDL-1；EGFR和DLL-4；VEGF和EGFR；HGF和VEGF；VEGF和VEGF(相同或不同表位)；VEGF和Ang2；EGFR和cMet；PDGF和VEGF；VEGF和DLL-4；OX40和PD-L1；ICOS和PD-1；ICOS和PD-L1；Lag-3和PD-1；Lag-3和PD-L1；Lag-3和CTLA-4；ICOS和CTLA-4；CD138和CD20；CD138和CD40；CD19和CD20；CD20和CD3；CD3和CD33；CD3和CD133；CD38和CD138；CD38和CD20；CD20和CD22；CD38和CD40；CD40和CD20；CD47和CD20；CD-8和IL-6；CSPGs和RGMA；CTLA-4和BTNO2；CTLA-4和PD-1；IGF1和IGF2；IGF1/2和Erb2B；IGF-1R和EGFR；EGFR和CD13；IGF-1R和ErbB3；EGFR-2和IGFR；Her2和Her2(相同或不同表位)；因子IXa、因子X、VEGFR-2和Met；VEGF-A和血管生成素-2(Ang-2)；IL-12和TWEAK；IL-13和IL-1β；MAG和RGMA；NgR和RGMA；NogoA和RGMA；OMGp和RGMA；PDL-1和CTLA-4；PD-1和TIM-3；RGMA和RGMB；Te38和TNFα；TNFα和Blys；TNFα和CD-22；TNFα和CTLA-4結(jié)構(gòu)域；TNFα和GP130；TNFα和IL-12p40；及TNFα和RANK配體。在一個實施方案中，所述結(jié)合蛋白能夠結(jié)合人IL-17和人IL-20。在另一實施方案中，所述結(jié)合蛋白能夠結(jié)合人IL-17和人IL-20并且包含：FIT-Ig多肽鏈#1序列，其與選自由SEQIDNO.15、25和27組成的組的序列具有約65％、約70％、約75％、約80％、約85％、約90％、約95％、約99％或100％同一性；多肽鏈#2序列，其與SEQIDNO.21具有約65％、約70％、約75％、約80％、約85％、約90％、約95％、約99％或100％同一性；及多肽鏈#3序列，其與SEQIDNO.23具有約65％、約70％、約75％、約80％、約85％、約90％、約95％、約99％或100％同一性。在另一實施方案中，所述結(jié)合蛋白能夠結(jié)合人IL-17和人IL-20并且包含：FIT-Ig多肽鏈#1序列，其與選自由SEQIDNO.15、25和27組成的組的序列具有約65％、約70％、約75％、約80％、約85％、約90％、約95％、約99％或100％同一性；及多肽鏈#4，其與選自由SEQIDNO.29、30和31組成的組的序列具有約65％、約70％、約75％、約80％、約85％、約90％、約95％、約99％或100％同一性。在一個實施方案中，所述結(jié)合蛋白能夠結(jié)合人CD3和人CD20。在另一實施方案中，所述結(jié)合蛋白包含：FIT-Ig多肽鏈#1序列，其與選自由SEQIDNO.41和48組成的組的序列具有約65％、約70％、約75％、約80％、約85％、約90％、約95％、約99％或100％同一性；多肽鏈#2序列，其與SEQIDNO.46具有約65％、約70％、約75％、約80％、約85％、約90％、約95％、約99％或100％同一性；及多肽鏈#3序列，其與SEQIDNO.46具有約65％、約70％、約75％、約80％、約85％、約90％、約95％、約99％或100％同一性。在一個實施方案中，所述結(jié)合蛋白能夠結(jié)合人IL-17和人TNF。在另一實施方案中，所述結(jié)合蛋白能夠結(jié)合人IL-17和人TNF并且包含：FIT-Ig多肽鏈#1序列，其與SEQIDNO.87具有約65％、約70％、約75％、約80％、約85％、約90％、約95％、約99％或100％同一性；多肽鏈#2序列，其與SEQIDNO.89具有約65％、約70％、約75％、約80％、約85％、約90％、約95％、約99％或100％同一性；及多肽鏈#3序列，其與SEQIDNO.91具有約65％、約70％、約75％、約80％、約85％、約90％、約95％、約99％或100％同一性。在一個實施方案中，所述結(jié)合蛋白能夠結(jié)合人CTLA-4和人PD-1。在另一實施方案中，所述結(jié)合蛋白能夠結(jié)合人CTLA-4和人PD-1并且包含：FIT-Ig多肽鏈#1序列，其與SEQIDNO.92具有約65％、約70％、約75％、約80％、約85％、約90％、約95％、約99％或100％同一性；多肽鏈#2序列，其與SEQIDNO.95具有約65％、約70％、約75％、約80％、約85％、約90％、約95％、約99％或100％同一性；及多肽鏈#3序列，其與SEQIDNO.97具有約65％、約70％、約75％、約80％、約85％、約90％、約95％、約99％或100％同一性。在另一實施方案中，本發(fā)明的結(jié)合蛋白能夠結(jié)合一個或兩個選自由以下組成的組的細胞因子、細胞因子相關(guān)蛋白及細胞因子受體：BMP1、BMP2、BMP3B(GDF10)、BMP4、BMP6、BMP8、CSF1(M-CSF)、CSF2(GM-CSF)、CSF3(G-CSF)、EPO、FGF1(aFGF)、FGF2(bFGF)、FGF3(int-2)、FGF4(HST)、FGF5、FGF6(HST-2)、FGF7(KGF)、FGF9、FGF10、FGF11、FGF12、FGF12B、FGF14、FGF16、FGF17、FGF19、FGF20、FGF21、FGF23、IGF1、IGF2、IFNA1、IFNA2、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFNB1、IFNG、IFNW1、FIL1、FIL1(EPSILON)、FIL1(ZETA)、IL1A、IL1B、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、IL10、IL11、IL12A、IL12B、IL13、IL14、IL15、IL16、IL17、IL17B、IL18、IL19、IL20、IL22、IL23、IL24、IL25、IL26、IL27、IL28A、IL28B、IL29、IL30、PDGFA、FGER1、FGFR2、FGFR3、EGFR、ROR1、2B4、KIR、CD137、CD27、OX40、CD40L、A2aR、CD48、B7-1、B7-2、ICOSL、B7-H3、B7-H4、CD137L、OX40L、CD70、CD40、PDGFB、TGFA、TGFB1、TGFB2、TGFB3、LTA(TNF-b)、LTB、TNF(TNF-a)、TNFSF4(OX40配體)、TNFSF5(CD40配體)、TNFSF6(FasL)、TNFSF7(CD27配體)、TNFSF8(CD30配體)、TNFSF9(4-1BB配體)、TNFSF10(TRAIL)、TNFSF11(TRANCE)、TNFSF12(APO3L)、TNFSF13(April)、TNFSF13B、TNFSF14(HVEM-L)、TNFSF15(VEGI)、TNFSF18、FIGF(VEGFD)、VEGF、VEGFB、VEGFC、IL1R1、IL1R2、IL1RL1、IL1RL2、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3RA、IL4R、IL5RA、IL6R、IL7R、IL8RA、IL8RB、IL9R、IL10RA、IL10RB、IL11RA、IL12RB1、IL12RB2、IL13RA1、IL13RA2、IL15RA、IL17R、IL18R1、IL20RA、IL21R、IL22R、IL1HY1、IL1RAP、IL1RAPL1、IL1RAPL2、IL1RN、IL6ST、IL18BP、IL18RAP、IL22RA2、AIF1、HGF、LEP(瘦素)、PTN及THPO。本發(fā)明的結(jié)合蛋白能夠結(jié)合一個或多個選自由以下組成的組的趨化因子、趨化因子受體及趨化因子相關(guān)蛋白：CCL1(I-309)、CCL2(MCP-1/MCAF)、CCL3(MIP-1a)、CCL4(MIP-1b)、CCL5(RANTES)、CCL7(MCP-3)、CCL8(mcp-2)、CCL11(嗜酸性粒細胞趨化因子)、CCL13(MCP-4)、CCL15(MIP-1d)、CCL16(HCC-4)、CCL17(TARC)、CCL18(PARC)、CCL19(MIP-3b)、CCL20(MIP-3a)、CCL21(SLC/非淋巴細胞趨化因子-2)、CCL22(MDC/STC-1)、CCL23(MPIF-1)、CCL24(MPIF-2/嗜酸性粒細胞趨化因子-2)、CCL25(TECK)、CCL26(嗜酸性粒細胞趨化因子-3)、CCL27(CTACK/ILC)、CCL28、CXCL1(GRO1)、CXCL2(GRO2)、CXCL3(GRO3)、CXCL5(ENA-78)、CXCL6(GCP-2)、CXCL9(MIG)、CXCL10(IP10)、CXCL11(I-TAC)、CXCL12(SDF1)、CXCL13、CXCL14、CXCL16、PF4(CXCL4)、PPBP(CXCL7)、CX3CL1(SCYD1)、SCYE1、XCL1(淋巴細胞趨化因子)、XCL2(SCM-1b)、BLR1(MDR15)、CCBP2(D6/JAB61)、CCR1(CKR1/HM145)、CCR2(mcp-1RB/RA)、CCR3(CKR3/CMKBR3)、CCR4、CCR5(CMKBR5/ChemR13)、CCR6(CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6)、CCR7(CKR7/EBI1)、CCR8(CMKBR8/TER1/CKR-L1)、CCR9(GPR-9-6)、CCRL1(VSHK1)、CCRL2(L-CCR)、XCR1(GPR5/CCXCR1)、CMKLR1、CMKOR1(RDC1)、CX3CR1(V28)、CXCR4、GPR2(CCR10)、GPR31、GPR81(FKSG80)、CXCR3(GPR9/CKR-L2)、CXCR6(TYMSTR/STRL33/Bonzo)、HM74、IL8RA(IL8Ra)、IL8RB(IL8Rb)、LTB4R(GPR16)、TCP10、CKLFSF2、CKLFSF3、CKLFSF4、CKLFSF5、CKLFSF6、CKLFSF7、CKLFSF8、BDNF、C5R1、CSF3、GRCC10(C10)、EPO、FY(DARC)、GDF5、HIF1A、IL8、PRL、RGS3、RGS13、SDF2、SLIT2、TLR2、TLR4、TREM1、TREM2及VHL。在另一實施方案中，本發(fā)明的結(jié)合蛋白能夠結(jié)合細胞表面蛋白，如例如整合素。在另一實施方案中，本發(fā)明的結(jié)合蛋白能夠結(jié)合選自由激酶和蛋白酶組成的組的酶。在又另一實施方案中，本發(fā)明的結(jié)合蛋白能夠結(jié)合選自由淋巴因子受體、單核因子受體及多肽激素受體組成的組的受體。在一個實施方案中，所述結(jié)合蛋白是多價的。在另一實施方案中，所述結(jié)合蛋白是多特異性的。上述多價和或多特異性結(jié)合蛋白具有期望的特性，特別是從治療的觀點看。舉例來說，所述多價和或多特異性結(jié)合蛋白可以(1)比二價抗體更快地被表達抗體所結(jié)合的抗原的細胞內(nèi)化(和/或分解代謝)；(2)是激動劑抗體；和/或(3)誘導(dǎo)表達所述多價抗體能夠結(jié)合的抗原的細胞的細胞死亡和/或細胞凋亡。提供多價和或多特異性結(jié)合蛋白的至少一種抗原結(jié)合特異性的“親本抗體”可以是這樣一種抗體，所述抗體被表達抗體所結(jié)合的抗原的細胞內(nèi)化(和/或分解代謝)；和/或可以是激動劑、細胞死亡誘導(dǎo)性抗體和/或細胞凋亡誘導(dǎo)性抗體，并且如本文所述的多價和或多特異性結(jié)合蛋白可以展現(xiàn)這些特性中的一種或多種特性的改善。此外，親本抗體可能缺乏這些特性中的一種或多種，但當(dāng)構(gòu)建為如本文所描述的多價結(jié)合蛋白形式時可以被賦予這些特性。在另一實施方案中，如通過表面等離子體共振所測量，本發(fā)明的結(jié)合蛋白針對一個或多個靶標(biāo)的締合速率常數(shù)(Kon)選自由以下組成的組：至少約102M-1s-1；至少約103M-1s-1；至少約104M-1s-1；至少約105M-1s-1；及至少約106M-1s-1。優(yōu)選地，如通過表面等離子體共振所測量，本發(fā)明的結(jié)合蛋白針對一個或多個靶標(biāo)的締合速率常數(shù)(Kon)介于102M-1s-1至103M-1s-1之間；介于103M-1s-1至104M-1s-1之間；介于104M-1s-1至105M-1s-1之間；或介于105M-1s-1至106M-1s-1之間。在另一實施方案中，如通過表面等離子體共振所測量，所述結(jié)合蛋白針對一個或多個靶標(biāo)的解離速率常數(shù)(Koff)選自由以下組成的組：最多約10-3s-1；最多約10-4s-1；最多約10-5s-1；及最多約10-6s-1。優(yōu)選地，如通過表面等離子體共振所測量，本發(fā)明的結(jié)合蛋白針對一個或多個靶標(biāo)的解離速率常數(shù)(Koff)是10-3s-1至10-4s-1；10-4s-1至10-5s-1；或10-5s-1至10-6s-1。在另一實施方案中，所述結(jié)合蛋白針對一個或多個靶標(biāo)的解離常數(shù)(KD)選自由以下組成的組：最多約10-7M；最多約10-8M；最多約10-9M；最多約10-10M；最多約10-11M；最多約10-12M；及最多10-13M。優(yōu)選地，本發(fā)明的結(jié)合蛋白針對IL-12或IL-23的解離常數(shù)(KD)是10-7M至10-8M；10-8M至10-9M；10-9M至10-10M；10-10至10-11M；10-11M至10-12M；或10-12M至10-13M。在另一實施方案中，上述結(jié)合蛋白是另外包含選自由以下組成的組的試劑的偶聯(lián)物：免疫粘附分子、顯影劑、治療劑及細胞毒性劑。在一個實施方案中，顯影劑選自由以下組成的組：放射性標(biāo)記、酶、熒光標(biāo)記、發(fā)光標(biāo)記、生物發(fā)光標(biāo)記、磁性標(biāo)記及生物素。在另一實施方案中，顯影劑是選自由以下組成的組的放射性標(biāo)記：3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho及153Sm。在一個實施方案中，治療劑或細胞毒性劑選自由以下組成的組：免疫抑制劑、免疫刺激劑、抗代謝物、烷化劑、抗生素、生長因子、細胞因子、抗血管生成劑、抗有絲分裂劑、蒽環(huán)霉素、毒素及細胞凋亡劑。在一個實施方案中，所述結(jié)合蛋白與所述試劑直接偶聯(lián)。在另一實施方案中，所述結(jié)合蛋白經(jīng)由連接子與所述試劑偶聯(lián)。適合的連接子包括但不限于，本文所公開的氨基酸和多肽連接子。連接子可以是可裂解的或不可裂解的。在另一實施方案中，上述結(jié)合蛋白是結(jié)晶的結(jié)合蛋白并且以晶體形式存在。優(yōu)選地，所述晶體是不含載體的藥用控制釋放晶體。更優(yōu)選地，結(jié)晶的結(jié)合蛋白在體內(nèi)的半衰期比所述結(jié)合蛋白的可溶性對應(yīng)物長。最優(yōu)選地，結(jié)晶的結(jié)合蛋白保持生物活性。在另一實施方案中，上述結(jié)合蛋白被糖基化。優(yōu)選地，糖基化是人糖基化模式。本發(fā)明一方面涉及一種編碼以上公開的結(jié)合蛋白中的任一種的分離的核酸。另一實施方案提供一種包含以上公開的分離的核酸的載體，其中所述載體選自由以下組成的組：pcDNA；pTT(Durocher等,NucleicAcidsResearch2002,第30卷,第2期)；pTT3(具有另外的多個克隆位點的pTT)；pEFBOS(Mizushima,S.和Nagata,S.,(1990)NucleicacidsResearch第18卷,第17期)；pBV；pJV；pcDNA3.1TOPO、pEF6TOPO及pBJ。提供了多特異性結(jié)合蛋白及其制備方法。所述結(jié)合蛋白可以使用各種技術(shù)產(chǎn)生。本公開提供了產(chǎn)生所述結(jié)合蛋白的表達載體、宿主細胞及方法。本公開的結(jié)合蛋白的抗原結(jié)合可變結(jié)構(gòu)域可以由包括多克隆Ab、單克隆Ab和或能夠結(jié)合所關(guān)注抗原的受體在內(nèi)的親本結(jié)合蛋白獲得。這些親本結(jié)合蛋白可以天然存在的，或者可以通過重組技術(shù)產(chǎn)生。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟悉用于產(chǎn)生抗體和/或分離的受體的許多方法，包括但不限于，使用雜交瘤技術(shù)；選擇性淋巴細胞抗體法(SLAM)；使用噬菌體、酵母或RNA-蛋白質(zhì)融合物展示或其它文庫；對包含至少一些人免疫球蛋白基因座的非人動物進行免疫接種；及制備嵌合抗體、CDR移植的抗體及人源化抗體。參見例如，US專利公布號20090311253A1。還可以使用親和力成熟技術(shù)來制備可變結(jié)構(gòu)域。所述結(jié)合蛋白的結(jié)合可變結(jié)構(gòu)域也可以由通過本領(lǐng)域中已知的提取工序(例如，使用溶劑、清潔劑和/或親和純化)獲得的分離的受體分子獲得，或通過本領(lǐng)域中已知的生物物理方法(例如，X射線結(jié)晶、NMR、干涉測量法和/或計算機建模)確定。提供的一個實施方案包括選擇具有結(jié)合蛋白分子所需的至少一種或多種特性的親本結(jié)合蛋白。在一個實施方案中，所需的特性是用于表征抗體參數(shù)的一種或多種特性，如例如抗原特異性、對抗原的特異性、對抗原的親和力、效力、生物功能、表位識別、穩(wěn)定性、溶解性、生產(chǎn)效率、免疫原性、藥代動力學(xué)、生物利用率、組織交叉反應(yīng)性或直系同源抗原結(jié)合。參見例如，US專利公布號20090311253。所述多特異性抗體還可以被設(shè)計成使得一個或多個抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域沒有功能。可變結(jié)構(gòu)域可以使用重組DNA技術(shù)，由通過本文所述方法中的任一種產(chǎn)生的親本結(jié)合蛋白獲得。在一個實施方案中，可變結(jié)構(gòu)域是鼠重鏈或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。在另一實施方案中，可變結(jié)構(gòu)域是CDR移植的或人源化可變重鏈或輕鏈結(jié)構(gòu)域。在一個實施方案中，可變結(jié)構(gòu)域是人重鏈或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。在一個實施方案中，使用重組DNA技術(shù)將一個或多個恒定結(jié)構(gòu)域連接至可變結(jié)構(gòu)域。在一個實施方案中，將包含一個或多個重鏈可變結(jié)構(gòu)域的序列連接至重鏈恒定結(jié)構(gòu)域并且將包含一個或多個輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的序列連接至輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域。在一個實施方案中，所述恒定結(jié)構(gòu)域分別是人重鏈恒定結(jié)構(gòu)域和人輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域。在一個實施方案中，將重鏈另外連接至Fc區(qū)。Fc區(qū)可以是原生序列Fc區(qū)或變體Fc區(qū)。在另一實施方案中，F(xiàn)c區(qū)是人Fc區(qū)。在另一實施方案中，F(xiàn)c區(qū)包括來自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD的Fc區(qū)。另外地，本文提供的結(jié)合蛋白可以用于組織特異性遞送(靶向組織標(biāo)記物和疾病介體以增強局部PK，由此達成較高功效和/或較低毒性)，包括細胞內(nèi)遞送(靶向內(nèi)化受體和細胞內(nèi)分子)，遞送到大腦內(nèi)部(靶向轉(zhuǎn)鐵蛋白受體和CNS疾病介體以穿過血腦屏障)。所述結(jié)合蛋白也可充當(dāng)載體蛋白，經(jīng)由結(jié)合至抗原的非中和性表位而將所述抗原遞送到特定位置并增加所述抗原的半衰期。此外，所述結(jié)合蛋白可以被設(shè)計成以物理方式連接至植入患者體內(nèi)的醫(yī)療裝置或靶向這些醫(yī)療裝置(參見Burke等(2006)AdvancedDrugDeliv.Rev.58(3):437-446；Hildebrand等(2006)SurfaceandCoatingsTechnol.200(22-23):6318-6324；Drug/devicecombinationsforlocaldrugtherapiesandinfectionprophylaxis,Wu(2006)Biomaterials27(11):2450-2467；Mediationofthecytokinenetworkintheimplantationoforthopedicdevices,Marques(2005)BiodegradableSystemsinTissueEngineer.Regen.Med.377-397)。將適當(dāng)類型的細胞引導(dǎo)至醫(yī)療植入物的位置可以促進正常組織功能治愈和恢復(fù)。或者，也通過與裝置偶合或靶向裝置的受體抗體融合蛋白來抑制在裝置植入后釋放的介體(包括但不限于，細胞因子)。在一方面，用以上公開的載體轉(zhuǎn)化宿主細胞。在一個實施方案中，宿主細胞是原核細胞。在另一實施方案中，宿主細胞是大腸桿菌。在另一實施方案中，宿主細胞是真核細胞。在另一實施方案中，真核細胞選自由以下組成的組：原生生物細胞、動物細胞、植物細胞及真菌細胞。在一個實施方案中，宿主細胞是哺乳動物細胞，包括但不限于，293、COS、NS0及CHO；和或真菌細胞，如釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，或昆蟲細胞，如Sf9。本發(fā)明另一方面提供一種制備以上公開的結(jié)合蛋白的方法，所述方法包括在足以產(chǎn)生所述結(jié)合蛋白的條件下，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)以上也公開的宿主細胞中的任一種。優(yōu)選地，由此方法產(chǎn)生的結(jié)合蛋白中有50％-75％是雙重特異性四價結(jié)合蛋白。更優(yōu)選地，由此方法產(chǎn)生的結(jié)合蛋白中有75％-90％是雙重特異性四價結(jié)合蛋白。最優(yōu)選地，所產(chǎn)生的結(jié)合蛋白中有90％-95％是雙重特異性四價結(jié)合蛋白。另一實施方案提供了根據(jù)以上公開的方法制備的結(jié)合蛋白。一個實施方案提供了一種用于釋放結(jié)合蛋白的組合物，其中所述組合物包含制劑及至少一種聚合物載體，所述制劑又包含以上公開的結(jié)晶的結(jié)合蛋白和某一成分。優(yōu)選地，聚合物載體是選自由以下組成的組的一種或多種的聚合物：聚(丙烯酸)、聚(氰基丙烯酸酯)、聚(氨基酸)、聚(酸酐)、聚(縮酚酸肽)、聚(酯)、聚(乳酸)、聚乳酸-乙醇酸共聚物或PLGA、聚(b-羥基丁酸酯)、聚(己內(nèi)酯)、聚(二氧環(huán)己酮)、聚(乙二醇)、聚((羥丙基)甲基丙烯酰胺、聚[(有機)磷氮烯]、聚(原酸酯)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯吡咯烷酮)、順丁烯二酸酐-烷基乙烯基醚共聚物、普洛尼克多元醇(pluronicpolyol)、白蛋白、海藻酸鹽、纖維素和纖維素衍生物、膠原蛋白、血纖維蛋白、明膠、透明質(zhì)酸、寡糖、葡糖胺聚糖、硫酸化多糖、其摻合物和共聚物。優(yōu)選地，所述成分選自由以下組成的組：白蛋白、蔗糖、海藻糖、乳糖醇、明膠、羥丙基-β-環(huán)糊精、甲氧基聚乙二醇及聚乙二醇。另一個實施方案提供一種用于治療哺乳動物的方法，所述方法包括以下步驟：向所述哺乳動物施用有效量的以上公開的組合物。本發(fā)明還提供一種藥物組合物，其包含如以上所公開的結(jié)合蛋白及藥學(xué)上可接受的載體。藥學(xué)上可接受的載體包括但不限于，磷酸鹽緩沖液或生理鹽水。其它常用的胃腸外媒劑包括磷酸鈉溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化鈉、乳酸林格氏液或不揮發(fā)油。靜脈內(nèi)媒劑包括流體和營養(yǎng)補充液、電解質(zhì)補充液，如基于林格氏右旋糖的那些等。也可以存在防腐劑和其它添加劑，如例如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑及惰性氣體等。更具體地，適合于注射使用的藥物組合物包括無菌水溶液(水溶性的情況)或分散液和用于臨時制備無菌注射溶液或分散液的無菌粉末。載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液態(tài)聚乙二醇等)及其適合的混合物。在一些情況下，優(yōu)選在組合物中包含等滲劑，例如糖類、多元醇如甘露糖醇、山梨糖醇，或氯化鈉。通過在組合物中包括例如單硬脂酸鋁和明膠等延遲吸收的試劑，可以使注射組合物的吸收延長。在另一個實施方案中，藥物組合物包含至少一種用于治療病癥的另外的治療劑。在一個實施方案中，所述另外的藥劑選自由以下組成的組：治療劑、顯影劑、細胞毒性劑、血管生成抑制劑(包括但不限于，抗VEGF抗體或VEGF捕獲劑)、激酶抑制劑(包括但不限于，KDR和TIE-2抑制劑)、共刺激分子阻斷劑(包括但不限于，抗B7.1、抗B7.2、CTLA4-Ig、抗PD-1、抗CD20)、粘附分子阻斷劑(包括但不限于，抗LFA-1抗體、抗E/L選擇素抗體、小分子抑制劑)、抗細胞因子抗體或其功能片段(包括但不限于，抗IL-18、抗TNF及抗IL-6/細胞因子受體抗體)、甲氨蝶呤(methotrexate)、環(huán)孢菌素(cyclosporin)、雷帕霉素(rapamycin)、FK506、可檢測標(biāo)記或報導(dǎo)子、TNF拮抗劑、抗風(fēng)濕藥、肌肉松弛劑、麻醉藥(narcotic)、非類固醇抗炎藥(NSAID)、止痛劑、麻醉劑(anesthetic)、鎮(zhèn)靜劑、局部麻醉劑、神經(jīng)肌肉阻斷劑、抗微生物劑、抗牛皮癬藥、皮質(zhì)類固醇、合成代謝類固醇(anabolicsteroid)、紅細胞生成素(erythropoietin)、免疫接種、免疫球蛋白、免疫抑制劑、生長激素、激素替代藥物、放射性藥劑、抗抑郁劑、抗精神病藥、興奮劑、哮喘藥物、β激動劑、吸入性類固醇、腎上腺素或類似物、細胞因子及細胞因子拮抗劑。在另一方面，本發(fā)明提供一種用于治療罹患其中能夠被以上公開的結(jié)合蛋白結(jié)合的一個或多個靶標(biāo)是有害的病癥的人受試者的方法，所述方法包括向所述人受試者施用以上公開的結(jié)合蛋白以使得所述人受試者體內(nèi)的所述一個或多個靶標(biāo)的活性得到抑制并且實現(xiàn)所述病癥的預(yù)防或治療。在一個實施方案中，所述疾病或病癥是炎性病狀、自體免疫性疾病或癌癥。在一個實施方案中，所述疾病或病癥選自包含以下的組：關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、青少年慢性關(guān)節(jié)炎、膿毒性關(guān)節(jié)炎、萊姆氏關(guān)節(jié)炎(Lymearthritis)、牛皮癬性關(guān)節(jié)炎、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、脊柱關(guān)節(jié)病、全身性紅斑狼瘡、克羅恩氏病、潰瘍性結(jié)腸炎、炎性腸病、胰島素依賴性糖尿病、甲狀腺炎、哮喘、過敏性疾病、牛皮癬、皮炎硬皮病、移植物抗宿主疾病、器官移植排斥反應(yīng)、與器官移植相關(guān)的急性或慢性免疫疾病、肉樣瘤病、動脈粥樣硬化、彌漫性血管內(nèi)凝血、川崎氏病(Kawasaki'sdisease)、格雷夫斯氏病(Grave'sdisease)、腎病綜合癥、慢性疲勞綜合癥、韋格納氏肉芽腫(Wegener'sgranulomatosis)、亨-舍二氏紫癜(Henoch-Schoenleinpurpurea)、腎臟顯微鏡下脈管炎、慢性活動性肝炎、葡萄膜炎、敗血性休克、中毒休克綜合征、敗血癥綜合癥、惡病質(zhì)、感染性疾病、寄生蟲病、獲得性免疫缺陷綜合癥、急性橫貫性脊髓炎、亨廷頓氏舞蹈癥(Huntington'schorea)、帕金森氏病、阿爾茨海默氏病、中風(fēng)、原發(fā)性膽汁性硬化、溶血性貧血、惡性疾病、心臟衰竭、心肌梗塞、埃迪遜氏病(Addison'sdisease)、散發(fā)性I型多腺體缺陷和II型多腺體缺陷、施密特氏綜合癥(Schmidt'ssyndrome)、成人(急性)呼吸窘迫綜合癥、禿頭癥、斑禿、血清反應(yīng)陰性關(guān)節(jié)病、關(guān)節(jié)病、瑞特氏病(Reiter'sdisease)、牛皮癬性關(guān)節(jié)病、潰瘍性結(jié)腸炎性關(guān)節(jié)病、腸源性滑膜炎、衣原體病、耶爾森氏菌和沙門氏菌相關(guān)性關(guān)節(jié)病、脊柱關(guān)節(jié)病、動脈粥樣化病/動脈硬化、異位性過敏、自體免疫性大皰病、尋常性天皰瘡、落葉狀天皰瘡、類天皰瘡、線性IgA疾病、自體免疫性溶血性貧血、Coombs試驗陽性溶血性貧血、獲得性惡性貧血、青少年惡性貧血、肌痛性腦炎/皇家自由疾病(RoyalFreeDisease)、慢性皮膚黏膜念珠菌病、巨細胞動脈炎、原發(fā)性硬化性肝炎、隱源性自體免疫性肝炎、獲得性免疫缺陷疾病綜合癥、獲得性免疫缺陷相關(guān)疾病、乙型肝炎、丙型肝炎、常見變異性免疫缺陷(常見變異性低丙種球蛋白血癥)、擴張性心肌病、女性不孕、卵巢衰竭、卵巢早衰、纖維性肺病、隱原性纖維性肺泡炎、發(fā)炎后間質(zhì)性肺病、間質(zhì)性肺炎、結(jié)締組織疾病相關(guān)性間質(zhì)性肺病、混合型結(jié)締組織疾病相關(guān)性肺病、系統(tǒng)性硬化相關(guān)性間質(zhì)性肺病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)性間質(zhì)性肺病、全身性紅斑狼瘡相關(guān)性肺病、皮肌炎/多發(fā)性肌炎相關(guān)性肺病、修格連氏疾病(disease)相關(guān)性肺病、強直性脊椎炎相關(guān)性肺病、脈管炎性彌漫性肺病、含鐵血黃素沉積病相關(guān)性肺病、藥物誘發(fā)的間質(zhì)性肺病、纖維化、放射性纖維化、閉塞性細支氣管炎、慢性嗜酸細胞性肺炎、淋巴細胞性浸潤性肺病、感染后間質(zhì)性肺病、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、自體免疫性肝炎、1型自體免疫性肝炎(典型性自體免疫性或狼瘡樣肝炎)、2型自體免疫性肝炎(抗LKM抗體肝炎)、自體免疫介導(dǎo)的低血糖、B型胰島素抵抗伴發(fā)黑色棘皮病、甲狀旁腺功能減退、器官移植相關(guān)性急性免疫疾病、器官移植相關(guān)性慢性免疫疾病、骨關(guān)節(jié)病、原發(fā)性硬化性膽管炎、1型牛皮癬、2型牛皮癬、特發(fā)性白血球減少病、自體免疫性中性粒細胞減少癥、腎病NOS、腎小球腎炎、腎臟顯微鏡下脈管炎、萊姆氏病、盤狀紅斑狼瘡、特發(fā)性或NOS型男性不育、精子自體免疫、多發(fā)性硬化(所有亞型)、交感性眼炎、結(jié)締組織疾病繼發(fā)的肺高壓、古帕斯捷氏綜合癥(Goodpasture'ssyndrome)、結(jié)節(jié)性多動脈炎的肺表現(xiàn)、急性風(fēng)濕熱、類風(fēng)濕性脊椎炎、斯蒂爾氏病(Still'sdisease)、系統(tǒng)性硬化、修格連氏綜合癥、高安氏病(Takayasu'sdisease)/動脈炎、自體免疫性血小板減少癥、特發(fā)性血小板減少癥、自體免疫性甲狀腺疾病、甲狀腺機能亢進、甲狀腺腫自體免疫性甲狀腺功能減退(橋本氏病(Hashimoto'sdisease))、衰退性自體免疫性甲狀腺功能減退、原發(fā)性黏液水腫、晶狀體源性葡萄膜炎、原發(fā)性脈管炎、白癜風(fēng)、急性肝病、急性肝病、酒精性肝硬化、酒精誘發(fā)的肝損傷、膽汁郁積、特異質(zhì)性肝病、藥物誘發(fā)的肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、過敏和哮喘、B型鏈球菌(GBS)感染、精神障礙(例如，抑郁和精神分裂癥)、Th2型和Th1型介導(dǎo)的疾病、急性和慢性疼痛(不同形式的疼痛)，及癌癥如肺癌、乳癌、胃癌、膀胱癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌及直腸癌，及血液惡性疾病(白血病和淋巴瘤)、Aβ脂蛋白血癥、四肢發(fā)紺、急性和慢性寄生蟲或感染過程、急性白血病、急性淋巴母細胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、急性或慢性細菌感染、急性胰腺炎、急性腎衰竭、腺癌、心房異位搏動、AIDS癡呆復(fù)合征、酒精誘發(fā)的肝炎、過敏性結(jié)膜炎、過敏性接觸性皮炎、過敏性鼻炎、同種異體移植物排斥反應(yīng)、α-l抗胰蛋白酶缺乏、肌萎縮性側(cè)索硬化、貧血、心絞痛、前角細胞變性、抗cd3療法、抗磷脂綜合癥、抗受體過敏性反應(yīng)、主動脈瘤和周圍動脈瘤、主動脈剝離、動脈高壓、動脈硬化、動靜脈瘺、共濟失調(diào)、心房顫動(持續(xù)性或陣發(fā)性)、心房撲動、房室傳導(dǎo)阻滯、B細胞淋巴瘤、骨移植排斥反應(yīng)、骨髓移植(BMT)排斥反應(yīng)、房室束支傳導(dǎo)阻滯、伯基特氏淋巴瘤、燒傷、心律不整、心肌頓抑綜合癥、心臟腫瘤、心肌病、心肺旁路炎癥反應(yīng)、軟骨移植物排斥反應(yīng)、小腦皮質(zhì)退化、小腦功能失調(diào)、紊亂性或多灶性房性心動過速、化療相關(guān)性病癥、慢性髓細胞白血病(CML)、慢性酒精中毒、慢性炎性病理過程、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、慢性阻塞性肺病(COPD)、慢性水楊酸中毒、結(jié)直腸癌、充血性心臟衰竭、結(jié)膜炎、接觸性皮炎、肺源性心臟病、冠狀動脈疾病、克雅二氏病(Creutzfeldt-Jakobdisease)、培養(yǎng)陰性敗血癥、囊性纖維化、細胞因子療法相關(guān)性病癥、拳擊手癡呆、脫髓鞘疾病、登革出血熱、皮炎、皮膚病狀、糖尿病(diabete)、糖尿病(diabetesmellitus)、糖尿病性動脈粥樣硬化病、彌漫性萊維小體病、擴張性充血性心肌病、基底神經(jīng)節(jié)病癥、中年唐氏綜合癥(Down'sSyndromeinmiddleage)、由阻斷CNS多巴胺受體的藥物誘發(fā)的藥物誘發(fā)性運動障礙、藥物敏感、濕疹、腦脊髓炎、心內(nèi)膜炎、內(nèi)分泌病、會厭炎、愛潑斯坦-巴爾病毒感染(epstein-barrvirusinfection)、紅斑性肢痛癥、錐體束外和小腦病癥、家族性嗜血細胞性淋巴組織細胞增生癥、胚胎胸腺移植排斥反應(yīng)、弗立特里希氏共濟失調(diào)(Friedreich'sataxia)、功能性周圍動脈病癥、真菌性敗血癥、氣性壞疽、胃潰瘍、腎小球腎炎、任何器官或組織的移植物排斥反應(yīng)、革蘭氏陰性敗血癥、革蘭氏陽性敗血癥、由細胞內(nèi)生物體引起的肉芽腫、毛細胞白血病、哈-斯二氏病(Hallerrorden-Spatzdisease)、橋本氏甲狀腺炎、枯草熱、心臟移植排斥反應(yīng)、血色素沉著病、血滲析、溶血尿毒癥綜合癥/血栓性血小板減少性紫癜、出血、肝炎(甲型)、希氏束心律不整(Hisbundlearrythmia)、HIV感染/HIV神經(jīng)病、霍奇金氏病、高動力性運動障礙、過敏反應(yīng)、過敏性肺炎、高血壓、低動力性運動障礙、下丘腦-垂體-腎上腺軸評價、idiopathicAddison'sdisease、特發(fā)性肺纖維化、抗體介導(dǎo)的細胞毒性、虛弱、嬰兒型脊髓性肌肉萎縮癥、主動脈炎癥、a型流感、電離輻射曝露、虹膜睫狀體炎/葡萄膜炎/視神經(jīng)炎、缺血性再灌注損傷、缺血性中風(fēng)、青少年類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、青少年脊髓性肌肉萎縮癥、卡波西氏肉瘤(Kaposi'ssarcoma)、腎移植排斥反應(yīng)、軍團桿菌病、利什曼病、麻風(fēng)病、皮質(zhì)脊髓系統(tǒng)病變、脂肪水腫、肝移植排斥反應(yīng)、淋巴水腫、瘧疾、惡性淋巴瘤、惡性組織細胞增多癥、惡性黑素瘤、腦膜炎、腦膜炎球菌血癥、代謝/特發(fā)性偏頭痛、線粒體多系統(tǒng)病癥、混合型結(jié)締組織疾病、單克隆丙種球蛋白病、多發(fā)性骨髓瘤、多系統(tǒng)退化(MencelDejerine-ThomasShi-Drager及Machado-Joseph)、重癥肌無力、胞內(nèi)鳥型結(jié)核分枝桿菌病、結(jié)核分枝桿菌感染、骨髓增生異常綜合癥、心肌梗塞、心肌缺血病癥、鼻咽癌、新生兒慢性肺病、腎炎、腎病、神經(jīng)退行性疾病、神經(jīng)源性I型肌萎縮、嗜中性白血球低下性發(fā)熱、非霍奇金氏淋巴瘤、腹部主動脈及其分支阻塞、動脈阻塞性病癥、okt3療法、睪丸炎/副睪丸炎、睪丸炎/輸精管切除逆轉(zhuǎn)術(shù)、臟器腫大、骨質(zhì)疏松癥、胰臟移植排斥反應(yīng)、胰腺癌、副腫瘤綜合癥/惡性高鈣血癥、甲狀旁腺移植排斥反應(yīng)、盆腔炎性疾病、常年性鼻炎、心包疾病、周圍動脈硬化疾病、周圍血管病癥、腹膜炎、惡性貧血、卡氏肺囊蟲肺炎、肺炎、POEMS綜合癥(多發(fā)性神經(jīng)病、臟器腫大、內(nèi)分泌病、單克隆丙種球蛋白病及皮膚改變綜合癥)、灌注后綜合癥、泵后綜合癥、MI心切開術(shù)后綜合癥、先兆子癇、進行性核上性麻痹、原發(fā)性肺高壓、放射療法、雷諾氏現(xiàn)象和疾病(Raynaud'sphenomenonanddisease)、雷諾氏病、雷弗素姆氏病(Refsum'sdisease)、規(guī)律性窄QRS波群心動過速、腎血管性高血壓、再灌注損傷、限制型心肌病、肉瘤、硬皮病、老年性舞蹈病、萊維小體型老年癡呆、血清反應(yīng)陰性關(guān)節(jié)病、休克、鐮刀細胞貧血、皮膚同種異體移植物排斥反應(yīng)、皮膚改變綜合癥、小腸移植排斥反應(yīng)、實體腫瘤、特異性心律失常、脊髓性共濟失調(diào)、脊髓小腦退化、鏈球菌肌炎、小腦結(jié)構(gòu)損害、亞急性硬化性全腦炎、暈厥、心血管系統(tǒng)梅毒、全身性過敏反應(yīng)、全身炎性反應(yīng)綜合癥、全身發(fā)作性青少年類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、T細胞或FABALL、毛細管擴張、血栓閉塞性脈管炎、血小板減少癥、中毒、移植、外傷/出血、III型過敏反應(yīng)、IV型過敏反應(yīng)、不穩(wěn)定型心絞痛、尿毒癥、尿膿毒病、蕁麻疹、心臟瓣膜病、靜脈曲張、脈管炎、靜脈疾病、靜脈血栓、心室纖顫、病毒和真菌感染、病毒性腦炎/無菌性腦膜炎、病毒相關(guān)嗜血細胞綜合癥、維-柯二氏綜合癥(Wernicke-Korsakoffsyndrome)、威爾遜氏病(Wilson'sdisease)、任何器官或組織的異種移植排斥反應(yīng)。在另一方面，本發(fā)明提供一種治療罹患病癥的患者的方法，所述方法包括以下步驟：在施用如以上所論述的第二藥劑之前、同時或之后施用以上公開的任一種結(jié)合蛋白。在一個優(yōu)選實施方案中，第二藥劑選自由以下組成的組：布替耐德(budenoside)；表皮生長因子；皮質(zhì)類固醇；環(huán)孢菌素；柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)；氨基水楊酸鹽；6-巰基嘌呤；硫唑嘌呤(azathioprine)；甲硝噠唑(metronidazole)；脂肪加氧酶抑制劑；美沙拉嗪(mesalamine)；奧沙拉嗪(olsalazine)；巴柳氮(balsalazide)；抗氧化劑；血栓素(thromboxane)抑制劑；IL-1受體拮抗劑；抗IL-1β單克隆抗體；抗IL-6單克隆抗體；生長因子；彈性蛋白酶抑制劑；吡啶基-咪唑化合物；TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-18、IL-23、EMAP-II、GM-CSF、FGF及PDGF的抗體或激動劑；CD2、CD3、CD4、CD8、CD-19、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD90或其配體的抗體；甲氨蝶呤；環(huán)孢菌素；FK506；雷帕霉素；霉酚酸嗎啉乙酯(mycophenolatemofetil)；來氟米特(leflunomide)；NSAID；布洛芬(ibuprofen)；皮質(zhì)類固醇；潑尼松龍(prednisolone)；磷酸二酯酶抑制劑；腺苷激動劑；抗血栓劑；補體抑制劑；腎上腺素能藥劑；IRAK、NIK、IKK、p38、MAP激酶抑制劑；IL-1β轉(zhuǎn)化酶抑制劑；TNFα轉(zhuǎn)化酶抑制劑；T細胞信號傳導(dǎo)抑制劑；金屬蛋白酶抑制劑；柳氮磺胺吡啶；硫唑嘌呤；6-巰基嘌呤；血管收縮素轉(zhuǎn)化酶抑制劑；可溶性細胞因子受體；可溶性p55TNF受體；可溶性p75TNF受體；sIL-1RI；sIL-1RII；sIL-6R；抗炎細胞因子；IL-4；IL-10；IL-11；IL-13；及TGFβ。在一個實施方案中，以上公開的藥物組合物是通過至少一種選自以下的模式施用給受試者：胃腸外、皮下、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、支氣管內(nèi)、腹內(nèi)、囊內(nèi)、軟骨內(nèi)、腔內(nèi)、體腔內(nèi)(intracelial)、小腦內(nèi)、腦室內(nèi)、結(jié)腸內(nèi)、子宮頸內(nèi)、胃內(nèi)、肝內(nèi)、心肌內(nèi)、骨內(nèi)、骨盆內(nèi)、心包內(nèi)、腹膜內(nèi)、胸膜內(nèi)、前列腺內(nèi)、肺內(nèi)、直腸內(nèi)、腎內(nèi)、視網(wǎng)膜內(nèi)、脊椎內(nèi)、滑膜內(nèi)、胸腔內(nèi)、子宮內(nèi)、膀胱內(nèi)、快速注射、經(jīng)陰道、經(jīng)直腸、經(jīng)頰、舌下、鼻內(nèi)及透皮施用。本發(fā)明一方面提供針對至少一種本發(fā)明的結(jié)合蛋白的至少一種抗個體基因型抗體?？箓€體基因型抗體包括任何蛋白質(zhì)或肽，所述蛋白質(zhì)或肽含有包含可以并入本發(fā)明的結(jié)合蛋白中的免疫球蛋白分子的至少一部分的分子，所述至少一部分如但不限于，重鏈或輕鏈的至少一個互補決定區(qū)(CDR)或其配體結(jié)合部分、重鏈或輕鏈可變區(qū)、重鏈或輕鏈恒定區(qū)、框架區(qū)或其任何部分。在另一實施方案中，本發(fā)明的結(jié)合蛋白能夠結(jié)合選自由以下組成的組的一個或多個靶標(biāo)：ABCF1；ACVR1；ACVR1B；ACVR2；ACVR2B；ACVRL1；ADORA2A；Aggrecan；AGR2；AICDA；AIF1；AIG1；AKAP1；AKAP2；AMH；AMHR2；ANGPT1；ANGPT2；ANGPTL3；ANGPTL4；ANPEP；APC；APOC1；AR；AZGP1(鋅-a-糖蛋白)；B7.1；B7.2；BAD；BAFF；BAG1；BAI1；BCL2；BCL6；BDNF；BLNK；BLR1(MDR15)；BlyS；BMP1；BMP2；BMP3B(GDF10)；BMP4；BMP6；BMP8；BMPR1A；BMPR1B；BMPR2；BPAG1(網(wǎng)格蛋白)；BRCA1；C19orf10(IL27w)；C3；C4A；C5；C5R1；CANT1；CASP1；CASP4；CAV1；CCBP2(D6/JAB61)；CCL1(I-309)；CCL11(嗜酸性粒細胞趨化因子)；CCL13(MCP-4)；CCL15(MIP-1d)；CCL16(HCC-4)；CCL17(TARC)；CCL18(PARC)；CCL19(MIP-3b)；CCL2(MCP-1)；MCAF；CCL20(MIP-3a)；CCL21(MIP-2)；SLC；非淋巴細胞趨化因子-2；CCL22(MDC/STC-1)；CCL23(MPIF-1)；CCL24(MPIF-2/嗜酸性粒細胞趨化因子-2)；CCL25(TECK)；CCL26(嗜酸性粒細胞趨化因子-3)；CCL27(CTACK/ILC)；CCL28；CCL3(MIP-1a)；CCL4(MIP-1b)；CCL5(RANTES)；CCL7(MCP-3)；CCL8(mcp-2)；CCNA1；CCNA2；CCND1；CCNE1；CCNE2；CCR1(CKR1/HM145)；CCR2(mcp-1RB/RA)；CCR3(CKR3/CMKBR3)；CCR4；CCR5(CMKBR5/ChemR13)；CCR6(CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6)；CCR7(CKR7/EBI1)；CCR8(CMKBR8/TER1/CKR-L1)；CCR9(GPR-9-6)；CCRL1(VSHK1)；CCRL2(L-CCR)；CD164；CD19；CD1C；CD20；CD200；CD-22；CD24；CD28；CD3；CD37；CD38；CD3E；CD3G；CD3Z；CD4；CD40；CD40L；CD44；CD45RB；CD47、CD48、CD52；CD69；CD70、CD72；CD74；CD79A；CD79B；CD8；CD80；CD81；CD83；CD86；CD137、CD138、B7-1、B7-2、ICOSL、B7-H3、B7-H4、CD137L、OX40L、CDH1(E-鈣粘著蛋白)；CDH10；CDH12；CDH13；CDH18；CDH19；CDH20；CDH5；CDH7；CDH8；CDH9；CDK2；CDK3；CDK4；CDK5；CDK6；CDK7；CDK9；CDKN1A(p21Wap1/Cip1)；CDKN1B(p27Kip1)；CDKN1C；CDKN2A(p16INK4a)；CDKN2B；CDKN2C；CDKN3；CEBPB；CER1；CHGA；CHGB；殼多糖酶；CHST10；CKLFSF2；CKLFSF3；CKLFSF4；CKLFSF5；CKLFSF6；CKLFSF7；CKLFSF8；CLDN3；CLDN7(封閉素-7)；CLN3；CLU(聚集素蛋白)；CMKLR1；CMKOR1(RDC1)；CNR1；COL18A1；COL1A1；COL4A3；COL6A1；CR2；CRP；CSF1(M-CSF)；CSF2(GM-CSF)；CSF3(GCSF)；CTLA-4；CTNNB1(b-鏈蛋白)；CTSB(組織蛋白酶B)；CX3CL1(SCYD1)；CX3CR1(V28)；CXCL1(GRO1)；CXCL10(IP-10)；CXCL11(I-TAC/IP-9)；CXCL12(SDF1)；CXCL13；CXCL14；CXCL16；CXCL2(GRO2)；CXCL3(GRO3)；CXCL5(ENA-78/LIX)；CXCL6(GCP-2)；CXCL9(MIG)；CXCR3(GPR9/CKR-L2)；CXCR4；CXCR6(TYMSTR/STRL33/Bonzo)；CYB5；CYC1；CYSLTR1；DAB2IP；DES；DKFZp451J0118；DNCL1；DPP4；E2F1；ECGF1；EDG1；EFNA1；EFNA3；EFNB2；EGF；EGFR；ELAC2；ENG；ENO1；ENO2；ENO3；EPHB4；EPO；ERBB2(Her-2)；EREG；ERK8；ESR1；ESR2；F3(TF)；FADD；FasL；FASN；FCER1A；FCER2；FCGR3A；FGF；FGF1(aFGF)；FGF10；FGF11；FGF12；FGF12B；FGF13；FGF14；FGF16；FGF17；FGF18；FGF19；FGF2(bFGF)；FGF20；FGF21；FGF22；FGF23；FGF3(int-2)；FGF4(HST)；FGF5；FGF6(HST-2)；FGF7(KGF)；FGF8；FGF9；FGFR3；FIGF(VEGFD)；FIL1(EPSILON)；FIL1(ZETA)；FLJ12584；FLJ25530；FLRT1(纖連蛋白)；FLT1；FOS；FOSL1(FRA-1)；FY(DARC)；GABRP(GABAa)；GAGEB1；GAGEC1；GALNAC4S-6ST；GATA3；GDF5；GFI1；GGT1；GM-CSF；GNAS1；GNRH1；GPR2(CCR10)；GPR31；GPR44；GPR81(FKSG80)；GRCC10(C10)；GRP；GSN(凝溶膠蛋白)；GSTP1；HAVCR2；HDAC4；HDAC5；HDAC7A；HDAC9；HGF；HIF1A；HIP1；組胺和組胺受體；HLA-A；HLA-DRA；HM74；HMOX1；HUMCYT2A；ICEBERG；ICOSL；ID2；IFN-a；IFNA1；IFNA2；IFNA4；IFNA5；IFNA6；IFNA7；IFNB1；IFNγ；IFNW1；IGBP1；IGF1；IGF1R；IGF2；IGFBP2；IGFBP3；IGFBP6；IL-1；IL10；IL10RA；IL10RB；IL11；IL11RA；IL-12；IL12A；IL12B；IL12RB1；IL12RB2；IL13；IL13RA1；IL13RA2；IL14；IL15；IL15RA；IL16；IL17；IL17B；IL17C；IL17R；IL18；IL18BP；IL18R1；IL18RAP；IL19；IL1A；IL1B；IL1F10；IL1F5；IL1F6；IL1F7；IL1F8；IL1F9；IL1HY1；IL1R1；IL1R2；IL1RAP；IL1RAPL1；IL1RAPL2；IL1RL1；IL1RL2IL1RN；IL2；IL20；IL20RA；IL21R；IL22；IL22R；IL22RA2；IL23；IL24；IL25；IL26；IL27；IL28A；IL28B；IL29；IL2RA；IL2RB；IL2RG；IL3；IL30；IL3RA；IL4；IL4R；IL5；IL5RA；IL6；IL6R；IL6ST(糖蛋白130)；IL7；IL7R；IL8；IL8RA；IL8RB；IL8RB；IL9；IL9R；ILK；INHA；INHBA；INSL3；INSL4；IRAK1；IRAK2；ITGA1；ITGA2；ITGA3；ITGA6(a6整合素)；ITGAV；ITGB3；ITGB4(b4整合素)；JAG1；JAK1；JAK3；JUN；K6HF；KAI1；KDR；KITLG；KLF5(GCBoxBP)；KLF6；KLK10；KLK12；KLK13；KLK14；KLK15；KLK3；KLK4；KLK5；KLK6；KLK9；KRT1；KRT19(角蛋白19)；KRT2A；KRTHB6(毛發(fā)特異性II型角蛋白)；LAMA5；LEP(瘦素)；Lingo-p75；Lingo-Troy；LPS；LTA(TNF-b)；LTB；LTB4R(GPR16)；LTB4R2；LTBR；MACMARCKS；MAG或Omgp；MAP2K7(c-Jun)；MDK；MIB1；中期因子；MIF；MIP-2；MKI67(Ki-67)；MMP2；MMP9；MS4A1；MSMB；MT3(金屬硫蛋白-III)；MTSS1；MUC1(粘蛋白)；MYC；MYD88；NCK2；神經(jīng)粘蛋白；NFKB1；NFKB2；NGFB(NGF)；NGFR；NgR-Lingo；NgR-Nogo66(Nogo)；NgR-p75；NgR-Troy；NME1(NM23A)；NOX5；NPPB；NR0B1；NR0B2；NR1D1；NR1D2；NR1H2；NR1H3；NR1H4；NR1I2；NR1I3；NR2C1；NR2C2；NR2E1；NR2E3；NR2F1；NR2F2；NR2F6；NR3C1；NR3C2；NR4A1；NR4A2；NR4A3；NR5A1；NR5A2；NR6A1；NRP1；NRP2；NT5E；NTN4；ODZ1；OPRD1；PCSK9；P2RX7；PAP；PART1；PATE；PAWR；PCA3；PCNA；PD-1；PD-L1；α4β7、OX40、GITR、TIM-3、Lag-3、B7-H3、B7-H4、GDF8、CGRP、Lingo-1、因子IXa、因子X、ICOS、GARP、BTLA、CD160、ROR1、2B4、KIR、CD27、OX40、CD40L、A2aR、PDGFA；PDGFB；PECAM1；PF4(CXCL4)；PGF；PGR；磷酸粘蛋白；PIAS2；PIK3CG；PLAU(uPA)；PLG；PLXDC1；PPBP(CXCL7)；PPID；PR1；PRKCQ；PRKD1；PRL；PROC；PROK2；PSAP；PSCA；PTAFR；PTEN；PTGS2(COX-2)；PTN；RAC2(p21Rac2)；RARB；RGS1；RGS13；RGS3；RNF110(ZNF144)；ROBO2；S100A2；SCGB1D2(親脂性蛋白B)；SCGB2A1(乳腺珠蛋白2)；SCGB2A2(乳腺珠蛋白1)；SCYE1(內(nèi)皮單核細胞活化性細胞因子)；SDF2；SERPINA1；SERPINA3；SERPINB5(姜黃素)；SERPINE1(PAI-1)；SERPINF1；SHBG；SLA2；SLC2A2；SLC33A1；SLC43A1；SLIT2；SPP1；SPRR1B(Spr1)；ST6GAL1；STAB1；STAT6；STEAP；STEAP2；TB4R2；TBX21；TCP10；TDGF1；TEK；TGFA；TGFB1；TGFB1I1；TGFB2；TGFB3；TGFBI；TGFBR1；TGFBR2；TGFBR3；TH1L；THBS1(凝血栓蛋白-1)；THBS2；THBS4；THPO；TIE(Tie-1)；TIMP3；組織因子；TLR10；TLR2；TLR3；TLR4；TLR5；TLR6；TLR7；TLR8；TLR9；TNF；TNF-a；TNFAIP2(B94)；TNFAIP3；TNFRSF11A；TNFRSF1A；TNFRSF1B；TNFRSF21；TNFRSF5；TNFRSF6(Fas)；TNFRSF7；TNFRSF8；TNFRSF9；TNFSF10(TRAIL)；TNFSF11(TRANCE)；TNFSF12(APO3L)；TNFSF13(April)；TNFSF13B；TNFSF14(HVEM-L)；TNFSF15(VEGI)；TNFSF18；TNFSF4(OX40配體)；TNFSF5(CD40配體)；TNFSF6(FasL)；TNFSF7(CD27配體)；TNFSF8(CD30配體)；TNFSF9(4-1BB配體)；TOLLIP；Toll樣受體；TOP2A(拓撲異構(gòu)酶Iia)；TP53；TPM1；TPM2；TRADD；TRAF1；TRAF2；TRAF3；TRAF4；TRAF5；TRAF6；TREM1；TREM2；TRPC6；TSLP；TWEAK；VEGF；VEGFB；VEGFC；多功能蛋白聚糖；VHLC5；VLA-4；XCL1(淋巴細胞趨化因子)；XCL2(SCM-1b)；XCR1(GPR5/CCXCR1)；YY1；及ZFPM2?？紤]到本發(fā)明的結(jié)合蛋白能夠結(jié)合兩個或更多個抗原，故其可以用于使用常規(guī)免疫測定法，如酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)、放射免疫測定法(RIA)或組織免疫組織化學(xué)法來檢測抗原(例如，在生物樣本，如血清或血漿中)。FIT-Ig直接或間接用可檢測物質(zhì)標(biāo)記以利于檢測結(jié)合或未結(jié)合的抗體。適合的可檢測物質(zhì)包括各種酶、輔基、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)及放射性物質(zhì)。適合的酶的實例包括辣根過氧化酶、堿性磷酸酶、*-半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶；適合的輔基復(fù)合物的實例包括抗生蛋白鏈菌素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；適合熒光物質(zhì)的實例包括傘形酮(umbelliferone)、熒光素、異硫氰酸熒光素、若丹明、二氯三嗪基胺熒光素、丹磺酰氯或藻紅素；發(fā)光物質(zhì)的實例包括魯米諾(luminol)；并且適合的放射性物質(zhì)的實例包括3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho或153Sm。在一個實施方案中，本發(fā)明的結(jié)合蛋白能夠在體外和體內(nèi)中和抗原的活性。因此，所述FIT-Ig可以用于抑制例如含有抗原的細胞培養(yǎng)物中、人受試者中或具有與本發(fā)明的結(jié)合蛋白交叉反應(yīng)的抗原的其它哺乳動物受試者中的抗原活性。在另一實施方案中，本發(fā)明提供一種用于降低罹患其中抗原活性是有害的疾病或病癥的受試者的抗原活性的方法。本發(fā)明的結(jié)合蛋白可以被施用給人受試者用于治療目的。如本文所用，術(shù)語“其中抗原活性是有害的病癥”意圖包括其中在罹患病癥的受試者中抗原的存在已顯示出或懷疑會造成病癥的病理生理學(xué)或是促成病癥惡化的因素的疾病和其它病癥。因此，其中抗原活性是有害的病癥是其中預(yù)期降低抗原活性會減輕病癥的癥狀和/或發(fā)展的病癥。此類病癥可以例如通過罹患所述病癥的受試者的生物流體中抗原濃度增加(例如受試者的血清、血漿、滑液等中的抗原濃度增加)來證實?？梢杂帽景l(fā)明的結(jié)合蛋白治療的病癥的非限制性實例包括以下及關(guān)于本發(fā)明的抗體的藥物組合物的章節(jié)中所論述的那些病癥。本發(fā)明的FIT-Ig可以結(jié)合一種抗原或多種抗原。這些抗原包括但不限于，以下數(shù)據(jù)庫中所列的靶標(biāo)，這些數(shù)據(jù)庫是以引用的方式并入本文中。這些靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫包括但不限于，以下清單：●治療性靶標(biāo)(http://xin.cz3.nus.edu.sg/group/cjttd/ttd.asp)；●細胞因子和細胞因子受體(http://www.cytokinewebfacts.com/,http://www.copewithcytokines.de/cope.cgi，及●http://cmbi.bjmu.edu.cn/cmbidata/cgf/CGF_Database/cytokine.medic.kumamoto-u.ac.jp/CFC/indexR.html)；●趨化因子(http://cytokine.medic.kumamoto-u.ac.jp/CFC/CK/Chemokine.html)；●趨化因子受體和GPCR(http://csp.medic.kumamoto-u.ac.jp/CSP/Receptor.html/http://www.gpcr.org/7tm/)；●嗅覺受體(http://senselab.med.yale.edu/senselab/ORDB/default.asp)；●受體(http://www.iuphar-db.org/iuphar-rd/list/index.htm)；●癌癥靶標(biāo)(http://cged.hgc.jp/cgi-bin/input.cgi)；●作為潛在抗體靶標(biāo)的分泌蛋白質(zhì)(http://spd.cbi.pku.edu.cn/)；●蛋白激酶(http://spd.cbi.pku.edu.cn/)，及●人CD標(biāo)記物(http://content.labvelocity.com/tools/6/1226/CD_table_final_locked.pdf)和(ZolaH,2005CDmolecules2005:humancelldifferentiationmoleculesBlood,106:3123-6)。FIT-Ig可用作治療劑以同時阻斷兩種不同靶標(biāo)來增強功效/安全性和/或增加患者適用范圍。所述靶標(biāo)可以包括可溶性靶標(biāo)(IL-13和TNF)和細胞表面受體靶標(biāo)(VEGFR和EGFR)。它也可以用于誘導(dǎo)針對癌癥療法的腫瘤細胞與T細胞(Her2和CD3)之間，或針對自體免疫/移植的自體反應(yīng)性細胞與效應(yīng)細胞之間，或任何靶標(biāo)細胞與效應(yīng)細胞之間的細胞毒性再定向，以消除任何給定疾病中的致病細胞。此外，當(dāng)FIT-Ig被設(shè)計用于靶向同一受體上的兩個不同表位時，其還可以用于觸發(fā)受體聚集和活化。這可能在制備激動性和拮抗性抗GPCR治療劑方面具有益處。在這一情況下，可以使用FIT-Ig靶向一個細胞上的兩個不同表位以進行聚集/信號傳導(dǎo)(兩個細胞表面分子)或信號傳導(dǎo)(在一個分子上)。類似地，F(xiàn)IT-Ig分子可以被設(shè)計成通過靶向CTLA-4細胞外結(jié)構(gòu)域的兩個不同表位(或同一表位的2個拷貝)來觸發(fā)CTLA-4連接和負信號，從而引起免疫反應(yīng)下調(diào)。CTLA-4是在臨床上得到驗證的用于治療性治療多種免疫病癥的靶標(biāo)。CTLA-4/B7相互作用通過削弱細胞周期進程、IL-2產(chǎn)生及活化后T細胞的增殖來負面地調(diào)控T細胞活化，并且CTLA-4(CD152)接合可以下調(diào)T細胞活化并促進誘導(dǎo)免疫耐受性。然而，通過激動性抗體接合CTLA-4來削弱T細胞活化的策略由于CTLA-4活化需要連接而不成功。如通過晶體結(jié)構(gòu)分析所證實，CTLA-4/B7的分子相互作用呈“歪斜拉鏈(skewedzipper)”陣列(Stamper2001Nature410:608)。然而，目前可用的CTLA-4結(jié)合試劑都不具有連接特性，包括抗CTLA-4單克隆抗體。已作出若干嘗試來解決此問題。在一種情況中，產(chǎn)生了細胞成員結(jié)合的單鏈抗體，并且顯著抑制小鼠中的同種異體排斥反應(yīng)(Hwang2002JI169:633)。在另一情況中，產(chǎn)生了針對CTLA-4的人工APC表面連接的單鏈抗體并證實可削弱T細胞反應(yīng)(Griffin2000JI164:4433)。在兩種情況中，通過人工系統(tǒng)中緊密定位的成員結(jié)合的抗體來達成CTLA-4連接。盡管這些實驗提供了通過觸發(fā)CTLA-4負性信號傳導(dǎo)來免疫下調(diào)的概念驗證(proof-of-concept)，但這些報導(dǎo)中所用的試劑不適于治療用途。為此，可以通過使用靶向CTLA-4細胞外結(jié)構(gòu)域的兩個不同表位(或同一表位的2個拷貝)的FIT-Ig分子來達成CTLA-4連接?；驹硎菣M跨IgG的兩個結(jié)合位點的約的距離對于CTLA-4的活性連接(2個CTLA-4均二聚體之間是)而言過大。不過，F(xiàn)IT-Ig(一個臂)上的兩個結(jié)合位點之間的距離要短得多，也在范圍內(nèi)，從而允許CTLA-4的適當(dāng)連接。類似地，F(xiàn)IT-Ig可以靶向細胞表面受體復(fù)合物的兩個不同成員(例如IL-12Rα和β)。此外，F(xiàn)IT-Ig還可以靶向CR1和可溶性蛋白/病原體以驅(qū)動靶標(biāo)可溶性蛋白/病原體的快速清除。另外，本發(fā)明的FIT-Ig可以用于組織特異性遞送(靶向組織標(biāo)記物和疾病介體以增強局部PK，因此達成較高功效和/或較低毒性)，包括細胞內(nèi)遞送(靶向內(nèi)化受體和細胞內(nèi)分子)、遞送到大腦內(nèi)部(靶向轉(zhuǎn)鐵蛋白受體和CNS疾病介體以穿過血腦屏障)。FIT-Ig還可以充當(dāng)載體蛋白，經(jīng)由結(jié)合至抗原的非中和性表位而將所述抗原遞送到特定位置以及還增加所述抗原的半衰期。此外，F(xiàn)IT-Ig可以被設(shè)計成以物理方式連接至植入患者體內(nèi)的醫(yī)療裝置或靶向這些醫(yī)療裝置(Burke,SandraE.；Kuntz,RichardE.；Schwartz,LewisB。Zotarolimus(ABT-578)elutingstents.AdvancedDrugDeliveryReviews(2006),58(3),437-446.；Surfacecoatingsforbiologicalactivationandfunctionalizationofmedicaldevices.Hildebrand,H.F.；Blanchemain,N.；Mayer,G.；Chai,F.；Lefebvre,M.；Boschin,F.SurfaceandCoatingsTechnology(2006),200(22-23),6318-6324.；Drug/devicecombinationsforlocaldrugtherapiesandinfectionprophylaxis.Wu,Peng；Grainger,DavidW.Biomaterials(2006),27(11),2450-2467.；Mediationofthecytokinenetworkintheimplantationoforthopedicdevices.Marques,A.P.；Hunt,J.A.；Reis,RuiL.BiodegradableSystemsinTissueEngineeringandRegenerativeMedicine(2005),377-397；第52頁Mediationofthecytokinenetworkintheimplantationoforthopedicdevices.Marques,A.P.；Hunt,J.A.；Reis,RuiL.BiodegradableSystemsinTissueEngineeringandRegenerativeMedicine(2005),377-397。)簡單地說，將適當(dāng)類型的細胞引導(dǎo)到醫(yī)學(xué)植入物的位置可以促進正常組織功能治愈和恢復(fù)?；蛘撸餐ㄟ^與裝置耦接或靶向裝置的FIT-Ig來抑制在裝置植入后釋放的介體(包括但不限于，細胞因子)。舉例來說，多年來，支架已被用于介入心臟病學(xué)中以清理阻塞的動脈以及改善血液向心肌的流動。然而，已知傳統(tǒng)的裸金屬支架在一些患者中會導(dǎo)致再狹窄(使治療區(qū)域中的動脈再變窄)并且會產(chǎn)生血塊。近來，已描述用抗CD34抗體涂布的支架，所述支架通過捕集在整個血液中循環(huán)的內(nèi)皮祖細胞(EPC)來減少再狹窄并防止出現(xiàn)血塊。內(nèi)皮細胞是內(nèi)襯于血管，從而允許血液平穩(wěn)流動的細胞。EPC粘附于支架的硬表面，形成光滑的層，其不僅促進治愈，而且還防止先前與使用支架相關(guān)的并發(fā)癥，即再狹窄和血塊(Aoji等,2005JAmCollCardiol.45(10):1574-9)。除改善需要支架的患者的結(jié)果之外，對于需要心血管旁路手術(shù)的患者也具有意義。舉例來說，用抗EPC抗體涂布的人工血管(人工動脈)將消除對于使用來自患者腿或臂的動脈進行旁路手術(shù)移植的需求。這將減少手術(shù)和麻醉時間，而時間的減少又將減少冠狀動脈手術(shù)的死亡。FIT-Ig的設(shè)計方式應(yīng)使得其結(jié)合至細胞表面標(biāo)記物(如CD34)以及涂布于植入裝置上的蛋白質(zhì)(或任何種類的表位，包括但不限于脂質(zhì)和多糖)以促進細胞募集。此類方法一般也可以應(yīng)用于其它醫(yī)學(xué)植入物?；蛘撸梢詫IT-Ig涂布于醫(yī)療裝置上并且在植入裝置及從所述裝置釋放所有FIT(或可能需要其它新鮮FIT-Ig的任何其它需求，包括已裝載的FIT-Ig的老化和變性)后，所述裝置可以通過將新鮮的FIT-Ig全身性施用到患者來進行重新裝載，其中FIT-Ig被設(shè)計成通過一組結(jié)合位點結(jié)合至所關(guān)注靶標(biāo)(細胞因子、細胞表面標(biāo)記物(如CD34)等)并且通過另一組結(jié)合位點結(jié)合至裝置上涂布的靶標(biāo)(包括任何種類的蛋白質(zhì)、表位，包括但不限于脂質(zhì)、多糖及聚合物)。這一技術(shù)具有擴大經(jīng)過涂布的植入物的有用性的優(yōu)勢。本發(fā)明的FIT-Ig分子還可用作治療各種疾病的治療分子。這些FIT-Ig分子可以結(jié)合特定疾病中所涉及的一個或多個靶標(biāo)。各種疾病中此類靶標(biāo)的實例描述于下。全身自體免疫和炎性反應(yīng)涉及到許多蛋白質(zhì)，包括C5、CCL1(I-309)、CCL11(嗜酸性粒細胞趨化因子)、CCL13(mcp-4)、CCL15(MIP-1d)、CCL16(HCC-4)、CCL17(TARC)、CCL18(PARC)、CCL19、CCL2(mcp-1)、CCL20(MIP-3a)、CCL21(MIP-2)、CCL23(MPIF-1)、CCL24(MPIF-2/嗜酸性粒細胞趨化因子-2)、CCL25(TECK)、CCL26、CCL3(MIP-1a)、CCL4(MIP-1b)、CCL5(RANTES)、CCL7(mcp-3)、CCL8(mcp-2)、CXCL1、CXCL10(IP-10)、CXCL11(I-TAC/IP-9)、CXCL12(SDF1)、CXCL13、CXCL14、CXCL2、CXCL3、CXCL5(ENA-78/LIX)、CXCL6(GCP-2)、CXCL9、IL13、IL8、CCL13(mcp-4)、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CX3CR1、IL8RA、XCR1(CCXCR1)、IFNA2、IL10、IL13、IL17C、IL1A、IL1B、IL1F10、IL1F5、IL1F6、IL1F7、IL1F8、IL1F9、IL22、IL5、IL8、IL9、LTA、LTB、MIF、SCYE1(內(nèi)皮單核細胞活化性細胞因子)、SPP1、TNF、TNFSF5、IFNA2、IL10RA、IL10RB、IL13、IL13RA1、IL5RA、IL9、IL9R、ABCF1、BCL6、C3、C4A、CEBPB、CRP、ICEBERG、IL1R1、IL1RN、IL8RB、LTB4R、TOLLIP、FADD、IRAK1、IRAK2、MYD88、NCK2、TNFAIP3、TRADD、TRAF1、TRAF2、TRAF3、TRAF4、TRAF5、TRAF6、ACVR1、ACVR1B、ACVR2、ACVR2B、ACVRL1、CD28、CD3E、CD3G、CD3Z、CD69、CD80、CD86、CNR1、CTLA-4、CYSLTR1、FCER1A、FCER2、FCGR3A、GPR44、HAVCR2、OPRD1、P2RX7、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、BLR1、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL11、CCL13、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CX3CL1、CX3CR1、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCR4、GPR2、SCYE1、SDF2、XCL1、XCL2、XCR1、AMH、AMHR2、BMPR1A、BMPR1B、BMPR2、C19orf10(IL27w)、CER1、CSF1、CSF2、CSF3、DKFZp451J0118、FGF2、GFI1、IFNA1、IFNB1、IFNG、IGF1、IL1A、IL1B、IL1R1、IL1R2、IL2、IL2RA、IL2RB、IL2RG、IL3、IL4、IL4R、IL5、IL5RA、IL6、IL6R、IL6ST、IL7、IL8、IL8RA、IL8RB、IL9、IL9R、IL10、IL10RA、IL10RB、IL11、IL11RA、IL12A、IL12B、IL12RB1、IL12RB2、IL13、IL13RA1、IL13RA2、IL15、IL15RA、IL16、IL17、IL17R、IL18、IL18R1、IL19、IL20、KITLG、LEP、LTA、LTB、LTB4R、LTB4R2、LTBR、MIF、NPPB、PDGFB、TBX21、TDGF1、TGFA、TGFB1、TGFB1I1、TGFB2、TGFB3、TGFBI、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR3、TH1L、TNF、TNFRSF1A、TNFRSF1B、TNFRSF7、TNFRSF8、TNFRSF9、TNFRSF11A、TNFRSF21、TNFSF4、TNFSF5、TNFSF6、TNFSF11、VEGF、ZFPM2及RNF110(ZNF144)。同時涵蓋能夠結(jié)合以上所列的一個或多個靶標(biāo)的FIT-Ig。過敏性哮喘的特征在于存在嗜酸性粒細胞增多癥、杯狀細胞化生、上皮細胞變化、氣道過度反應(yīng)(AHR)及Th2和Th1細胞因子表達，以及血清IgE水平升高。現(xiàn)廣泛認可氣道炎癥是引起哮喘發(fā)病的潛在關(guān)鍵因素，涉及如T細胞、B細胞、嗜酸性粒細胞、肥大細胞及巨噬細胞等炎性細胞及其分泌介體(包括細胞因子和趨化因子)的復(fù)雜相互作用。皮質(zhì)類固醇是當(dāng)今針對哮喘的最重要的抗炎治療劑，不過其作用機制是非特異性的并且存在安全問題，尤其是在青少年患者群體中。因此，有必要開發(fā)更具特異性和靶向性的療法。越來越多的證據(jù)表明，IL-13在小鼠中模擬哮喘的許多特征，包括AHR、粘液分泌亢進及氣道纖維化，而與嗜酸細胞炎癥無關(guān)(Finotto等,InternationalImmunology(2005),17(8),993-1007；Padilla等,JournalofImmunology(2005),174(12),8097-8105)。IL-13在引起與哮喘相關(guān)的病理反應(yīng)中起到關(guān)鍵作用。開發(fā)抗IL-13單克隆抗體療法以降低IL-13在肺中的作用是一種激動人心的新方法，作為針對哮喘的新型治療，這一方法提供了廣闊前景。然而，除IL-13外，哮喘的發(fā)病機理中還涉及不同免疫路徑的其它介體，而阻斷這些介體可以提供另外的治療益處。所述靶標(biāo)對包括但不限于，IL-13和促炎性細胞因子，如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)。TNF-α可以增大哮喘的炎性反應(yīng)并且可能與疾病的嚴(yán)重程度有關(guān)(McDonnell等,ProgressinRespiratoryResearch(2001),31(NewDrugsforAsthma,AllergyandCOPD),247-250.)。這表明，同時阻斷IL-13和TNF-α可以具有有益作用，特別是在嚴(yán)重氣道疾病中。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的FIT-Ig結(jié)合靶標(biāo)IL-13和TNFα并且用于治療哮喘。其中可以同時評估炎癥與AHR的動物模型(如OVA誘發(fā)哮喘的小鼠模型)在本領(lǐng)域中是已知的并且可以用于測定各種FIT-Ig分子治療哮喘的能力。Coffman等,JournalofExperimentalMedicine(2005),201(12),1875-1879；Lloyd等,AdvancesinImmunology(2001),77,263-295；Boyce等,JournalofExperimentalMedicine(2005),201(12),1869-1873；及Snibson等,JournaloftheBritishSocietyforAllergyandClinicalImmunology(2005),35(2),146-52中公開了用于研究哮喘的動物模型。除對這些靶標(biāo)對的常規(guī)安全性評估外，還可能保證免疫抑制程度的特定測試并且這些測試有助于選擇最佳靶標(biāo)對(參見Luster等,Toxicology(1994),92(1-3),229-43；Descotes等,Developmentsinbiologicalstandardization(1992),7799-102；Hart等,JournalofAllergyandClinicalImmunology(2001),108(2),250-257)。基于以上公開的基本原理并使用相同的針對功效和安全性的評價模型，可以確定FIT-Ig分子能夠結(jié)合并且可用于治療哮喘的其它靶標(biāo)對。優(yōu)選地，此類靶標(biāo)包括但不限于，IL-13和IL-1β，因為IL-1β也牽涉到哮喘中的炎性反應(yīng)；IL-13及涉及炎癥的細胞因子和趨化因子，如IL-13和IL-9；IL-13和IL-4；IL-13和IL-5；IL-13和IL-25；IL-13和TARC；IL-13和MDC；IL-13和MIF；IL-13和TGF-β；IL-13和LHR激動劑；IL-13和CL25；IL-13和SPRR2a；IL-13和SPRR2b；及IL-13和ADAM8。本發(fā)明還涵蓋能夠結(jié)合哮喘中所涉及的一個或多個靶標(biāo)的FIT-Ig，所述靶標(biāo)選自由以下組成的組：CSF1(MCSF)、CSF2(GM-CSF)、CSF3(GCSF)、FGF2、IFNA1、IFNB1、IFNG、組胺和組胺受體、IL1A、IL1B、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、IL10、IL11、IL12A、IL12B、IL13、IL14、IL15、IL16、IL17、IL18、IL19、KITLG、PDGFB、IL2RA、IL4R、IL5RA、IL8RA、IL8RB、IL12RB1、IL12RB2、IL13RA1、IL13RA2、IL18R1、TSLP、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL8、CCL13、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL22、CCL24,CX3CL1、CXCL1、CXCL2、CXCL3、XCL1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CX3CR1、GPR2、XCR1、FOS、GATA3、JAK1、JAK3、STAT6、TBX21、TGFB1、TNFSF6、YY1、CYSLTR1、FCER1A、FCER2、LTB4R、TB4R2、LTBR及殼多糖酶。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是一種全身性疾病，其以關(guān)節(jié)滑膜中的慢性炎性反應(yīng)為特征并且與軟骨退化和關(guān)節(jié)旁骨骼侵蝕相關(guān)。許多促炎性細胞因子，包括TNF、趨化因子及生長因子，都在患病關(guān)節(jié)中有表達。經(jīng)顯示，將抗TNF抗體或sTNFR融合蛋白全身性施用到RA小鼠模型具有抗炎作用并且具有關(guān)節(jié)保護作用。有關(guān)通過靜脈內(nèi)施用英夫利昔單抗(infliximab；一種嵌合抗TNF單克隆抗體(mAB))阻斷RA患者體內(nèi)的TNF活性的臨床研究(HarrimanG,HarperLK,SchaibleTF.1999Summaryofclinicaltrialsinrheumatoidarthritisusinginfliximab,ananti-TNFalphatreatment.AnnRheumDis58增刊1:I61-4.)已證實，TNF調(diào)控IL-6、IL-8、MCP-1及VEGF的產(chǎn)生、免疫細胞和炎性細胞向關(guān)節(jié)的募集、血管生成以及基質(zhì)金屬蛋白酶-1和基質(zhì)金屬蛋白酶-3血液含量的降低。對于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中炎性路徑的更好了解使得鑒別出類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中所涉及的其它治療性靶標(biāo)。在過去的一年里，已經(jīng)通過隨機控制的試驗測試了多種頗具前景的治療，如白細胞介素-6拮抗劑(MRA)、CTLA4Ig(阿巴細普(abatacept)，GenoveseMc等,2005Abataceptforrheumatoidarthritisrefractorytotumornecrosisfactoralphainhibition.NEnglJMed.353:1114-23)及抗B細胞療法(利妥昔單抗，OkamotoH,KamataniN.2004Rituximabforrheumatoidarthritis.NEnglJMed.351:1909)。已鑒別出其它細胞因子并且經(jīng)顯示，這些細胞因子在動物模型中具有益處，包括白細胞介素-15、白細胞介素-17及白細胞介素-18，而且目前正在進行這些藥劑的臨床試驗。組合了抗TNF和另一介體的雙重特異性抗體療法在增強臨床功效和/或患者適用范圍方面具有巨大潛力。舉例來說，阻斷TNF與VEGF兩者可以潛在根除炎癥和血管生成，這兩者都涉及于RA的病理生理學(xué)。也涵蓋用特異性FIT-IgIg阻斷RA中所涉及的其它靶標(biāo)對，包括但不限于，TNF與IL-18；TNF與IL-12；TNF與IL-23；TNF與IL-1β；TNF與MIF；TNF與IL-17；以及TNF與IL-15。除針對這些靶標(biāo)對的常規(guī)安全性評估外，還可能保證針對免疫抑制程度的特定測試并且這些測試有助于選擇最佳靶標(biāo)對(參見Luster等,Toxicology(1994),92(1-3),229-43；Descotes等,Developmentsinbiologicalstandardization(1992),7799-102；Hart等,JournalofAllergyandClinicalImmunology(2001),108(2),250-257)。FIT-IgIg分子是否適用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎可以使用臨床前動物RA模型，如膠原蛋白誘發(fā)關(guān)節(jié)炎的小鼠模型進行評估。其它適用模型也是本領(lǐng)域中眾所周知的(參見BrandDD.,CompMed.(2005)55(2):114-22)。全身性紅斑狼瘡(SLE)的免疫致病性特點是多克隆B細胞活化，此導(dǎo)致高球蛋白血癥、自體抗體的產(chǎn)生及免疫復(fù)合物形成。主要異?？磥硎怯捎谌鞹細胞失調(diào)使得T細胞不能抑制被禁止的B細胞克隆。此外，若干細胞因子(如IL-10)以及共刺激分子(如CD40和CD40L、B7與CD28和CTLA-4)促進B細胞與T細胞的相互作用，由此引發(fā)第二信號。這些相互作用連同免疫復(fù)合物和細胞凋亡物質(zhì)的吞噬細胞清除作用削弱一起使免疫反應(yīng)得以保持并由此引起組織損傷。以下靶標(biāo)可能涉及SLE并且可能用于FIT-Ig治療干預(yù)方法中：B細胞靶向療法：CD-20、CD-22、CD-19、CD28、CD4、CD80、HLA-DRA、IL10、IL2、IL4、TNFRSF5、TNFRSF6、TNFSF5、TNFSF6、BLR1、HDAC4、HDAC5、HDAC7A、HDAC9、ICOSL、IGBP1、MS4A1、RGS1、SLA2、CD81、IFNB1、IL10、TNFRSF5、TNFRSF7、TNFSF5、AICDA、BLNK、GALNAC4S-6ST、HDAC4、HDAC5、HDAC7A、HDAC9、IL10、IL11、IL4、INHA、INHBA、KLF6、TNFRSF7、CD28、CD38、CD69、CD80、CD83、CD86、DPP4、FCER2、IL2RA、TNFRSF8、TNFSF7、CD24、CD37、CD40、CD72、CD74、CD79A、CD79B、CR2、IL1R2、ITGA2、ITGA3、MS4A1、ST6GAL1、CD1C、CHST10、HLA-A、HLA-DRA及NT5E；共刺激信號：CTLA-4或B7.1/B7.2；B細胞存活的抑制：BlyS、BAFF；補體失活：C5；細胞因子調(diào)節(jié)：關(guān)鍵原理是，任何組織中的凈生物反應(yīng)都是促炎性細胞因子與抗炎細胞因子的局部水平之間平衡的結(jié)果(參見SfikakisPP等,2005CurrOpinRheumatol17:550-7)。SLE被認為是血清IL-4、IL-6、IL-10被證明升高的一種由Th-2驅(qū)動的疾病。也涵蓋能夠結(jié)合選自由以下組成的組的一個或多個靶標(biāo)的FIT-IgIg：IL-4、IL-6、IL-10、IFN-a及TNF-a。以上論述的靶標(biāo)的組合將增強針對SLE的治療功效，這可以在許多狼瘡臨床前模型中進行測試(參見PengSL(2004)MethodsMolMed.；102:227-72)。多發(fā)性硬化(MS)是一種病因基本上未知的復(fù)雜人自體免疫性疾病。整個神經(jīng)系統(tǒng)中的髓磷脂堿性蛋白(MBP)的免疫破壞是多發(fā)性硬化的主要病理。MS是具有復(fù)雜病理的一種疾病，其涉及CD4+和CD8+T細胞的浸潤及中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的反應(yīng)。CNS中細胞因子、活性氮物質(zhì)及共刺激分子的表達都在MS中得到描述。主要的考慮因素是促成自體免疫性發(fā)生的免疫機制。具體來說，抗原表達、細胞因子與白細胞相互作用以及幫助平衡/調(diào)節(jié)其它T細胞(如Th1和Th2細胞)的調(diào)控性T細胞是治療性靶標(biāo)鑒別的重要方面。IL-12是由APC產(chǎn)生并促進Th1效應(yīng)細胞分化的一種促炎性細胞因子。IL-12是在MS患者的正在發(fā)展的病變中以及受EAE影響的動物中產(chǎn)生的。先前已顯示，干擾IL-12路徑在嚙齒動物中有效地防止EAE，并且使用抗IL-12mAb在體內(nèi)中和IL-12p40在髓磷脂誘發(fā)的普通狨猴EAE模型中具有有益作用。TWEAK是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中組成性表達的TNF家族的一員，取決于細胞類型而具有促炎性作用、增殖作用或細胞凋亡作用。其受體Fn14在CNS中是由內(nèi)皮細胞、反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元表達。在實驗性自體免疫性腦脊髓炎(EAE)期間，脊髓中TWEAK和Fn14mRNA的表達增加。當(dāng)在起始期(primingphase)之后治療小鼠時，在髓磷脂寡樹突神經(jīng)膠質(zhì)細胞糖蛋白(MOG)誘發(fā)的C57BL/6小鼠EAE中進行抗TWEAK抗體治療引起疾病嚴(yán)重程度的降低及白細胞浸潤的減少。本發(fā)明一方面涉及能夠結(jié)合一個或多個，優(yōu)選兩個選自由以下組成的組的靶標(biāo)的FIT-IgIg分子：IL-12、TWEAK、IL-23、CXCL13、CD40、CD40L、IL-18、VEGF、VLA-4、TNF、CD45RB、CD200、IFNγ、GM-CSF、FGF、C5、CD52及CCR2。優(yōu)選的實施方案包括作為對MS治療有益的治療劑的雙重特異性抗IL-12/TWEAKFIT-IgIg。本領(lǐng)域中已知用于評估FIT-Ig分子治療MS的適用性的若干動物模型(參見SteinmanL等,(2005)TrendsImmunol.26(11):565-71；LublinFD.等,(1985)SpringerSeminImmunopathol.8(3):197-208；GenainCP等,(1997)JMolMed.75(3):187-97；TuohyVK等,(1999)JExpMed.189(7):1033-42；OwensT等,(1995)NeurolClin.13(1):51-73；和'tHartBA等,(2005)JImmunol175(7):4761-8)。除針對這些靶標(biāo)對的常規(guī)安全性評估外，可能保證有關(guān)免疫抑制程度的特定測試并且這些測試有助于選擇最佳靶標(biāo)對(參見Luster等,Toxicology(1994),92(1-3),229-43；Descotes等,Developmentsinbiologicalstandardization(1992),7799-102；JonesR.2000Rovelizumab(ICOSCorp).IDrugs.3(4):442-6)。敗血癥的病理生理學(xué)是由革蘭氏陰性生物體(脂多糖[LPS]、脂質(zhì)A、內(nèi)毒素)與革蘭氏陽性生物體(脂磷壁酸、肽聚糖)的外膜組分引起。這些外膜組分能夠結(jié)合至單核細胞表面上的CD14受體。借助于近來描述的toll樣受體，隨后將信號傳輸給細胞，從而導(dǎo)致最終產(chǎn)生促炎性細胞因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素-1(IL-1)。勢不可擋的炎性反應(yīng)和免疫反應(yīng)是敗血性休克的主要特征并且在由敗血癥誘發(fā)的組織損傷、多器官衰竭及死亡的發(fā)病機制中起主要作用。經(jīng)顯示，細胞因子，尤其是腫瘤壞死因子(TNF)和白細胞介素(IL-1)是敗血性休克的關(guān)鍵介體。這些細胞因子對于組織具有直接毒性作用；它們還活化磷脂酶A2。這些和其它作用引起血小板活化因子的濃度增加，促進氧化氮合酶活性，促進嗜中性粒細胞的組織浸潤以及促進嗜中性粒細胞活性。敗血癥和敗血性休克的治療仍是臨床難題，而且最近使用針對炎性反應(yīng)的生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑(即，抗TNF、抗MIF)進行的前瞻性試驗僅顯示適度的臨床益處。近來，關(guān)注點已轉(zhuǎn)向旨在逆轉(zhuǎn)伴隨的免疫抑制期的療法。在實驗動物和垂?；颊咧羞M行的研究證實，淋巴器官和一些實質(zhì)組織中細胞凋亡增加促成此免疫抑制、無反應(yīng)性及器官系統(tǒng)功能障礙。在敗血癥綜合癥期間，由IL-2的不存在或糖皮質(zhì)激素、顆粒酶或所謂的‘死亡’細胞因子腫瘤壞死因子α或Fas配體的釋放可以觸發(fā)淋巴細胞凋亡。細胞凋亡經(jīng)由胞漿和/或線粒體半胱天蛋白酶(caspase)的自活化而繼續(xù)進行，這可能受到Bcl-2家族的促細胞凋亡成員和抗細胞凋亡成員影響。在實驗動物中，用細胞凋亡抑制劑治療不僅可以預(yù)防淋巴細胞的細胞凋亡；而且它還可以改善結(jié)果。盡管用抗細胞凋亡劑進行臨床試驗在很大程度上由于與其施用和組織靶向有關(guān)的技術(shù)難題而無法實現(xiàn)，但抑制淋巴細胞凋亡對于敗血癥患者而言是有吸引力的治療靶標(biāo)。同樣地，靶向炎性介體與細胞凋亡介體兩者的雙重特異性藥劑可以具有附加益處。本發(fā)明一方面涉及能夠結(jié)合敗血癥所涉及的選自由以下組成的組的一個或多個靶標(biāo)，優(yōu)選兩個靶標(biāo)的FIT-IgIg：TNF、IL-1、MIF、IL-6、IL-8、IL-18、IL-12、IL-23、FasL、LPS、Toll樣受體、TLR-4、組織因子、MIP-2、ADORA2A、CASP1、CASP4、IL10、IL1B、NFKB1、PROC、TNFRSF1A、CSF3、IL10、IL1B、IL6、ADORA2A、CCR3、IL10、IL1B、IL1RN、MIF、NFKB1、PTAFR、TLR2、TLR4、GPR44、HMOX1、中期因子、IRAK1、NFKB2、SERPINA1、SERPINE1及TREM1。此類FIT-IgIg對于敗血癥的功效可以在本領(lǐng)域中已知的臨床前動物模型中進行評估(參見BurasJA等(2005)NatRevDrugDiscov.4(10):854-65；及CalandraT等,(2000)NatMed.6(2):164-70)。慢性神經(jīng)退行性疾病通常是以神經(jīng)元功能進行性喪失(神經(jīng)元細胞死亡、脫髓鞘)、活動力喪失及記憶喪失為特征的年齡相關(guān)性疾病。有關(guān)慢性神經(jīng)退行性疾病(例如，阿爾茨海默氏病)潛在機制的新興認識顯示出復(fù)雜的病因，而且多種因素被認為促成其發(fā)生和發(fā)展，例如年齡、血糖狀態(tài)、淀粉樣蛋白的產(chǎn)生和多聚化、結(jié)合受體其RAGE(AGE的受體)的糖基化終末產(chǎn)物(AGE)的積累、腦部氧化應(yīng)力的增加、大腦血流的減少、神經(jīng)炎癥(包括炎性細胞因子和趨化因子的釋放)、神經(jīng)元功能障礙及小膠質(zhì)細胞活化。因此，這些慢性神經(jīng)退行性疾病代表著多種細胞類型與介體之間的復(fù)雜相互作用。對于此類疾病的治療策略有限，而且主要在于用非特異性抗炎劑(例如，皮質(zhì)類固醇、COX抑制劑)或防止神經(jīng)元損失和/或突觸功能的藥劑阻斷炎性過程。這些治療無法停止疾病發(fā)展。近期的研究表明，很多靶向療法，如針對可溶性A-β肽(包括A-b寡聚物形式)的抗體，不僅能幫助停止疾病發(fā)展，而且還可以幫助維持記憶。這些初步觀察結(jié)果表明，靶向超過一種疾病介體(例如A-β和促炎性細胞因子如TNF)的特定療法可針對慢性神經(jīng)退行性疾病提供的治療功效甚至優(yōu)于通過靶向單一疾病機制(例如單獨可溶性A-β)所觀察到的功效(參見C.E.Shepherd等,NeurobiolAging.2005年10月24日；NelsonRB.,CurrPharmDes.2005；11:3335；WilliamL.Klein.；NeurochemInt.2002；41:345；MichelleCJanelsins等,JNeuroinflammation.2005；2:23；SolomanB.,CurrAlzheimerRes.2004；1:149；IgorKlyubin等,NatMed.2005；11:556-61；ArancioO等,EMBOJournal(2004)1-10；BornemannKD等,AmJPathol.2001；158:63；DeaneR等,NatMed.2003；9:907-13；及EliezerMasliah等,Neuron.2005；46:857)。本發(fā)明的FIT-Ig分子可以結(jié)合慢性神經(jīng)退行性疾病(如阿爾茨海默氏病)中所涉及的一個或多個靶標(biāo)。此類靶標(biāo)包括但不限于，AD發(fā)病機理中所涉及的任何可溶性或細胞表面介體，例如AGE(S100A，兩性蛋白)、促炎性細胞因子(例如IL-1)、趨化因子(例如MCP1)、抑制神經(jīng)再生的分子(例如Nogo、RGMA)、增進神經(jīng)突生長的分子(神經(jīng)營養(yǎng)蛋白)。FIT-Ig分子的功效可以在臨床前動物模型，如過表達淀粉樣前體蛋白或RAGE并且顯現(xiàn)阿爾茨海默氏病樣癥狀的轉(zhuǎn)基因小鼠中進行驗證。此外，F(xiàn)IT-Ig分子可以被構(gòu)建并在動物模型中測試功效，而且可以選擇最佳的治療性FIT-Ig以供在人患者中進行測試。FIT-Ig分子還可以用于治療其它神經(jīng)退行性疾病，如帕金森氏病。α-突觸核蛋白涉及帕金森氏病的發(fā)病。能夠靶向α-突觸核蛋白和炎性介體(如TNF、IL-1、MCP-1)的FIT-Ig可以證明是帕金森氏病的有效療法并且涵蓋于本發(fā)明中。盡管對病理機制的認識增加，但脊髓損傷(SCI)仍是一種破壞性病狀并且代表一種以較高醫(yī)學(xué)需求為特征的醫(yī)學(xué)適應(yīng)癥。大多數(shù)的脊髓損傷是挫傷或壓迫損傷，并且原發(fā)損傷之后通常是繼發(fā)損傷機制(炎性介體，例如細胞因子和趨化因子)，這些繼發(fā)損傷機制使初始損傷惡化并導(dǎo)致病變區(qū)域顯著擴大，有時超過10倍。SCI的這些原發(fā)和繼發(fā)機制與由例如中風(fēng)等其它方式引起的腦損傷中的機制極其類似。不存在令人滿意的治療并且高劑量快速注射甲基潑尼龍(methylprednisolone，MP)是在損傷后的8小時窄時窗內(nèi)使用的唯一療法。然而，這一治療只旨在預(yù)防繼發(fā)損傷，而不會引起任何顯著的功能恢復(fù)。它由于明確功效的缺乏和嚴(yán)重不良作用(如免疫抑制，并發(fā)感染和嚴(yán)重組織病理學(xué)肌肉變化)而受到嚴(yán)厲批評。沒有獲得批準(zhǔn)的刺激內(nèi)源再生潛力的其它藥物、生物試劑或小分子，但近年來，頗具前景的治療原理和藥物候選物在SCI動物模型中顯示出功效。人SCI功能恢復(fù)的缺乏在很大程度上是由抑制病變部位、瘢痕組織、髓磷脂以及損傷相關(guān)細胞上神經(jīng)突生長的因子引起。這些因子是髓磷脂相關(guān)蛋白NogoA、OMgp及MAG、RGMA、瘢痕相關(guān)CSPG(硫酸軟骨素蛋白聚糖)，及反應(yīng)性星形細胞上的抑制因子(一些腦信號蛋白和蝶素(ephrin))。然而，在病變部位處，不僅發(fā)現(xiàn)了生長抑制分子，而且還發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)突生長刺激因子，如神經(jīng)營養(yǎng)因子、層粘連蛋白(laminin)、L1等。神經(jīng)突生長抑制和生長促進分子的組合可以解釋阻斷單一因子(如NogoA或RGMA)在嚙齒動物SCI模型中引起顯著功能恢復(fù)，因為抑制影響的減小可以使平衡從生長抑制轉(zhuǎn)變成生長促進。然而，通過阻斷單一神經(jīng)突外生長抑制分子所觀察到的恢復(fù)是不全面的。為了達成更快并且更明顯的恢復(fù)，阻斷兩個神經(jīng)突外生長抑制分子(例如Nogo和RGMA)，或阻斷神經(jīng)突外生長抑制分子并增強神經(jīng)突外生長增強分子(例如Nogo和神經(jīng)營養(yǎng)因子)的功能，或阻斷神經(jīng)突外生長抑制分子(例如Nogo)和促炎性分子(例如TNF)可能是合乎需要的(參見McGeeAW等,TrendsNeurosci.2003；26:193；MarcoDomeniconi等,JNeurolSci.2005；233:43；MilanMakwana1等,FEBSJ.2005；272:2628；BarryJ.Dickson,Science.2002；298:1959；FeliciaYuHsuanTeng等,JNeurosciRes.2005；79:273；TaraKarnezis等,NatureNeuroscience2004；7,736；GangXu等,J.Neurochem.2004；91；1018)。涵蓋的其它FIT-Ig是能夠結(jié)合如以下靶標(biāo)對的那些：NgR和RGMA；NogoA和RGMA；MAG和RGMA；OMGp和RGMA；RGMA和RGMB；CSPGs和RGMA；蛋白多糖、中期因子、神經(jīng)粘蛋白、多功能蛋白聚糖、磷酸蛋白聚糖、Te38和TNF-a；Aβ蛋白球聚體特異性抗體與促進樹突和軸突出芽的抗體的組合。樹突病理學(xué)是AD的極早期征兆并且已知NOGOA限制樹突生長?？梢詫⑺鲱愋偷目贵w與任何SCI-候選(髓磷脂-蛋白質(zhì))抗體組合。其它FIT-Ig靶標(biāo)可以包括以下各物的任何組合：NgR-p75、NgR-Troy、NgR-Nogo66(Nogo)、NgR-Lingo、Lingo-Troy、Lingo-p75、MAG或Omgp。另外，靶標(biāo)還可以包括與抑制神經(jīng)突有關(guān)的任何可溶性介體或細胞表面介體，例如Nogo、Ompg、MAG、RGMA、腦信號蛋白、蝶素、可溶性A-b、促炎性細胞因子(例如IL-1)、趨化因子(例如MIP1a)、抑制神經(jīng)再生的分子?？筺ogo/抗RGMA或類似FIT-Ig分子的功效可以在臨床前脊髓損傷動物模型中得到驗證。此外，這些FIT-Ig分子可以被構(gòu)建并在動物模型中測試功效，并且可以選擇最佳的治療性FIT-Ig在人患者中進行測試。此外，可構(gòu)建靶向單一受體上的兩個不同配體結(jié)合位點的FIT-Ig分子，所述受體例如結(jié)合三個配體Nogo、OMGp及MAG的Nogo受體以及結(jié)合A-b和S100A的RAGE。另外，神經(jīng)突外生長抑制劑(例如nogo和nogo受體)也在預(yù)防免疫疾病(如多發(fā)性硬化)中的神經(jīng)再生中起作用。經(jīng)顯示，在多發(fā)性硬化的動物模型中抑制nogo-nogo受體相互作用可增進恢復(fù)。因此，可阻斷一種免疫介體(例如細胞因子，如IL-12)和神經(jīng)突外生長抑制劑分子(例如nogo或RGM)的功能的FIT-Ig分子可以提供比僅阻斷免疫或神經(jīng)突外生長抑制劑分子更快并且更強的功效。單克隆抗體療法是作為癌癥的重要治療模式而出現(xiàn)(vonMehrenM等,2003Monoclonalantibodytherapyforcancer.AnnuRevMed.；54:343-69)。抗體可以通過誘導(dǎo)細胞凋亡、再定向細胞毒性、干擾配體-受體相互作用或阻止對于贅生性表型至關(guān)重要的蛋白質(zhì)的表達來發(fā)揮抗腫瘤作用。此外，抗體還可以靶向腫瘤微環(huán)境的組分，從而擾亂極為重要的結(jié)構(gòu)，如腫瘤相關(guān)血管結(jié)構(gòu)的形成?？贵w也可以靶向配體是生長因子的受體，如表皮生長因子受體。因此，抗體抑制刺激細胞生長的天然配體結(jié)合至所靶向的腫瘤細胞。或者，抗體可以誘導(dǎo)抗個體基因型網(wǎng)絡(luò)、補體介導(dǎo)的細胞毒性或抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。與單特異性療法相比，使用靶向兩個獨立腫瘤介體的雙重特異性抗體將可能產(chǎn)生附加益處。也涵蓋能夠結(jié)合以下靶標(biāo)對以治療腫瘤疾病的FIT-IgIg：IGF1和IGF2；IGF1/2和Erb2B；VEGFR和EGFR；CD20和CD3；CD138和CD20；CD38和CD20；CD38&CD138；CD40和CD20；CD138和CD40；CD38和CD40。其它靶標(biāo)組合包括EGF/erb-2/erb-3家族的一個或多個成員。FIT-IgIg可以結(jié)合的涉及腫瘤疾病的其它靶標(biāo)(一個或多個)包括但不限于，選自由以下組成的組的那些：CD52、CD20、CD19、CD3、CD4、CD8、BMP6、IL12A、IL1A、IL1B、IL2、IL24、INHA、TNF、TNFSF10、BMP6、EGF、FGF1、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14、FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF2、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、GRP、IGF1、IGF2、IL12A、IL1A、IL1B、IL2、INHA、TGFA、TGFB1、TGFB2、TGFB3、VEGF、CDK2、EGF、FGF10、FGF18、FGF2、FGF4、FGF7、IGF1、IGF1R、IL2、VEGF、BCL2、CD164、CDKN1A、CDKN1B、CDKN1C、CDKN2A、CDKN2B、CDKN2C、CDKN3、GNRH1、IGFBP6、IL1A、IL1B、ODZ1、PAWR、PLG、TGFB1I1、AR、BRCA1、CDK3、CDK4、CDK5、CDK6、CDK7、CDK9、E2F1、EGFR、ENO1、ERBB2、ESR1、ESR2、IGFBP3、IGFBP6、IL2、INSL4、MYC、NOX5、NR6A1、PAP、PCNA、PRKCQ、PRKD1、PRL、TP53、FGF22、FGF23、FGF9、IGFBP3、IL2、INHA、KLK6、TP53、CHGB、GNRH1、IGF1、IGF2、INHA、INSL3、INSL4、PRL、KLK6、SHBG、NR1D1、NR1H3、NR1I3、NR2F6、NR4A3、ESR1、ESR2、NR0B1、NR0B2、NR1D2、NR1H2、NR1H4、NR1I2、NR2C1、NR2C2、NR2E1、NR2E3、NR2F1、NR2F2、NR3C1、NR3C2、NR4A1、NR4A2、NR5A1、NR5A2、NR6A1、PGR、RARB、FGF1、FGF2、FGF6、KLK3、KRT1、APOC1、BRCA1、CHGA、CHGB、CLU、COL1A1、COL6A1、EGF、ERBB2、ERK8、FGF1、FGF10、FGF11、FGF13、FGF14、FGF16、FGF17、FGF18、FGF2、FGF20、FGF21、FGF22、FGF23、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9、GNRH1、IGF1、IGF2、IGFBP3、IGFBP6、IL12A、IL1A、IL1B、IL2、IL24、INHA、INSL3、INSL4、KLK10、KLK12、KLK13、KLK14、KLK15、KLK3、KLK4、KLK5、KLK6、KLK9、MMP2、MMP9、MSMB、NTN4、ODZ1、PAP、PLAU、PRL、PSAP、SERPINA3、SHBG、TGFA、TIMP3、CD44、CDH1、CDH10、CDH19、CDH20、CDH7、CDH9、CDH1、CDH10、CDH13、CDH18、CDH19、CDH20、CDH7、CDH8、CDH9、ROBO2、CD44、ILK、ITGA1、APC、CD164、COL6A1、MTSS1、PAP、TGFB1I1、AGR2、AIG1、AKAP1、AKAP2、CANT1、CAV1、CDH12、CLDN3、CLN3、CYB5、CYC1、DAB2IP、DES、DNCL1、ELAC2、ENO2、ENO3、FASN、FLJ12584、FLJ25530、GAGEB1、GAGEC1、GGT1、GSTP1、HIP1、HUMCYT2A、IL29、K6HF、KAI1、KRT2A、MIB1、PART1、PATE、PCA3、PIAS2、PIK3CG、PPID、PR1、PSCA、SLC2A2、SLC33A1、SLC43A1、STEAP、STEAP2、TPM1、TPM2、TRPC6、ANGPT1、ANGPT2、ANPEP、ECGF1、EREG、FGF1、FGF2、FIGF、FLT1、JAG1、KDR、LAMA5、NRP1、NRP2、PGF、PLXDC1、STAB1、VEGF、VEGFC、ANGPTL3、BAI1、COL4A3、IL8、LAMA5、NRP1、NRP2、STAB1、ANGPTL4、PECAM1、PF4、PROK2、SERPINF1、TNFAIP2、CCL11、CCL2、CXCL1、CXCL10、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL9、IFNA1、IFNB1、IFNG、IL1B、IL6、MDK、EDG1、EFNA1、EFNA3、EFNB2、EGF、EPHB4、FGFR3、HGF、IGF1、ITGB3、PDGFA、TEK、TGFA、TGFB1、TGFB2、TGFBR1、CCL2、CDH5、COL18A1、EDG1、ENG、ITGAV、ITGB3、THBS1、THBS2、BAD、BAG1、BCL2、CCNA1、CCNA2、CCND1、CCNE1、CCNE2、CDH1(E-鈣粘著蛋白)、CDKN1B(p27Kip1)、CDKN2A(p16INK4a)、COL6A1、CTNNB1(b-鏈蛋白)、CTSB(組織蛋白酶B)、ERBB2(Her-2)、ESR1、ESR2、F3(TF)、FOSL1(FRA-1)、GATA3、GSN(凝溶膠蛋白)、IGFBP2、IL2RA、IL6、IL6R、IL6ST(糖蛋白130)、ITGA6(a6整合素)、JUN、KLK5、KRT19、MAP2K7(c-Jun)、MKI67(Ki-67)、NGFB(NGF)、NGFR、NME1(NM23A)、PGR、PLAU(uPA)、PTEN、CTLA-4、OX40、GITR、TIM-3、Lag-3、B7-H3、B7-H4、GDF8、CGRP、Lingo-1、ICOS、GARP、BTLA、CD160、ROR1、SERPINB5(姜黃素)、SERPINE1(PAI-1)、TGFA、THBS1(凝血栓蛋白-1)、TIE(Tie-1)、TNFRSF6(Fas)、TNFSF6(FasL)、TOP2A(拓撲異構(gòu)酶Iia)、TP53、AZGP1(鋅-a-糖蛋白)、BPAG1(網(wǎng)格蛋白)、CDKN1A(p21Wap1/Cip1)、CLDN7(封閉素-7)、CLU(聚集素蛋白)、ERBB2(Her-2)、FGF1、FLRT1(纖連蛋白)、GABRP(GABAa)、GNAS1、ID2、ITGA6(a6整合素)、ITGB4(b4整合素)、KLF5(GC盒BP)、KRT19(角蛋白19)、KRTHB6(毛發(fā)特異性II型角蛋白)、MACMARCKS、MT3(金屬硫蛋白-III)、MUC1(粘蛋白)、PTGS2(COX-2)、RAC2(p21Rac2)、S100A2、SCGB1D2(親脂性蛋白B)、SCGB2A1(乳腺珠蛋白2)、SCGB2A2(乳腺珠蛋白1)、SPRR1B(Spr1)、THBS1、THBS2、THBS4及TNFAIP2(B94)。在一個實施方案中，可以用本文提供的組合物和方法治療或診斷的疾病包括但不限于，原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性癌癥，包括乳癌、結(jié)腸癌、直腸癌、肺癌、口咽癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、膽囊癌和膽管癌、小腸癌、泌尿道癌(包括腎癌、膀胱癌及尿路上皮癌)、女性生殖道癌(包括宮頸癌、子宮癌和卵巢癌，以及絨毛膜癌和妊娠滋養(yǎng)細胞疾病)、男性生殖道癌(包括前列腺、精囊、睪丸及生殖細胞腫瘤)、內(nèi)分泌腺癌(包括甲狀腺癌、腎上腺癌及垂體腺癌)和皮膚癌，以及血管瘤、黑素瘤、肉瘤(包括起源于骨骼和軟組織的那些，以及卡波西氏肉瘤)、腦腫瘤、神經(jīng)腫瘤、眼腫瘤及腦膜瘤(包括星形細胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、成膠質(zhì)細胞瘤、成視網(wǎng)膜細胞瘤、神經(jīng)瘤、成神經(jīng)細胞瘤、許旺氏瘤(Schwannoma)及腦膜瘤)、起源于血液科惡性疾病的實體腫瘤(如白血病)，及淋巴瘤(霍奇金氏淋巴瘤和非霍奇金氏淋巴瘤)。在一個實施方案中，本文提供的抗體或其抗原結(jié)合部分在單獨或與放射療法和/或其它化學(xué)治療劑組合使用時用于治療癌癥或用于防止本文所述的腫瘤轉(zhuǎn)移。根據(jù)本發(fā)明的另一實施方案，人免疫效應(yīng)細胞是人淋巴細胞譜系的成員。在這一實施方案中，效應(yīng)細胞可有利地為人T細胞、人B細胞或人自然殺傷(NK)細胞。有利的是，此類細胞將對靶標(biāo)細胞具有細胞毒性或細胞凋亡作用。特別有利的是，人淋巴細胞是細胞毒性T細胞，當(dāng)其活化時對靶標(biāo)細胞發(fā)揮細胞毒性作用。根據(jù)這一實施方案，人效應(yīng)細胞的募集活性則是這一細胞的細胞毒性活性。根據(jù)優(yōu)選的實施方案，細胞毒性T細胞的活化可通過由本發(fā)明這一實施方案的雙特異性抗體結(jié)合細胞毒性T細胞表面上作為效應(yīng)抗原的CD3抗原而發(fā)生。人CD3抗原存在于輔助型T細胞和細胞毒性T細胞上。人CD3表示在T細胞上作為多分子T細胞復(fù)合物的一部分表達并且包含以下三條不同鏈的抗原：CD3-ε、CD3-δ及CD3-γ。T細胞的細胞毒性潛能的活化是需要多種蛋白質(zhì)的相互作用的一種復(fù)雜現(xiàn)象。T細胞受體(“TCR”)蛋白是由兩個不同糖蛋白亞基組成的膜結(jié)合、二硫鍵連接的異二聚體。TCR識別并且結(jié)合外來肽抗原，所述抗原自身被多個高度多樣化類別的主要組織相容性復(fù)合物(“MHC”)蛋白質(zhì)的成員所結(jié)合并且以結(jié)合至MHC的形式呈現(xiàn)于抗原呈遞細胞(“APC”)的表面上。盡管如以上所概述，可變TCR結(jié)合外來抗原，但傳導(dǎo)發(fā)生此結(jié)合的T細胞的信號傳導(dǎo)取決于與TCR締合的其它無變化的信號傳導(dǎo)蛋白的存在。這些呈締合形式的信號傳導(dǎo)蛋白統(tǒng)稱為CD3復(fù)合物，此處統(tǒng)稱為CD3抗原。T細胞細胞毒性的活化通常首先取決于TCR與MHC蛋白的結(jié)合，而MHC蛋白自身結(jié)合至位于獨立細胞上的外來抗原。只有在這一初始TCR-MHC結(jié)合發(fā)生時，才能接著發(fā)生負責(zé)T細胞克隆擴增并最終引起T細胞的細胞毒性的CD3依賴性信號傳導(dǎo)級聯(lián)。然而，本發(fā)明的雙特異性抗體的第一或第二部分與人CD3抗原的結(jié)合使T細胞活化以在不存在獨立TCR-MHC結(jié)合的情況下對其它細胞發(fā)揮細胞毒性作用。這意味著，T細胞可以通過一種不依賴于克隆的方式，即以與T細胞所攜帶的特定TCR克隆無關(guān)的方式進行細胞毒性活化。此允許活化整個T細胞隔室而不是僅具有某一克隆身份的特定T細胞。根據(jù)前述論述，本發(fā)明的一個特別優(yōu)選的實施方案提供一種雙特異性抗體，其中效應(yīng)抗原是人CD3抗原。根據(jù)本發(fā)明這一實施方案的雙特異性抗體可以有總計兩個或三個抗體可變結(jié)構(gòu)域。根據(jù)本發(fā)明的其它實施方案，本發(fā)明的雙特異性抗體所結(jié)合的其它淋巴細胞締合的效應(yīng)抗原可以是人CD16抗原、人NKG2D抗原、人NKp46抗原、人CD2抗原、人CD28抗原或人CD25抗原。根據(jù)本發(fā)明另一實施方案，人效應(yīng)細胞是人髓系的成員。有利的是，所述效應(yīng)細胞可以是人單核細胞、人嗜中性粒細胞或人樹突狀細胞。有利的是，此類細胞將對靶標(biāo)細胞具有細胞毒性或細胞凋亡作用。這一實施方案內(nèi)可以由本發(fā)明的雙特異性抗體結(jié)合的有利抗原可以是人CD64抗原或人CD89抗原。根據(jù)本發(fā)明的另一實施方案，靶標(biāo)抗原是在疾病情況下于靶細胞或效應(yīng)細胞上廣泛表達，但在健康情況下不表達、以較低水平表達或不可接近的抗原。可能被本發(fā)明的雙特異性抗體特異性結(jié)合的此類靶抗原的實例可有利地選自EpCAM、CCR5、CD19、HER-2neu、HER-3、HER-4、EGFR、PSMA、CEA、MUC-1(粘蛋白)、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5AC、MUC5B、MUC7、βhCG、Lewis-Y、CD20、CD33、CD30、神經(jīng)節(jié)苷脂GD3、9-O-乙?；?GD3、GM2、GloboH、巖藻糖基GM1、聚SA、GD2、碳酸酐酶IX(MN/CAIX)、CD44v6、音猬因子(Shh)、Wue-1、漿細胞抗原、(膜結(jié)合)IgE、黑素瘤硫酸軟骨素蛋白聚糖(MCSP)、CCR8、TNF-α前體、STEAP、間皮素、A33抗原、前列腺干細胞抗原(PSCA)、Ly-6；橋粒芯蛋白4、E-鈣粘著蛋白新表位、胎兒乙酰膽堿受體、CD25、CA19-9標(biāo)記物、CA-125標(biāo)記物及II型苗勒抑制物質(zhì)(MuellerianInhibitorySubstance，MIS)受體、sTn(唾液酸化Tn抗原；TAG-72)、FAP(纖維原細胞活化抗原)、內(nèi)皮唾液酸蛋白、EGFRvIII、LG、SAS及CD63。根據(jù)一個具體實施方案，由雙特異性抗體特異性結(jié)合的靶標(biāo)抗原可以是癌癥相關(guān)抗原，即與惡性病狀相關(guān)的抗原。此類抗原在惡性細胞上表達或可接近，而所述抗原在非惡性細胞上不存在、不明顯存在或無法接近。因此，根據(jù)本發(fā)明這一實施方案的雙特異性抗體是募集人免疫效應(yīng)細胞針對帶有靶標(biāo)抗原或使靶標(biāo)抗原可接近的惡性靶標(biāo)細胞的活性的雙特異性抗體?；虔煼ǎ涸谝粋€具體實施方案中，施用編碼本文提供的結(jié)合蛋白或本文提供的另一預(yù)防劑或治療劑的核酸序列以通過基因療法治療、預(yù)防、管理或改善病癥或其一種或多種癥狀?；虔煼ㄊ侵竿ㄟ^向受試者施用已表達或可表達的核酸所進行的療法。在這個實施方案中，核酸產(chǎn)生其所編碼的介導(dǎo)預(yù)防或治療作用的本文提供的抗體或者預(yù)防劑或治療劑。本領(lǐng)域中可用的任何基因療法的方法都可以用于本文提供的方法中。關(guān)于基因療法方法的一般綜述，參見Goldspiel等(1993)Clin.Pharmacy12:488-505；Wu和Wu(1991)Biotherapy3:87-95；Tolstoshev(1993)AnnRev.Pharmacol.Toxicol.32:573-596；Mulligan(1993)Science260:926-932；Morgan和Anderson(1993)AnnRev.Biochem.62:191-217；及May(1993)TIBTECH11(5):155-215。可以使用的重組DNA
技術(shù)領(lǐng)域：
：中通常已知的方法描述于以下文獻中：Ausubel等(編輯),CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,NY(1993)；及Kriegler,GeneTransferandExpression,ALaboratoryManual,StocktonPress,NY(1990)。基因療法的各種方法的詳細描述公開于美國專利公布號US20050042664中。診斷法：本文的公開內(nèi)容還提供了診斷應(yīng)用，包括但不限于，診斷測定法、含有一種或多種結(jié)合蛋白的診斷試劑盒，及用于自動化和/或半自動化系統(tǒng)的方法和試劑盒的改進形式。所提供的方法、試劑盒及改進形式可以用于檢測、監(jiān)測和/或治療個體的疾病或病癥。這一點在下文進一步說明。A.測定方法：本公開還提供了使用至少一種本文所述的結(jié)合蛋白確定測試樣本中分析物或其片段的存在、量或濃度的方法。本領(lǐng)域中已知的任何適合的測定都可以用于所述方法中。實例包括但不限于，免疫測定法和/或使用質(zhì)譜法的方法。本公開提供的免疫測定法可以包括夾心免疫測定、放射免疫測定(RIA)、酶免疫測定(EIA)、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、競爭性抑制免疫測定、熒光偏振免疫測定(FPIA)、酶放大免疫測定技術(shù)(EMIT)、生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移(BRET)及均質(zhì)化學(xué)發(fā)光測定等?；瘜W(xué)發(fā)光微粒免疫測定，特別是采用自動分析儀(AbbottLaboratories,AbbottPark,Ill.)的化學(xué)發(fā)光微粒免疫測定是免疫測定的一個實例。本公開提供了采用質(zhì)譜法的方法并且包括但不限于，MALDI(基質(zhì)輔助激光解吸/電離)或SELDI(表面增強激光解吸/電離)。使用免疫測定和質(zhì)譜法收集、處理、加工及分析生物測試樣本的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，被提供用于本公開的實踐(US2009-0311253A1)。B.試劑盒：也提供一種用于測定測試樣本中的分析物或其片段的存在、量或濃度的試劑盒。所述試劑盒包括至少一種用于測定測試樣本中的分析物或其片段的組分和有關(guān)測定測試樣本中的分析物或其片段的說明書。所述至少一種用于測定測試樣本中的分析物或其片段的組分可以包括包含任選固定于固相上的如本文公開的結(jié)合蛋白和/或抗分析物結(jié)合蛋白(或其片段、變體或其變體的片段)的組合物。所述試劑盒任選地可以包含校準(zhǔn)劑或?qū)φ瘴?，其可以包含分離的或純化的分析物。所述試劑盒可以包含至少一種用于通過免疫測定和/或質(zhì)譜法測定測試樣本中的分析物的組分。所述試劑盒組分，包括分析物、結(jié)合蛋白和/或抗分析物結(jié)合蛋白或其片段，可以任選地使用任何本領(lǐng)域已知的可檢測標(biāo)記進行標(biāo)記。提供的用于實踐本公開的物質(zhì)及產(chǎn)生方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的(US2009-0311253A1)。C.試劑盒和方法的改進形式：通過如本文所述的免疫測定等測定來測定測試樣本中分析物的存在、量或濃度的試劑盒(或其組分)以及方法可以被改進以用于如例如美國專利號5,089,424和5,006,309中所述并且如例如由AbbottLaboratories(AbbottPark,IL)以出售的多種自動化和半自動化系統(tǒng)(包括其中固相包括微粒的系統(tǒng))中?？勺訟bbottLaboratories獲得的其它平臺包括但不限于，(參見例如，美國專利號5,294,404)、EIA(珠粒)及QuantumTMII，以及其它平臺。另外，所述測定、試劑盒和試劑盒組分可以其它形式被采用，例如在電化學(xué)或其它手持型或定點照護型(point-of-care)測定系統(tǒng)上采用。本公開例如適用于執(zhí)行夾心免疫測定的商業(yè)Abbott定點照護型(AbbottLaboratories)電化學(xué)免疫測定系統(tǒng)。免疫傳感器以及其制造和在一次性測試裝置中操作的方法描述于例如美國專利號5,063,081、7,419,821和7,682,833；以及美國公布號20040018577、20060160164和US20090311253中。對本領(lǐng)域技術(shù)人員易于顯而易見的是，本文所述的方法的其它適合修改和改進是明顯的并且可以在不脫離本文公開的實施方案的范圍的情況下使用適合等效物來進行?，F(xiàn)已詳細描述某些實施方案，通過參考以下實施例將對其有更明確理解，這些實施例僅出于說明目的包括在內(nèi)而不意圖限制。盡管出于清楚理解的目的，已經(jīng)通過舉例說明和實施例相當(dāng)詳細地描述了前述發(fā)明，但是根據(jù)本發(fā)明的教義，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將顯而易見的是，在不背離所附權(quán)利要求的精神和范圍情況下，可以對本發(fā)明進行某些改變和修改。以下實施例僅以說明方式提供，而并不起限制作用。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將易于認識到多種非關(guān)鍵性參數(shù)，這些參數(shù)可以改變或修改以得到基本上類似的結(jié)果。實施例實施例1.抗IL17/IL-20串聯(lián)Fab免疫球蛋白(FIT-Ig)的構(gòu)建、表達、純化及分析為了證實FIT-Ig技術(shù)，產(chǎn)生一組抗IL-17/IL-20FIT-Ig分子：FIT1-Ig、FIT2-Ig及FIT3-Ig，這些分子都含有3種不同多肽，如圖1中所示，其中抗原A是IL-17并且抗原B是IL-20。用于產(chǎn)生能夠結(jié)合IL-17和IL-20的FIT-Ig的DNA構(gòu)建體示于圖1B中。簡單地說，親本mAb包括兩種高親和力抗體，即抗IL-17(克隆LY)(美國專利號7,838,638)和抗hIL-20(克隆15D2)(美國專利申請公布號US2014/0194599)。為了產(chǎn)生FIT-Ig構(gòu)建體#1，將LY的VL-CL直接(FIT1-Ig)或通過具有3個氨基酸(FIT2-Ig)或7個氨基酸(FIT3-Ig)的連接子與15D2重鏈的N末端融合(如表1中所示)。構(gòu)建體#2是LY的VH-CH1，而第三構(gòu)建體是15D2的VL-CL。每一FIT-Ig的三個構(gòu)建體在293細胞中共轉(zhuǎn)染，引起FIT-Ig蛋白的表達和分泌。另產(chǎn)生一組抗IL-17/IL-20FIT-Ig分子：FIT4-Ig、FIT5-Ig及FIT6-Ig，其各自含有2種不同多肽，如圖2中所示。用于產(chǎn)生能夠結(jié)合IL-17和IL-20的FIT-Ig的DNA構(gòu)建體示于圖2B中，其中抗原A是IL-17并且抗原B是IL-20。簡單地說，親本mAb包括兩種高親和力抗體，即抗IL-17(克隆LY)和抗hIL-20(克隆15D2)。為了產(chǎn)生FIT-Ig構(gòu)建體#1，將LY的VL-CL直接(FIT4-Ig)或通過連接子具有3個氨基酸(FIT5-Ig)或7個氨基酸(FIT6-Ig)的連接子與15D2重鏈的N末端融合(如表1中所示)。為了產(chǎn)生FIT-Ig構(gòu)建體#4，將LY的VH-CH1直接(FIT4-Ig)或通過具有3個氨基酸(FIT5-Ig)或7個氨基酸(FIT6-Ig)的連接子與15D2輕鏈的N末端融合。每一FIT-Ig的2個DNA構(gòu)建體(構(gòu)建體#1和#4)在293細胞中共轉(zhuǎn)染，引起FIT-Ig蛋白的表達和分泌。PCR克隆的詳細程序描述于下。實施例1.1:抗IL-17/IL-20FIT-Ig分子的分子克隆：對于構(gòu)建體#1克隆，使用與輕鏈信號序列退火的正向引物和與輕鏈的C末端退火的反向引物，通過PCR擴增LY輕鏈。使用與15D2VH的N末端退火的正向引物和與CH的C末端退火的反向引物，通過PCR擴增15D2重鏈。對這兩個PCR片段進行凝膠純化并使用信號肽和CH引物對，通過重疊PCR將其合并。將合并的PCR產(chǎn)物克隆到已含有人Fc序列的293表達載體中。表1.抗IL-17/IL-20FIT-Ig分子和DNA構(gòu)建體對于構(gòu)建體#2克隆，使用與重鏈信號肽退火的正向引物和與CH1的C末端退火的反向引物，通過PCR擴增LYVH-CH1。對PCR產(chǎn)物進行凝膠純化，隨后將其克隆到293表達載體中。對于構(gòu)建體#3，使用與輕鏈信號肽N末端退火的正向引物和與CL的末端退火的反向引物，通過PCR擴增15D2輕鏈。對PCR產(chǎn)物進行凝膠純化，隨后將其克隆到293表達載體中。對于構(gòu)建體#4克隆，使用與重鏈信號肽N末端退火的正向引物和與CH1的末端退火的反向引物，通過PCR擴增LYVH-CH1。使用與15D2VL的末端退火的引物擴增15D2VL。對這兩種PCR產(chǎn)物進行凝膠純化并通過重疊PCR將其合并。對合并的PCR產(chǎn)物進行凝膠純化并將其克隆到293表達載體中。表2顯示了用于以上分子克隆中的PCR引物的序列。表2.用于抗IL-17/抗CD20FIT-Ig的分子構(gòu)建的PCR引物hIL-17/hIL-20FIT1-Ig、FIT2-Ig、FIT3-Ig、FIT4-Ig、FIT5-Ig及FIT6-Ig的最終序列列于表3中。表3.抗IL-17/IL-20FIT-Ig分子的氨基酸序列實施例1.2:抗IL-17/IL-20FIT-Ig蛋白的表達、純化及分析將每一FIT-Ig的所有DNA構(gòu)建體都亞克隆到基于pBOS的載體中，并進行測序以確保準(zhǔn)確性。在293E細胞中，使用聚乙烯亞胺(PEI)對每一FIT-Ig(1、2及3)的構(gòu)建體#1、構(gòu)建體#2及構(gòu)建體#3或每一FIT-Ig(4、5及6)的構(gòu)建體#1和構(gòu)建體#4進行短暫共表達。簡單地說，將FreeStyleTM293表達培養(yǎng)基中的DNA與PEI以DNA與PEI的比率是1:2的最終濃度混合，在室溫下孵育15分鐘(不超過20分鐘)，接著以60μgDNA/120ml培養(yǎng)物添加到293E細胞(1.0–1.2×106/ml，細胞活力>95％)中。在振蕩器中培養(yǎng)6-24小時之后，在37℃、8％CO2下，在以125rpm/min振蕩下，將蛋白胨以5％的最終濃度添加到經(jīng)過轉(zhuǎn)染的細胞中。在第6天-第7天，通過離心和過濾來收獲上清液，并根據(jù)制造商的說明書，使用蛋白質(zhì)A色譜法(Pierce,Rockford,IL)純化FIT-Ig蛋白。通過SDS-PAGE分析這些蛋白質(zhì)，并通過A280和BCA(Pierce,Rockford,IL)測定其濃度。為表達FIT1-Ig、FIT2-Ig及FIT3-Ig，使用了不同DNA摩爾比的3種構(gòu)建體，包括構(gòu)建體#1:#2:#3＝1:1:1、構(gòu)建體#1:#2:#3＝1:1.5:1.5及構(gòu)建體#1:#2:#3＝1:3:3(表4)。通過蛋白質(zhì)A色譜法純化FIT-Ig蛋白。純化產(chǎn)率(7-16mg/L)與每一種蛋白質(zhì)的表達培養(yǎng)基中的hIgG定量一致。通過SDS-PAGE，在還原條件和非還原條件下分析純化的FIT-Ig的組成和純度。在非還原條件下，F(xiàn)IT-Ig以約250KDa的單一帶遷移。在還原條件下，F(xiàn)IT-Ig蛋白各自產(chǎn)生兩條帶，高于MW帶的一條是約75KDa的構(gòu)建體#1，而低于MW帶的一條對應(yīng)于在約25KDa處重疊的構(gòu)建體#2和構(gòu)建體#3。SDS-PAGE顯示，每一FIT-Ig表達為單一物質(zhì)，并且這3條多肽鏈有效配對形成類IgG分子。這些鏈的大小以及FIT-Ig分子的全長蛋白與其基于氨基酸序列計算的分子質(zhì)量一致。表4.hIL-17/IL-20FIT-Ig蛋白的表達和SEC分析為了進一步研究在溶液中的FIT-Ig的物理特性，使用尺寸排阻色譜法(SEC)來分析每一種蛋白質(zhì)。對于FIT-Ig的SEC分析，將含有純化的FIT-Ig的PBS施加于TSKgelSuperSW3000的300×4.6mm柱(TOSOH)上。使用U3000型HPLC儀器(DIONEX)進行SEC。所有蛋白質(zhì)都使用UV檢測，在280nm和214nm下測定。洗脫是以0.25mL/min流動速率進行的等度洗脫。全部3種FIT-Ig蛋白都展現(xiàn)單一主峰，展示作為單體蛋白質(zhì)的物理均質(zhì)性(表4)。對于全部3種FIT-Ig蛋白，通過SEC發(fā)現(xiàn)，構(gòu)建體#1:#2:#3的比率＝1:3:3顯示較佳的單體特征(表4)。表4還顯示，所有這些FIT-Ig蛋白的表達水平都與常規(guī)mAb的表達水平相當(dāng)，表明這些FIT-Ig可以在哺乳動物細胞中高效地表達。為了表達FIT4-Ig、FIT5-Ig及FIT6-Ig，構(gòu)建體#1:#4的DNA比率＝1:1，并且表達水平在1-10mg/L范圍內(nèi)，并且由SEC測定的峰單體分數(shù)％在58-76％范圍內(nèi)?；谶@一特定的mAb組合(LY和15D2)，3-多肽FIT-Ig構(gòu)建體(FIT1-Ig、FIT2-Ig及FIT3-Ig)顯示出比2-多肽FIT-Ig構(gòu)建體(FIT4-Ig、FIT5-Ig及FIT6-Ig)更佳的表達譜，因此再對FIT1-Ig、FIT2-Ig及FIT3-Ig的功能特性進行分析。實施例1.3抗IL-17/IL-20FIT-Ig的抗原結(jié)合親和力的測定利用BiacoreX100儀器(BiacoreAB,Uppsala,Sweden)，使用HBS-EP(10mMHEPES，pH7.4，150mMNaCl、3mMEDTA及0.005％表面活性劑P20)通過表面等離子共振(表5)在25℃下測定FIT-Ig結(jié)合rhIL-17和rhIL-20的動力學(xué)。簡單地說，根據(jù)制造商的說明書，使用標(biāo)準(zhǔn)胺偶合試劑盒將山羊抗人IgGFcγ片段特異性多克隆抗體(PierceBiotechnologyInc,Rockford,IL)直接固定在CM5研究級生物傳感器芯片上。在HEPES緩沖生理鹽水中稀釋純化的FIT-Ig樣本以在整個山羊抗人IgGFc特異性反應(yīng)表面上進行捕獲并且在反應(yīng)基質(zhì)上以5μl/min的流動速率注射。在30μL/min連續(xù)流動速率下測定締合速率常數(shù)kon(M-1s-1)和解離速率常數(shù)koff(s-1)。通過在1.25至1000nM范圍內(nèi)的十種不同抗原濃度下進行動力學(xué)結(jié)合測量來得到速率常數(shù)。接著，通過以下公式，由動力學(xué)速率常數(shù)計算出FIT-Ig與靶標(biāo)蛋白之間的反應(yīng)的平衡解離常數(shù)(M)：KD＝koff/kon。另外，同時在空白參照和反應(yīng)CM表面上注射抗原樣本的等分試樣以記錄并減去任何非特異性結(jié)合背景，從而消除大部分的折射率變化和注射干擾。隨后，通過以10μL/min流動速率兩次注射25ml的10mM甘氨酸(pH1.5)使表面再生。使固定有抗Fc抗體的表面完全再生并且在十二個循環(huán)內(nèi)保持其完全的捕獲能力。表5.抗IL-17/IL-20FIT-Ig分子的功能表征Biacore分析指示，三種FIT-Ig與hIL-17和hIL-20的總體結(jié)合參數(shù)類似，而且FIT-Ig的親和力與親本mAbLY和15D2極為接近，并且針對任一抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合親和力不存在損失(表5)。此外，還通過Biacore分析FIT-Ig的四價雙重特異性抗原結(jié)合。首先在Biacore傳感器芯片上，經(jīng)由山羊抗人Fc抗體捕獲FIT1-Ig，并注射第一抗原，同時觀察結(jié)合信號。當(dāng)FIT1-Ig被第一抗原飽和時，則注射第二抗原并觀察第二信號。對于FIT2-Ig，這是通過依序注射IL-17和IL-20或通過依序注射IL-20和IL-17進行的(圖3)。以任一順序，檢測到雙重結(jié)合活性，并且在25-30RU下使兩種抗原結(jié)合飽和。對于FIT2-Ig和FIT3-Ig獲得類似結(jié)果。由此，每一FIT-Ig能夠作為雙重特異性四價分子同時結(jié)合兩種抗原。FIT-Ig的表達譜和雙重結(jié)合特性清楚地證實，在FIT-Ig分子內(nèi)，兩個VL-CL都正確地與其對應(yīng)VH-CH1配對，形成2個功能性結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并且表達為單一單體、四價并且具有雙特異性的全長FIT-Ig蛋白。這與呈現(xiàn)四價但對一個靶抗原具有單特異性結(jié)合活性的多價抗體分子類型(Miller和Presta，US專利8722859)形成對比。實施例1.4抗IL-17/IL-20FIT-Ig生物活性的測定使用GROα生物測定來測量FIT-Ig中和IL-17功能的生物活性。簡單地說，將Hs27細胞以10000個細胞/50μL/孔接種到96孔板中。一式兩份，將FIT-Ig或抗IL-17對照抗體(25μL)添加到孔中，其中起始濃度是2.5nM，隨后以1:2進行連續(xù)稀釋，直到5pM。接著向每個孔中添加IL-17A(25μL)。IL-17A的最終濃度是0.3nM。在37℃下孵育細胞17小時，隨后收集細胞培養(yǎng)物上清液。根據(jù)制造商的方案(R&Dsystems)，通過人CACL1/GROαQuantikine試劑盒測量細胞培養(yǎng)物上清液中GRO-α的濃度。使用IL-20R+BAF3細胞增殖測定來測量FIT-Ig中和IL-20功能的生物活性。簡單地說，將25μL0.8nM的重組人IL-20添加到96孔板的每個孔中(IL-20的最終濃度是0.2nM)。將抗IL20抗體或FIT-Ig或另一對照抗體稀釋到400nM(工作濃度是100nM)，隨后進行5倍連續(xù)稀釋，并將其添加到96孔測定板中(每孔25μL)。接著，將50μL體積的RPMI1640加10％FBS、濃度是800μg/ml的潮霉素B、濃度是800μg/ml的G418，用IL-20受體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的BaF3細胞以10000個細胞/孔濃度添加到每個孔中。在48小時孵育后，將100μLCellTiter-Glo發(fā)光緩沖液添加到每個孔中。在定軌振蕩器上混合內(nèi)容物2分鐘以誘導(dǎo)細胞溶解并在室溫下孵育板10分鐘以使發(fā)光信號穩(wěn)定。通過SpectraMaxM5記錄發(fā)光。如表5中所示，所有FIT-Ig都能夠中和hIL-20和hIL-17兩者，并且親和力類似于親本抗體的親和力?；谑褂肂iacore和基于細胞的中和測定進行的功能分析，很明顯，全部3種FIT-Ig都完全保持了親本mAb的活性。三種FIT-Ig間不存在顯著功能差異，表明連接子是任選的，并且FIT-Ig構(gòu)建體提供足夠的柔性和特定尺寸以允許在2個Fab結(jié)合區(qū)之間不存在肽間隔子的情況下實現(xiàn)雙重結(jié)合。這與其中2條多肽鏈中的每一條上的2個可變結(jié)構(gòu)域之間都需要連接子以保持下部(第2)可變結(jié)構(gòu)域的活性的DVD-Ig型分子形成對比。實施例1.5抗IL-17/IL-20FIT-Ig的穩(wěn)定性研究將含F(xiàn)IT1-Ig蛋白質(zhì)樣本的檸檬酸鹽緩沖液(pH＝6.0)分別在恒定的4℃、25℃和40℃下孵育1天、3天或7天；類似地，將FIT1-Ig蛋白質(zhì)樣本冷凍-解凍一次、兩次或三次。利用SEC-HPLC，通過將蛋白質(zhì)樣本各10μg以0.3mL/min流動速率注射到裝備Superdex2005/150GL的Utimate3000HPLC中保持15分鐘來檢測所有樣本中完整的完全單體蛋白的分數(shù)，并使用由制造商供應(yīng)的Chromeleon軟件記錄并分析數(shù)據(jù)。表6顯示在這些熱激發(fā)條件下，F(xiàn)IT1-Ig和FIT3-Ig仍是完全完整的單體分子。表6.通過利用SEC測量完全單體分數(shù)％對FIT-Ig進行穩(wěn)定性分析實施例1.6抗IL-17/IL-20FIT-Ig的溶解度研究通過測量在遞增濃度的PEG6000(PEG6000購自Shanghailingfengchemicalreagentco.Ltd)存在下沉淀的跡象來分析FIT1-Ig的溶解度。簡單地說，所獲得的在PEG6000存在下蛋白質(zhì)的溶解度隨PEG6000濃度(0、5％、10％、15％、20％、25％及30％)而變化。溶解度研究在25℃的溫度下以pH6.0的溶液進行。簡單地說，通過混合適量的蛋白質(zhì)緩沖儲備液、PEG和緩沖液以達到所需的組分濃度，來使蛋白質(zhì)沉淀。最終體積接近200μl并且蛋白質(zhì)濃度設(shè)置在1.0mg/mL。充分混合最終溶液并平衡16小時。平衡后，以13000rpm離心溶液10分鐘以分離蛋白質(zhì)沉淀。使用SpectraMaxPlus384(MolecularDevice)在280nm下測量并從上清液的吸光度獲得蛋白質(zhì)溶解度，并且基于蛋白質(zhì)濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算濃度(圖4A)。另外，使用相同實驗方法，在3種不同pH條件下分析市售抗體利妥昔單抗(Rituxan)(圖4B)。很明顯，蛋白質(zhì)溶解度取決于pH條件，而且預(yù)測的FIT-Ig溶解度將在單克隆抗體的范圍內(nèi)。實施例1.7抗IL-17/IL-20FIT-Ig的藥代動力學(xué)研究在雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠中評估FIT1-Ig的藥代動力學(xué)特性。將FIT-Ig蛋白以5mg/kg單次靜脈內(nèi)劑量經(jīng)由頸靜脈導(dǎo)管或在背部皮膚下皮下施用給雄性SD大鼠。在28天時間內(nèi)，在不同時間點收集血清樣本，其中在0、5分鐘、15分鐘及30分鐘；1小時、2小時、4小時、8小時及24小時；以及2天、4天、7天、10天、14天、21天及28天經(jīng)由尾靜脈連續(xù)抽血來進行取樣，并通過人IL-17捕獲和/或人IL-20捕獲ELISA加以分析。簡單地說，用山羊抗生物素抗體(5μg/ml，4℃，過夜)涂布ELISA板，用Superblock(Pierce)阻斷并在室溫下與含50ng/ml生物素化人IL-17(IL-17捕獲ELISA)或IL-20(IL-20捕獲ELISA)的10％SuperblockTTBS一起孵育2小時。對血清樣本進行連續(xù)稀釋(含0.5％血清、10％Superblock的TTBS)并在室溫下，在板上孵育30分鐘。用HRP標(biāo)記的山羊抗人抗體進行檢測并借助于標(biāo)準(zhǔn)曲線，使用四參數(shù)邏輯斯蒂擬合(fourparameterlogisticfit)測定濃度。若干動物，尤其是在皮下組中，顯示在第10天后FIT-Ig濃度可能因發(fā)生抗人反應(yīng)而急劇下降。將這些動物從最終計算中去除。通過非房室模型，使用WinNonlin軟件(PharsightCorporation,MountainView,Calif.)測定藥代動力學(xué)參數(shù)的值。在大鼠PK研究中，當(dāng)通過兩種不同的ELISA方法測定時，F(xiàn)IT1-Ig血清濃度極為相似，表明所述分子是完整的，并且能夠在體內(nèi)結(jié)合兩種抗原。在IV給藥后，F(xiàn)IT1-Ig展現(xiàn)由分配相隨后消除相組成的雙相藥代動力學(xué)曲線，類似于常規(guī)IgG分子的PK曲線。基于這兩種不同的分析方法計算的藥代動力學(xué)參數(shù)極為相似并且顯示于表7中。FIT-Ig的清除率較低(約12mL/天/kg)并具有較低分配體積(Vss是約130mL/kg)，由此產(chǎn)生較長半衰期(T1/2>10天)。在皮下施用之后，F(xiàn)IT-Ig緩慢吸收，并且在給藥后4天達到約26.9μg/ml的最大血清濃度。終末半衰期是約11天并且皮下生物利用率接近100％。如由這些結(jié)果所證實，F(xiàn)IT1-Ig在體內(nèi)的特性與常規(guī)IgG分子極為類似，表明有可能在治療應(yīng)用中使用相同的給藥方案。FIT-Ig的藥代動力學(xué)研究在多特異性類Ig生物制劑開發(fā)領(lǐng)域展示了令人驚訝的突破。大鼠藥代動力學(xué)系統(tǒng)在制藥行業(yè)中常用于治療性mAb的臨床前評價，并且它良好地預(yù)測mAb在人體中的藥代動力學(xué)特征。FIT-Ig的較長半衰期和較低清除率使其能夠以較低給藥頻率對慢性適應(yīng)癥進行治療，與治療性mAb類似。此外，基于由PK研究得到的類IgG分布體積參數(shù)，比IgG大100-kDa的FIT-Ig看來能有效地滲透到組織中。表7.在SD大鼠中進行的FIT1-Ig的藥代動力學(xué)分析實施例1.8有關(guān)FIT-Ig的穩(wěn)定CHO細胞系產(chǎn)生研究據(jù)觀察，F(xiàn)IT-Ig在短暫轉(zhuǎn)染的293E細胞中高效表達。為了進一步確定FIT-Ig的制造可行性，在CHO-DG44細胞系和CHO-S細胞系中進行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，隨后進行克隆選擇和生產(chǎn)力分析。簡單地說，通過用含8×106個細胞的400μl轉(zhuǎn)染溶液加亞克隆到FreedompCHO載體(LifeTechnologies)中的20μgDNA(對于CHODG44細胞)或25μgDNA(對于CHO-S細胞)進行電穿孔來轉(zhuǎn)染CHO細胞。使用常規(guī)程序進行穩(wěn)定細胞系選擇。簡單地說，對于CHO-DG44選擇，在轉(zhuǎn)染后，選出穩(wěn)定集合(-HT/2P/400G，其中P是μg/mL嘌呤霉素，G是μg/mLG418)，并通過IgGELISA分析蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。選擇頂部集合，并用遞增濃度的MTX(50nM、100nM、200nM及500nM)進行數(shù)輪擴增，隨后通過IgGELISA分析蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。然后，選擇頂部集合進行亞克隆。對于CHO-S細胞選擇，在含有10P/400G/100M(M是nMMTX)的培養(yǎng)基中進行第一階段選擇，隨后分析蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。接著，選擇頂部集合并在30P/400G/500M或50P/400G/1000M中進行第2階段選擇，隨后通過ELISA測量蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。然后，選擇頂部集合進行亞克隆。對于蛋白質(zhì)生產(chǎn)力分析，使用30mL新鮮培養(yǎng)基(補充有6mML-谷氨酰胺的CDFortiCHOTM培養(yǎng)基)將完全回收的細胞集合(活力>90％)以5×105個活細胞/毫升(CHODG44)或3×105個活細胞/毫升(CHO-S)接種于125mL振蕩瓶中。在37℃、80％相對濕度、8％CO2及130rpm下，在振蕩平臺上孵育細胞。每天或以規(guī)律時間間隔(例如，在第0天、第3天、第5天、第7天、第10天、第12天及第14天)對培養(yǎng)物取樣以測定細胞密度、活力及生產(chǎn)力，直到培養(yǎng)物活力降到50％以下或達到第14天培養(yǎng)。取樣后，必要時向培養(yǎng)物供給葡萄糖。FIT1-IgCHO穩(wěn)定細胞系產(chǎn)生的整個過程顯示特征類似于單克隆抗體在CHO細胞中的產(chǎn)生的特征。舉例來說，在2P/400G下分析DG44集合期間，VCD持續(xù)增加，直到第10-12天，達到約1.3E7，而細胞活力到第13-14天時仍高于80％，而且生產(chǎn)力在第14天時達到約40mg/mL(圖5A)。在5P/400G/50M下擴增后，生產(chǎn)力在第14天時達到50mg/mL以上(圖5B)。對于CHO-S細胞選擇，在第I階段選擇期間，滴度達到200mg/mL以上(圖5C)，并且在第2階段選擇時超過370mg/mL(圖5D)。這些生產(chǎn)力水平與先前在實驗室關(guān)于常規(guī)人mAb產(chǎn)生所觀察到的生產(chǎn)力水平類似，表明FIT-Ig對于商業(yè)應(yīng)用展示出類mAb制造可行性。實施例2:抗CD3/CD20串聯(lián)Fab免疫球蛋白(FIT-Ig)的構(gòu)建、表達及純化為了證實FIT-Ig是否能結(jié)合至細胞表面抗原，產(chǎn)生抗CD3/CD20FIT-Ig分子FIT7-Ig和FIT8-Ig，其為3-多肽構(gòu)建體，如圖1中所示。用于產(chǎn)生能夠結(jié)合細胞表面CD3和CD20的FIT-Ig的構(gòu)建體示于圖1B中。簡單地說，親本mAb包括兩種高親和力抗體，即抗CD3(OKT3)和抗CD20(奧法木單抗)。為了產(chǎn)生FIT7-Ig構(gòu)建體#1，將OKT3的VL-CL直接(FIT7-Ig)或通過具有7個氨基酸的連接子(FIT8-Ig)與奧法木單抗重鏈的N末端融合(如表8中所示)。構(gòu)建體#2是OKT3的VH-CH1，并且第3構(gòu)建體是奧法木單抗的VL-CL。FIT-Ig的這3種構(gòu)建體在293細胞中共轉(zhuǎn)染，引起FIT-Ig蛋白的表達和分泌。PCR克隆的詳細程序描述于下：實施例2.1抗CD3/CD20FIT-Ig的分子克?。悍肿涌寺》椒ㄅc有關(guān)抗hIL-17/hIL-20FIT-Ig的分子克隆方法類似。表8.抗CD3/CD20FIT-Ig分子和構(gòu)建體表9顯示了用于以上分子構(gòu)建的PCR引物的序列。表9.用于抗IL-17/IL-20FIT-Ig的分子構(gòu)建的PCR引物抗CD3/CD20FIT-Ig的最終序列描述于表10中。表10.抗CD3/CD20FIT-Ig的氨基酸序列實施例2.2抗CD3/CD20FIT-Ig的表達和純化將每一FIT-Ig的所有DNA構(gòu)建體都亞克隆到基于pBOS的載體中，并進行測序以確保準(zhǔn)確性。在293E細胞中，使用聚乙烯亞胺(PEI)對每一FIT-Ig的構(gòu)建體#1、構(gòu)建體#2及構(gòu)建體#3進行短暫共表達。簡單地說，將FreeStyleTM293表達培養(yǎng)基中的DNA與PEI以DNA與PEI的比率是1:2的最終濃度混合，在室溫下孵育15分鐘(不超過20分鐘)，接著以60μgDNA/120ml培養(yǎng)物添加到293E細胞(1.0–1.2×106/ml，細胞活力>95％)中。在振蕩器中培養(yǎng)6-24小時之后，在37℃、8％CO2下，在以125rpm/min振蕩下，將蛋白胨以5％的最終濃度添加到經(jīng)過轉(zhuǎn)染的細胞中。在第6天-第7天，通過離心和過濾來收集上清液，并根據(jù)制造商的說明書，使用蛋白質(zhì)A色譜法(Pierce,Rockford,IL)純化FIT-Ig蛋白。通過SDS-PAGE分析這些蛋白質(zhì)，并通過A280和BCA(Pierce,Rockford,IL)測定其濃度(表11)。表11.抗CD3/CD20FIT-Ig蛋白的表達和SEC分析實施例2.3抗CD3/CD20FIT-Ig分子的結(jié)合活性：使用在細胞表面上表達CD3的Jurkat細胞，以及在細胞表面上表達CD20的Raji細胞，通過FACS分析抗CD3/CD20FIT-Ig與兩種靶標(biāo)的結(jié)合。簡單地說，在冰冷的PBS中洗滌5×105個細胞并在冰上用2％FBS阻斷，保持1小時。將細胞與抗體FIT-Ig(100nM)或同種型對照物一起在冰上孵育1小時，并用PBS洗滌3次。添加二抗(標(biāo)記有AlexaFluor488的山羊抗人IgG，Invitrogen)并將其與細胞在冰上于暗處孵育1小時，隨后用PBS洗滌三次。在FACscalibur中分析樣本。細胞表面結(jié)合顯示，F(xiàn)IT7-Ig和FIT8-Ig都以濃度依賴性方式能夠結(jié)合至細胞表面抗原CD3和CD20。相較于親本mAb的結(jié)合活性，F(xiàn)IT-Ig對于Jurkat細胞上的CD3顯示出較低的結(jié)合強度，而對Raji細胞上的CD20顯示出較強的結(jié)合強度。在所有結(jié)合研究中，F(xiàn)IT7-Ig和FIT8-Ig對于兩種抗原顯示類似的結(jié)合活性，表明連接子對于其結(jié)合FIT8-Ig的能力不造成顯著影響(表12)。表12.抗CD3/CD20FIT-Ig蛋白的細胞表面抗原結(jié)合研究實施例3：抗TNF/IL-17串聯(lián)Fab免疫球蛋白(FIT-Ig)的構(gòu)建、表達及純化同樣使用抗IL-17mAb克隆LY和抗TNFmAb戈利木單抗產(chǎn)生可結(jié)合至人IL-17和人TNFα(FIT9-Ig)的3-多肽構(gòu)建體形式的另一FIT-Ig，如圖1中所示。為了產(chǎn)生FIT9-Ig構(gòu)建體#1，將戈利木單抗的VL-CL與LY重鏈的N末端直接融合(如表13中所示)。構(gòu)建體#2是戈利木單抗的VH-CH1并且第3構(gòu)建體是LY的VL-CL。將FIT9-Ig的3種構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染到293細胞中，從而引起FIT9-Ig蛋白的表達和分泌?？筎NF/IL-17FIT-Ig的最終序列描述于表14中。實施例3.1抗TNF/IL-17FIT-Ig的分子克隆：分子克隆方法與有關(guān)抗hIL-17/hIL-20FIT-Ig的分子克隆方法類似。表13.抗TNF/IL-17FIT-Ig分子和構(gòu)建體表14：抗TNF/IL-17FIT-Ig分子的氨基酸序列表14：抗TNF/IL-17FIT-Ig分子的氨基酸序列表14：抗TNF/IL-17FIT-Ig分子的氨基酸序列表14：抗TNF/IL-17FIT-Ig分子的氨基酸序列實施例3.2抗TNF/IL-17FIT-Ig蛋白的表達、純化及分析將每一FIT-Ig的所有DNA構(gòu)建體都亞克隆到基于pBOS的載體中，并進行測序以確保準(zhǔn)確性。如先前所述，在293E細胞中，使用聚乙烯亞胺(PEI)對FIT9-Ig的構(gòu)建體#1、構(gòu)建體#2及構(gòu)建體#3進行短暫共表達，并利用蛋白質(zhì)A色譜法純化FIT9-Ig蛋白質(zhì)。表達水平是10-23mg/L。使用基于細胞的測定針對IL-17(通過Hs27細胞產(chǎn)生GROα)和TNF(通過L929細胞產(chǎn)生IL-8)對純化蛋白質(zhì)進行功能分析。FIT9-Ig針對人TNF的中和效力是11.6pM(與在相同實驗中由戈利木單抗引起的15.9pM相比)，而針對人IL-17的中和效力是122pM(與在相同實驗中由LY引起的51.5pM相比)。總體而言，F(xiàn)IT9-Ig保持了親本mAb的生物活性。實施例4：抗CTLA-4/PD-1串聯(lián)Fab免疫球蛋白(FIT-Ig)的構(gòu)建、表達及純化使用抗CTLA-4mAb伊匹單抗和抗PD-1mAb納武單抗產(chǎn)生可結(jié)合至人CTLA-4和人PD-1的呈3-多肽構(gòu)建體形式的另一FIT-Ig(FIT10-Ig)，如圖1中所示。為了產(chǎn)生FIT10-Ig構(gòu)建體#1，將伊匹單抗的VL-CL與納武單抗重鏈的N末端直接融合(如表15中所示)。構(gòu)建體#2是伊匹單抗的VH-CH1并且第3構(gòu)建體是納武單抗的VL-CL。將FIT10-Ig的3種構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染到293細胞中，從而引起FIT10-Ig蛋白表達和分泌。實施例4.1抗CTLA-4/PD-1FIT-Ig的分子克?。悍肿涌寺》椒ㄅc有關(guān)抗hIL-17/hIL-20FIT-Ig的分子克隆方法類似。抗CTLA-4/PD-1FIT-Ig的最終序列描述于表16中。表15.抗CTLA-4/PD-1FIT-Ig分子和構(gòu)建體。表16.抗CTLA-4/PD-1FIT-Ig分子的氨基酸序列表16.抗CTLA-4/PD-1FIT-Ig分子的氨基酸序列表16.抗CTLA-4/PD-1FIT-Ig分子的氨基酸序列表16.抗CTLA-4/PD-1FIT-Ig分子的氨基酸序列實施例4.2抗CTLA-4/PD-1FIT-Ig蛋白的表達、純化及功能分析：將每一FIT-Ig的所有DNA構(gòu)建體都亞克隆到基于pBOS的載體中，并進行測序以確保準(zhǔn)確性。如先前所述，在293E細胞中，使用聚乙烯亞胺(PEI)對FIT10-Ig的構(gòu)建體#1、構(gòu)建體#2及構(gòu)建體#3進行短暫共表達，并通過蛋白質(zhì)A色譜法將FIT9-Ig蛋白純化至98％單體完全蛋白。表達水平高達43mg/L。使用ELISA對純化的蛋白質(zhì)進行針對重組CTLA-4Ig和PD-1的結(jié)合分析。簡單地說，對于結(jié)合至CTLA-4，將人CTLA-4Ig(R&DSystems)固定于96孔板上，隨后進行常規(guī)洗滌和阻斷程序。接著，將各種濃度的FIT-10-Ig或伊匹單抗添加到板中，隨后是孵育和多次洗滌的步驟，并用抗人Fab–HRP進行檢測。對于結(jié)合至PD-1，將人PD-1(帶有his標(biāo)簽)(R&DSystems)固定于96孔板上，隨后進行常規(guī)洗滌和阻斷程序。接著，將各種濃度的FIT-10-Ig或納武單抗添加到板中，隨后是孵育和多次洗滌的步驟，并用抗人Fc–HRP進行檢測(圖6)。似乎FIT10-Ig能夠分別以與親本mAb伊匹單抗和納武單抗類似的活性分結(jié)合CTLA-4(A)和PD-1(B)。此外，使用OctetRed進行多抗原結(jié)合研究以確定FIT10-Ig是否能夠同時結(jié)合重組CTLA-4和PD-1。簡單地說，將濃度是10μg/ml的FIT10-Ig固定于AR2G傳感器上，隨后在測定緩沖液(PBSpH7.4，0.1％BSA，0.02％Tween)中依序結(jié)合CTLA-4Ig和PD-1(或先是PD-1，然后是CTLA-4Ig)，其中濃度是80nM。在實驗結(jié)束時，表面用pH1.5的10mM甘氨酸再生五次(圖7)。這一實驗顯示，F(xiàn)IT10-Ig當(dāng)已結(jié)合至CTLA-4時能夠結(jié)合PD-1，并且反之亦然，表明FIT10-Ig能夠同時結(jié)合CTLA-4Ig和PD-1。本說明書中引用的所有出版物、專利申請及頒布的專利以引用的方式并入本文中，就如同特定地并且個別地指示將每一個別出版物、專利申請或頒布的專利以引用的方式整體并入一般。當(dāng)前第1頁1 2 3 當(dāng)前第1頁1 2 3