本發(fā)明涉及一種標(biāo)準(zhǔn)化生物元件的設(shè)計(jì)和構(gòu)建方法及其應(yīng)用；特別涉及一種釀酒酵母中標(biāo)準(zhǔn)化生物元件的設(shè)計(jì)和構(gòu)建方法及其應(yīng)用，屬于基因工程、代謝工程及合成生物學(xué)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

隨著分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的發(fā)展，外源代謝途徑在大腸桿菌、酵母甚至是哺乳類細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)都已經(jīng)能夠?qū)崿F(xiàn)。雖然這些表達(dá)系統(tǒng)都已經(jīng)被廣泛的研究，但目前仍然存在很多不足。一方面，某一代謝產(chǎn)物的代謝途徑需要多基因協(xié)同作用，各基因常常需要不同程度的表達(dá)調(diào)控。例如，產(chǎn)酸克雷伯氏桿菌(Klebsiella oxytoca)內(nèi)的固氮途徑由20個(gè)基因組成，并且存在著很多未知的調(diào)控因子，因此很難構(gòu)建和優(yōu)化整個(gè)的外源代謝途徑。另一方面，雖然分子生物技術(shù)的發(fā)展使我們有能力在較短的時(shí)間內(nèi)合成大片段染色體，甚至整個(gè)基因組，但其所需要的花費(fèi)也是巨大的。Gibson assembly和Golden Gate assembly的實(shí)驗(yàn)技術(shù)可以滿足我們將小片段DNA合成大片段的部分要求，但是類似于大腸桿菌中BioBrick的標(biāo)準(zhǔn)化的組裝元件與合成策略不能直接應(yīng)用于酵母等真核微生物。

酵母作為一種安全的真核微生物，同時(shí)具有強(qiáng)大的同源重組系統(tǒng)，僅利用很小的同源序列，便可進(jìn)行準(zhǔn)確和高效的同源重組，從而可以更為快捷的進(jìn)行多基因、大片段DNA的組裝。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是設(shè)計(jì)和構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)化生物元件，將各標(biāo)準(zhǔn)化生物元件組裝成超大長(zhǎng)度的外源DNA片段，該外源DNA片段為多個(gè)基因組成的目的代謝途徑(具體可為某種目的產(chǎn)物合成途徑)，將該外源DNA片段同源重組到酵母染色體，通過(guò)對(duì)酵母中的目的產(chǎn)物的測(cè)定，優(yōu)化目的代謝途徑中各基因的啟動(dòng)子，以實(shí)現(xiàn)酵母中目的產(chǎn)物的最優(yōu)表達(dá)。

為了解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種標(biāo)準(zhǔn)化生物元件的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

(1)構(gòu)建目的基因載體組、啟動(dòng)子載體組和終止子載體組；

所述目的基因載體組由G種含有目的基因的載體組成，每種所述含有目的基因的載體均含有一種目的基因、兩個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶A位點(diǎn)、兩個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶B位點(diǎn)，所述目的基因位于所述兩個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶A位點(diǎn)之間，和所述目的基因位于所述兩個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶B位點(diǎn)之間；所述G為大于等于1的自然數(shù)，G的值為要體外組裝的目的代謝途徑的基因總數(shù)(如要體外組裝的目的代謝途徑是β-胡蘿卜素外源合成途徑，該β-胡蘿卜素外源合成途徑的基因是crtE基因、crtI基因和crtYB基因,該β-胡蘿卜素外源合成途徑的基因總數(shù)是3，即G為3)；所述目的基因?yàn)橐w外組裝的目的代謝途徑的基因，每種所述含有目的基因的載體中所含有的目的基因均不同；

所述啟動(dòng)子載體組由P種含有啟動(dòng)子的載體組成，每種所述含有啟動(dòng)子的載體均含有一種目的啟動(dòng)子、所述兩個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶A位點(diǎn)、所述兩個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶B位點(diǎn)，所述目的啟動(dòng)子位于所述兩個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶A位點(diǎn)之間，和所述目的啟動(dòng)子位于所述兩個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶B位點(diǎn)之間；所述P為大于等于1的自然數(shù)，具體為大于等于2的自然數(shù)，P的值本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)需要選擇，如可以大于等于要體外組裝的目的代謝途徑的基因總數(shù)，也可以小于等于要體外組裝的目的代謝途徑的基因總數(shù)，每種所述含有啟動(dòng)子的載體中所含有的目的啟動(dòng)子均不同；

所述終止子載體組由T種含有終止子的載體組成，每種所述含有終止子的載體均含有一 種目的終止子、所述兩個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶A位點(diǎn)、所述兩個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶B位點(diǎn)，所述目的終止子位于所述兩個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶A位點(diǎn)之間，和所述目的終止子位于所述兩個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶B位點(diǎn)之間；所述T為大于等于1的自然數(shù)，T的值本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)需要選擇，如可以大于等于要體外組裝的目的代謝途徑的基因總數(shù)，也可以小于等于要體外組裝的目的代謝途徑的基因總數(shù)，每種所述含有終止子的載體中所含有的目的終止子均不同；

所述限制性核酸內(nèi)切酶A位點(diǎn)和所述限制性核酸內(nèi)切酶B位點(diǎn)中的所述“位點(diǎn)”包含其識(shí)別位點(diǎn)和切割位點(diǎn)；

(2)用所述限制性核酸內(nèi)切酶B酶切所述啟動(dòng)子載體組的載體，得到含有目的啟動(dòng)子的片段；用所述限制性核酸內(nèi)切酶B酶切所述目的基因載體組的載體，得到含有目的基因的片段；用所述限制性核酸內(nèi)切酶B酶切所述終止子載體組的載體，得到含有目的終止子的片段；

(3)將所述含有目的啟動(dòng)子的片段中的一種片段、所述含有目的基因的片段中的一種片段和所述含有目的終止子的片段中的一種片段按照上游至下游方向依次連接得到一種目的基因表達(dá)盒，該一種所述目的基因表達(dá)盒為一種標(biāo)準(zhǔn)化生物元件。

按照該方法連接共可得到P×G×T種目的基因表達(dá)盒，即P×G×T種標(biāo)準(zhǔn)化生物元件；

所述限制性核酸內(nèi)切酶A和所述限制性核酸內(nèi)切酶B為不同種II型限制性核酸內(nèi)切酶，具體為不同種II_S型限制性核酸內(nèi)切酶。

上述方法中，所述限制性核酸內(nèi)切酶A為限制性核酸內(nèi)切酶BsaI；

所述限制性核酸內(nèi)切酶B為限制性核酸內(nèi)切酶BsmBI或Esp3I；

所述目的基因載體組的含有目的基因的載體的構(gòu)建包括如下步驟：用一種所述目的基因替換HCkan-O的兩個(gè)BsaI位點(diǎn)間的片段(兩個(gè)BsaI位點(diǎn)間的較小片段)，HCkan-O的其余序列保持不變，得到一種所述含有目的基因的載體；

所述HCkan-O為一種環(huán)狀載體，其序列如由序列分別如SEQ ID No.6和SEQ ID No.15所示的DNA分子首尾連接得到的環(huán)狀載體的序列所示；

所述啟動(dòng)子載體組的含有啟動(dòng)子的載體的構(gòu)建包括如下步驟：用一種所述目的啟動(dòng)子替換HCkan-P的兩個(gè)BsaI位點(diǎn)間的片段(兩個(gè)BsaI位點(diǎn)間的較小片段)，HCkan-P的其余序列保持不變，得到一種所述含有啟動(dòng)子的載體；

所述HCkan-P為一種環(huán)狀載體，其序列如由序列分別如SEQ ID No.3和SEQ ID No.12所示的DNA分子首尾連接得到的環(huán)狀載體的序列所示；

所述終止子載體組的含有終止子的載體的構(gòu)建包括如下步驟：用一種所述終止子替換HCkan-T的兩個(gè)BsaI位點(diǎn)間的片段(兩個(gè)BsaI位點(diǎn)間的較小片段)，HCkan-T的其余序列保持不變，得到一種所述含有終止子的載體；

所述HCkan-T為一種環(huán)狀載體，其序列如由序列分別如SEQ ID No.9和SEQ ID No.18所示的DNA分子首尾連接得到的環(huán)狀載體的序列所示。

為了解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明還提供POT重組載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

1)按照上述任一所述的方法制備標(biāo)準(zhǔn)化生物元件和制備POT載體組；

所述POT載體組由兩種以上(2種-P×G×T種)POT載體組成，每種所述POT載體含有所述的限制性核酸內(nèi)切酶A位點(diǎn)和所述的限制性核酸內(nèi)切酶B位點(diǎn)；

2)用一種所述標(biāo)準(zhǔn)化生物元件替換所述POT載體組的一種POT載體的所述兩個(gè)限制性核 酸內(nèi)切酶B位點(diǎn)間的片段(兩個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶B位點(diǎn)間的較小片段)，POT載體的其余序列保持不變，得到一種POT重組載體；

不同種所述標(biāo)準(zhǔn)化生物元件替換所述POT載體組的不同種POT載體；

所述不同種POT載體用于接收不同種所述標(biāo)準(zhǔn)化生物元件；

具體地，所述POT載體組包括如下1)-11)所示的質(zhì)粒中的至少一種：

1)POT1質(zhì)粒，該質(zhì)粒的序列如SEQ ID No.21所示；

2)POT2質(zhì)粒，該質(zhì)粒的大小為5987bp，該質(zhì)粒的第3122位至第3143位的序列如SEQ ID No.22所示，第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.23所示，第1位至第2070位的序列與SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同，第2093位至第3121位的序列與SEQ ID No.21的第2093位至第3121位的序列相同，第3144位至第5987位的序列與SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同；

3)POT3質(zhì)粒，該質(zhì)粒的大小為5987bp，該質(zhì)粒的第3122位至第3143位的序列如SEQ ID No.24所示，第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.25所示，第1位至第2070位的序列與SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同，第2093位至第3121位的序列與SEQ ID No.21的第2093位至第3121位的序列相同，第3144位至第5987位的序列與SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同；

4)POT4質(zhì)粒，該質(zhì)粒的大小為5987bp，該質(zhì)粒的第3122位至第3143位的序列如SEQ ID No.26所示，第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.27所示，第1位至第2070位的序列與SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同，第2093位至第3121位的序列與SEQ ID No.21的第2093位至第3121位的序列相同，第3144位至第5987位的序列與SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同；

5)POT5質(zhì)粒，該質(zhì)粒的大小為5987bp，該質(zhì)粒的第3122位至第3143位的序列如SEQ ID No.28所示，第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.29所示，第1位至第2070位的序列與SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同，第2093位至第3121位的序列與SEQ ID No.21的第2093位至第3121位的序列相同，第3144位至第5987位的序列與SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同；

6)POT6質(zhì)粒，該質(zhì)粒的大小為5987bp，該質(zhì)粒的第3122位至第3143位的序列如SEQ ID No.30所示，第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.31所示，第1位至第2070位的序列與SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同，第2093位至第3121位的序列與SEQ ID No.21的第2093位至第3121位的序列相同，第3144位至第5987位的序列與SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同；

7)POT7質(zhì)粒，該質(zhì)粒的大小為5987bp，該質(zhì)粒的第3122位至第3143位的序列如SEQ ID No.32所示，第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.33所示，第1位至第2070位的序列與SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同，第2093位至第3121位的序列與SEQ ID No.21的第2093位至第3121位的序列相同，第3144位至第5987位的序列與SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同；

8)POT8質(zhì)粒，該質(zhì)粒的大小為5987bp，該質(zhì)粒的第3122位至第3143位的序列如SEQ ID No.34所示，第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.35所示，第1位至第2070位的序列與SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同，第2093位至第3121位的序列與SEQ ID No.21的第2093位至第3121位的序列相同，第3144位至第5987位的序列與SEQ ID No.21 的第3144位至第5987位的序列相同；

9)POT9質(zhì)粒，該質(zhì)粒的大小為5987bp，該質(zhì)粒的第3122位至第3143位的序列如SEQ ID No.36所示，第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.37所示，第1位至第2070位的序列與SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同，第2093位至第3121位的序列與SEQ ID No.21的第2093位至第3121位的序列相同，第3144位至第5987位的序列與SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同；

10)POT10質(zhì)粒，該質(zhì)粒的大小為5987bp，該質(zhì)粒的第3122位至第3143位的序列如SEQ ID No.38所示，第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.39所示，第1位至第2070位的序列與SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同，第2093位至第3121位的序列與SEQ ID No.21的第2093位至第3121位的序列相同，第3144位至第5987位的序列與SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同；

11)POT11質(zhì)粒，該質(zhì)粒的大小為5987bp，該質(zhì)粒的第3122位至第3143位的序列如SEQ ID No.40所示，第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.41所示，第1位至第2070位的序列與SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同，第2093位至第3121位的序列與SEQ ID No.21的第2093位至第3121位的序列相同，第3144位至第5987位的序列與SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同。

為了解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明還提供一種將標(biāo)準(zhǔn)化生物元件體外組裝成目的代謝途徑的方法，包括如下步驟：將序列兩端分別帶有粘性末端的同源重組位點(diǎn)的5’同源臂、序列兩端分別帶有粘性末端的各標(biāo)準(zhǔn)化生物元件、序列兩端分別帶有粘性末端的選擇標(biāo)記基因、序列兩端分別帶有粘性末端的同源重組位點(diǎn)的3’同源臂按照上游至下游方向依次通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)連接組裝成目的代謝途徑；

或，

將所述序列兩端分別帶有粘性末端的同源重組位點(diǎn)的5’同源臂、所述序列兩端分別帶有粘性末端的選擇標(biāo)記基因、所述序列兩端分別帶有粘性末端的各標(biāo)準(zhǔn)化生物元件、所述序列兩端分別帶有粘性末端的同源重組位點(diǎn)的3’同源臂按照上游至下游方向依次通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)連接組裝成目的代謝途徑；

所述序列兩端分別帶有粘性末端的各標(biāo)準(zhǔn)化生物元件為用權(quán)利要求1或2所述的限制性核酸內(nèi)切酶A酶切由權(quán)利要求3所述的方法制備的POT重組載體得到；

所述各標(biāo)準(zhǔn)化生物元件包含的目的基因總數(shù)為要體外組裝的目的代謝途徑的基因總數(shù)，每種所述各標(biāo)準(zhǔn)化生物元件包含的目的基因均不同，所述各標(biāo)準(zhǔn)化生物元件連接得到所述目的代謝途徑的完整的基因片段；

所述選擇標(biāo)記基因用于篩選將所述目的代謝途徑同源重組到宿主菌染色體后得到的重組菌；

所述同源重組位點(diǎn)具體為酵母菌的同源重組位點(diǎn)；

所述選擇標(biāo)記基因具體為酵母菌的選擇標(biāo)記基因，再具體為酵母的營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記基因，可為TRP1基因或LEU2基因或HIS3基因；

所述同源重組位點(diǎn)的5’同源臂的序列具體如SEQ ID No.54中第168位至第667位所示；

所述同源重組位點(diǎn)的3’同源臂的序列具體如SEQ ID No.55中第168位至第667位所示；

所述LEU2基因的序列如SEQ ID No.56中第168位至第2448位所示。

上述任一所述的方法中，所述標(biāo)準(zhǔn)化生物元件包含的目的基因?yàn)棣?胡蘿卜素外源合成 途徑的基因中的一種；

所述標(biāo)準(zhǔn)化生物元件中的啟動(dòng)子為TDH3啟動(dòng)子、ADH1啟動(dòng)子、CYC1啟動(dòng)子和TEF2啟動(dòng)子中的一種；

所述標(biāo)準(zhǔn)化生物元件中的終止子為TEF1終止子、ADH1終止子和TEF2終止子中的一種；

所述同源重組位點(diǎn)為酵母的HO位點(diǎn)；

所述酵母具體為JDY52，該酵母為BY4727和BY4733交配后形成二倍體菌株產(chǎn)孢得到的單倍體菌株，其基因型為MATa,his3Δ 200 leu2Δ 0 lys2Δ 0 trp1Δ 63 ura3Δ 0 met15Δ 0；JDY52的HO位點(diǎn)被所述目的代謝途徑取代后的基因型為MATa,his3Δ 200 leu2Δ 0 lys2Δ 0trp1Δ 63 ura3Δ 0 met15Δ 0 ho::URR1-marker-URR2,其中URR1-marker-URR2為所述目的代謝途徑；

所述crtE基因、所述crtI基因和所述crtYB基因在所述目的代謝途徑的5’-3’方向的排列順序?yàn)閏rtE基因、crtI基因、crtYB基因。

上述方法中，所述β-胡蘿卜素外源合成途徑的基因?yàn)閏rtE基因、crtI基因和crtYB基因；

所述crtE基因的序列具體如SEQ ID No.48中第168位至第1298位所示；

所述crtI基因的序列具體如SEQ ID No.50中第168位至第1916位所示；

所述crtYB基因的序列具體如SEQ ID No.52中第168位至第2198位所示；

所述TDH3啟動(dòng)子的序列如SEQ ID No.42所示；

所述ADH1啟動(dòng)子的序列如SEQ ID No.43所示；

所述CYC1啟動(dòng)子的序列如SEQ ID No.57所示；

所述TEF2啟動(dòng)子的序列如SEQ ID No.44所示；

所述TEF1終止子的序列如SEQ ID No.45所示；

所述ADH1終止子的序列如SEQ ID No.46所示；

所述TEF2終止子的序列如SEQ ID No.47所示；

所述序列兩端分別帶有粘性末端的同源重組位點(diǎn)的5’同源臂為用上述任一所述的限制性核酸內(nèi)切酶B酶切PMV-URR1得到，所述PMV-URR1的序列如SEQ ID No.54所示；

所述序列兩端分別帶有粘性末端的選擇標(biāo)記基因?yàn)橛蒙鲜鋈我凰龅南拗菩院怂醿?nèi)切酶B酶切PMV-selective marker得到，所述PMV-selective marker的序列如SEQ ID No.56所示；

所述序列兩端分別帶有粘性末端的同源重組位點(diǎn)的3’同源臂為用上述任一所述的限制性核酸內(nèi)切酶B酶切PMV-URR2得到，所述PMV-URR2的序列如SEQ ID No.55所示。

為了解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明還提供一種對(duì)目的代謝途徑進(jìn)行優(yōu)化的方法，包括如下步驟：

1)按照上述任一所述的方法體外組裝目的代謝途徑；

2)將一種所述目的代謝途徑同源重組到宿主菌的染色體中，得到含有一種目的代謝途徑的一種重組菌，根據(jù)重組菌中目的產(chǎn)物的產(chǎn)量?jī)?yōu)化目的代謝途徑，目的產(chǎn)物產(chǎn)量高的重組菌中的目的代謝途徑優(yōu)于目的產(chǎn)物產(chǎn)量低的重組菌中的目的代謝途徑；

所述目的代謝途徑中的目的基因的啟動(dòng)子導(dǎo)致所述目的產(chǎn)物的產(chǎn)量不同；

所述目的代謝途徑具體為目的產(chǎn)物合成途徑，再具體為β-胡蘿卜素外源合成途徑；

所述目的產(chǎn)物具體為β-胡蘿卜素；

所述宿主菌具體為酵母，再具體為JDY52酵母，該酵母為BY4727和BY4733交配后形成二倍體菌株產(chǎn)孢得到的單倍體菌株，其基因型為MATa,his3Δ 200 leu2Δ 0 lys2Δ 0 trp1Δ 63ura3Δ 0 met15Δ 0；

為了解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明還提供如下A-C任一所示的產(chǎn)品：

A、上述任一所述的方法制備得到的標(biāo)準(zhǔn)化生物元件；

B、上述任一所述的方法制備得到的POT重組載體；

C、上述任一所述的方法制備得到的目的代謝途徑。

為了解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明還提供如下D-N任一所示的產(chǎn)品：

D、HCkan-P質(zhì)粒，該質(zhì)粒的序列如由序列分別如SEQ ID No.3和SEQ ID No.12所示的DNA分子首尾連接得到的環(huán)狀載體的序列所示；

E、HCKan-O質(zhì)粒，該質(zhì)粒的序列如由序列分別如SEQ ID No.6和SEQ ID No.15所示的DNA分子首尾連接得到的環(huán)狀載體的序列所示；

F、HCkan-T質(zhì)粒，該質(zhì)粒的序列如由序列分別如SEQ ID No.9和SEQ ID No.18所示的DNA分子首尾連接得到的環(huán)狀載體的序列所示；

G、POT質(zhì)粒，該質(zhì)粒為如下1)-11)所示的質(zhì)粒中的任一種：

1)POT1質(zhì)粒，該質(zhì)粒的序列如SEQ ID No.21所示；

2)POT2質(zhì)粒，該質(zhì)粒的大小為5987bp，該質(zhì)粒的第3122位至第3143位的序列如SEQ ID No.22所示，第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.23所示，第1位至第2070位的序列與SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同，第2093位至第3121位的序列與SEQ ID No.21的第2093位至第3121位的序列相同，第3144位至第5987位的序列與SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同；

3)POT3質(zhì)粒，該質(zhì)粒的大小為5987bp，該質(zhì)粒的第3122位至第3143位的序列如SEQ ID No.24所示，第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.25所示，第1位至第2070位的序列與SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同，第2093位至第3121位的序列與SEQ ID No.21的第2093位至第3121位的序列相同，第3144位至第5987位的序列與SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同；

4)POT4質(zhì)粒，該質(zhì)粒的大小為5987bp，該質(zhì)粒的第3122位至第3143位的序列如SEQ ID No.26所示，第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.27所示，第1位至第2070位的序列與SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同，第2093位至第3121位的序列與SEQ ID No.21的第2093位至第3121位的序列相同，第3144位至第5987位的序列與SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同；

5)POT5質(zhì)粒，該質(zhì)粒的大小為5987bp，該質(zhì)粒的第3122位至第3143位的序列如SEQ ID No.28所示，第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.29所示，第1位至第2070位的序列與SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同，第2093位至第3121位的序列與SEQ ID No.21的第2093位至第3121位的序列相同，第3144位至第5987位的序列與SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同；

6)POT6質(zhì)粒，該質(zhì)粒的大小為5987bp，該質(zhì)粒的第3122位至第3143位的序列如SEQ ID No.30所示，第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.31所示，第1位至第2070位的序列與SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同，第2093位至第3121位的序列與SEQ ID No.21的第2093位至第3121位的序列相同，第3144位至第5987位的序列與SEQ ID No.21 的第3144位至第5987位的序列相同；

7)POT7質(zhì)粒，該質(zhì)粒的大小為5987bp，該質(zhì)粒的第3122位至第3143位的序列如SEQ ID No.32所示，第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.33所示，第1位至第2070位的序列與SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同，第2093位至第3121位的序列與SEQ ID No.21的第2093位至第3121位的序列相同，第3144位至第5987位的序列與SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同；

8)POT8質(zhì)粒，該質(zhì)粒的大小為5987bp，該質(zhì)粒的第3122位至第3143位的序列如SEQ ID No.34所示，第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.35所示，第1位至第2070位的序列與SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同，第2093位至第3121位的序列與SEQ ID No.21的第2093位至第3121位的序列相同，第3144位至第5987位的序列與SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同；

9)POT9質(zhì)粒，該質(zhì)粒的大小為5987bp，該質(zhì)粒的第3122位至第3143位的序列如SEQ ID No.36所示，第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.37所示，第1位至第2070位的序列與SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同，第2093位至第3121位的序列與SEQ ID No.21的第2093位至第3121位的序列相同，第3144位至第5987位的序列與SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同；

10)POT10質(zhì)粒，該質(zhì)粒的大小為5987bp，該質(zhì)粒的第3122位至第3143位的序列如SEQ ID No.38所示，第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.39所示，第1位至第2070位的序列與SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同，第2093位至第3121位的序列與SEQ ID No.21的第2093位至第3121位的序列相同，第3144位至第5987位的序列與SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同；

11)POT11質(zhì)粒，該質(zhì)粒的大小為5987bp，該質(zhì)粒的第3122位至第3143位的序列如SEQ ID No.40所示，第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.41所示，第1位至第2070位的序列與SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同，第2093位至第3121位的序列與SEQ ID No.21的第2093位至第3121位的序列相同，第3144位至第5987位的序列與SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同。H、PMV-URR1質(zhì)粒，該質(zhì)粒的序列如SEQ ID No.54所示；

H、PMV-URR1質(zhì)粒，該質(zhì)粒的序列如SEQ ID No.54所示；

I、PMV-URR2質(zhì)粒，該質(zhì)粒的序列如SEQ ID No.55所示；

J、PMV-selective marker質(zhì)粒，該質(zhì)粒的序列如SEQ ID No.56所示；

K、一種重組菌，該重組菌是將上述C同源重組到宿主菌的染色體中得到的含有所述目的代謝途徑的重組菌；

所述宿主菌具體為酵母，再具體為JDY52酵母，該酵母為BY4727和BY4733交配后形成二倍體菌株產(chǎn)孢得到的單倍體菌株，其基因型為MATa,his3Δ 200 leu2Δ 0 lys2Δ 0 trp1Δ 63ura3Δ 0 met15Δ 0；

L、SEQ ID No.48中第168位至第1298位所示的DNA或cDNA分子；

M、SEQ ID No.50中第168位至第1916位所示的DNA或cDNA分子；

N、SEQ ID No.52中第168位至第2198位所示的DNA或cDNA分子；

O、一種試劑盒，包括所述D、E和F所示的產(chǎn)品；

上述試劑盒中，所述試劑盒還包括所述G所示的產(chǎn)品；

上述任一所述的試劑盒中，所述試劑盒還包含限制性核酸內(nèi)切酶BsaI和/或如下1)或2)所示的限制性核酸內(nèi)切酶中的一種：

1)限制性核酸內(nèi)切酶BsmBI；

2)限制性核酸內(nèi)切酶Esp3I。

為了解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明還提供上述任一所述的產(chǎn)品在合成目的產(chǎn)物中的應(yīng)用；

所述目的產(chǎn)物具體為β-胡蘿卜素。

本發(fā)明針對(duì)啟動(dòng)子，目的代謝途徑(具體可為某種目的產(chǎn)物合成途徑)中的基因以及終止子元件，相應(yīng)構(gòu)建了三種不同的載體HCkan-P、HCkan-O和HCkan-T，該3種載體是在pSMART HCKan的基礎(chǔ)上，將RFP基因(帶有細(xì)菌lac啟動(dòng)子和rrnB T1終止子)插入到該質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)得到的，并在RFP基因兩端設(shè)計(jì)加入BsaI和BsmBI識(shí)別位點(diǎn)，其中BsaI識(shí)別位點(diǎn)可用于將啟動(dòng)子、基因、終止子分別構(gòu)建到相應(yīng)的載體HCkan-P、HCkan-O和HCkan-T上，BsmBI識(shí)別位點(diǎn)可用于將啟動(dòng)子、基因、終止子一起構(gòu)建到下游POT載體上，HCkan-P、HCkan-O和HCkan-T都具有卡那霉素抗性。用于接收啟動(dòng)子、基因和終止子的POT載體是對(duì)酵母中常用的pRS416載體進(jìn)行改造，去除所有的BsaI和BsmBI酶切位點(diǎn)，并將RFP基因構(gòu)建到質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)，并在兩端引入BsaI和BsmBI識(shí)別位點(diǎn)，其中BsmBI用于將啟動(dòng)子、基因、終止子一起構(gòu)建到相應(yīng)的POT載體上，BsaI用于釋放構(gòu)建在POT載體上的“啟動(dòng)子-基因-終止子”的“轉(zhuǎn)錄調(diào)控單元(標(biāo)準(zhǔn)化生物元件)”，使其能夠帶有固定黏性末端，用于在體外按照設(shè)計(jì)連接成超大長(zhǎng)度的外源DNA片段，將其轉(zhuǎn)化進(jìn)入酵母體內(nèi)，同源重組到酵母染色體獲得不同表達(dá)效率的酵母菌株。通過(guò)對(duì)這些菌株中目的產(chǎn)物的分析，獲取具有生產(chǎn)潛力的高產(chǎn)菌株。

本發(fā)明基于酵母系統(tǒng)設(shè)計(jì)和構(gòu)建了一系列標(biāo)準(zhǔn)化生物元件，利用II型限制性內(nèi)切酶，可將各標(biāo)準(zhǔn)化生物元件組裝成超大長(zhǎng)度的外源DNA片段，該外源DNA片段是由多個(gè)基因組成的目的代謝途徑(具體可為某種目的產(chǎn)物合成途徑)，將該片段通過(guò)同源重組整合到酵母染色體特定位點(diǎn)上，進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)，可實(shí)現(xiàn)目的產(chǎn)物的酵母內(nèi)異源合成，并且可以通過(guò)優(yōu)化目的代謝途徑(具體可為某種目的產(chǎn)物合成途徑)中各基因的啟動(dòng)子實(shí)現(xiàn)目的產(chǎn)物的最優(yōu)表達(dá)，本發(fā)明在目的代謝途徑(具體可為某種目的產(chǎn)物合成途徑)的優(yōu)化過(guò)程中具有獨(dú)到的優(yōu)勢(shì)和重要的意義。

附圖說(shuō)明

圖1為載體HCKan-P/O/T構(gòu)建圖譜。

圖2為載體POT1-11構(gòu)建圖譜。

圖3為β-胡蘿卜素途徑的體外連接組裝成的大片段。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明的各個(gè)方面進(jìn)行各種適當(dāng)?shù)男薷暮透倪M(jìn)，這些修改和改進(jìn)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。例如將實(shí)施例中所使用的標(biāo)記基因更改為其他標(biāo)記，將生物元件接收載體及POT載體中酶切所得黏性末端更改為新的序列，是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所能夠理解并實(shí)現(xiàn)的。

pSMART HCKan為L(zhǎng)ucigen公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)為40704-2。

pRS416在文獻(xiàn)“Robert S.Sikorski,Philip Hieter,A System of Shuttle Vectors and Yeast Host Strains Designed for Efficient Manipulation of DNA in Saccharomyces ceratisiae.Genetics,1989,122:19-27.”中公開過(guò)，公眾可從清華大學(xué)獲得。

釀酒酵母BY4741(Saccharomyces cerevisiae BY4741)在文獻(xiàn)“Brachmann CB,Davies A,Cost GJ,Caputo E,Li J,Hieter P,Boeke JD.Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C:a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications.Yeast,1998,14(2):115-32.”中公開過(guò)，公眾可從清華大學(xué)獲得。

下述實(shí)施例中的限制性核酸內(nèi)切酶BsmBI可以替換為Esp3I。

實(shí)施例1、HCkan-P、HCkan-O和HCkan-T的構(gòu)建

一、以pSMART HCKan為模板，以SEQ ID No.1和SEQ ID No.2為引物，使用超保真DNA聚合酶Q5酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增(PCR程序：94℃3min；94℃30s,55℃30s，72℃40s，30個(gè)循環(huán)；72℃7min；4℃+∞)，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，BsaI酶切該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得載體大片段1，載體大片段1的序列如SEQ ID No.3所示。

將引物替換為SEQ ID No.4和SEQ ID No.5，其余實(shí)驗(yàn)步驟與上述實(shí)驗(yàn)步驟相同，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，BsaI酶切該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得到載體大片段2，載體大片段2的序列如SEQ ID No.6所示。

將引物替換為SEQ ID No.7和SEQ ID No.8，其余實(shí)驗(yàn)步驟與上述實(shí)驗(yàn)步驟相同，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，BsaI酶切該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得到載體大片段3，載體大片段3的序列如SEQ ID No.9所示。

二、以合成的pMV－RFP為模板，以SEQ ID No.10和SEQ ID No.11為引物，使用超保真DNA聚合酶Q5酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增(PCR程序：94℃3min；94℃30s,55℃30s，72℃20s，30個(gè)循環(huán)；72℃7min；4℃+∞)，得到1160bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，BsmBI酶切該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得RFP基因片段1，RFP基因片段1的序列如SEQ ID No.12所示。

將引物替換為SEQ ID No.13和SEQ ID No.14，其余實(shí)驗(yàn)步驟與上述實(shí)驗(yàn)步驟相同，得到1160bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，BsmBI酶切該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得RFP基因片段2，RFP基因片段2的序列如SEQ ID No.15所示。

將引物替換為SEQ ID No.16和SEQ ID No.17，其余實(shí)驗(yàn)步驟與上述實(shí)驗(yàn)步驟相同，得到1182bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，BsmBI酶切該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得RFP基因片段3，RFP基因片段3的序列如SEQ ID No.18所示。

各RFP基因片段中RFP基因序列如SEQ ID No.19所示。

各RFP基因片段中在RFP基因上游帶有細(xì)菌lac啟動(dòng)子(5’-tttacacttt atgcttccgg ctcgtatgtt g-3’)，在RFP基因下游帶有rrnB T1終止子(5’-caaataaaac gaaaggctca gtcgaaagac tgggcctttc gtttta-3’)。

三、將載體大片段1與RFP基因片段1連接得到重組質(zhì)粒1，將其命名為HCkan-P；將載體大片段2與RFP基因片段2連接得到重組質(zhì)粒2，將其命名為HCkan-O；將載體大片段3與RFP基因片段3連接得到重組質(zhì)粒3，將其命名為HCkan-T。將HCkan-P、HCkan-O和HCkan-T送測(cè)序，結(jié)果正確。

HCkan-P、HCkan-O和HCkan-T構(gòu)建圖譜如圖1所示。

實(shí)施例2、POT1-11的構(gòu)建

一、酵母載體pRS416上BsaI和BsmBI位點(diǎn)的去除

以pRS416為模板，以F1和R1為引物，使用超保真DNA聚合酶Q5酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增(PCR程序：94℃3min；94℃30s,55℃30s，72℃30s，30個(gè)循環(huán)；72℃7min；4℃+∞)，得到2426bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，BsaI酶切該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得基因片段A。

將引物替換為F2和R2，其余實(shí)驗(yàn)步驟與上述實(shí)驗(yàn)步驟相同，得到1484bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，BsaI酶切該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得基因片段B。

將引物替換為F3和R3，其余實(shí)驗(yàn)步驟與上述實(shí)驗(yàn)步驟相同，得到1054bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，BsaI酶切該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得基因片段C。

將基因片段A、基因片段B、基因片段C連接得到去除BsaI和BsmBI后的pRS416載體。

F1：5’-ccggtgagcg tgggtctcgt agtcgcggta tcattgcag-3’；

R1：5’-tgatgtggtc tcacagtata gaaccgtgga tgatgtggtg tctacaggat ctg-3’；

F2：5’-ctgcaatgat accgcggtct cgactaccac gctcaccgg-3’；

R2：5’-cagaggggtc tcttttcacc gtcatcaccg aaacgcgcga gattaaaggg cctcgtg-3’；

F3：5’-cggggtctct gaaaacctct gacacatgca gctcccggag attgtcacag cttgtct-3’；

R3：5’-agcgtgggtc tctactgttg acccaatgcg tcacccttgt catctaaacc c-3’。

二、多克隆位點(diǎn)的改造

NotI和XhoI雙酶切SEQ ID No.20所示的DNA分子，得到基因片段D；NotI和XhoI雙酶切步驟一制備的去除BsaI和BsmBI后的pRS416載體，得到載體大片段D；將基因片段D與載體大片段D連接，得到重組質(zhì)粒，該質(zhì)粒為多克隆位點(diǎn)改造的pRS416載體。

三、RFP基因的插入

以合成的pMV－RFP為模板，以F4和R4為引物，使用超保真DNA聚合酶Q5酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增(PCR程序：94℃3min；94℃30s,55℃30s，72℃20s，30個(gè)循環(huán)；72℃7min；4℃+∞)，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，BsmBI酶切該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得RFP基因片段4。

F4：5’-gcggctagag acggcaatac gcaaaccgcc tct-3’；

R4：5’-cagaggtgag acgctctagt agagagcgtt caccg-3’。

BsmBI酶切步驟二制備的多克隆位點(diǎn)改造的pRS416載體，得到載體大片段4；將RFP基因片段4與載體大片段4連接，得到重組質(zhì)粒，將其命名為POT1，將POT1送測(cè)序，結(jié)果正確。POT1的序列如SEQ ID No.21所示。

將表1所示的POT1質(zhì)粒中的待替換序列替換為表1所示的相應(yīng)序列，得到對(duì)應(yīng)的POT質(zhì)粒，比如將POT1質(zhì)粒中第3122位至第3143位的序列“5’-GGTCTCtACCTggctaGAGACG-3’”替換為“5’-GGTCTCtAGGCggctaGAGACG-3’”，并將POT1質(zhì)粒中第2071位至第2092位的序列“5’-CGTCTCacctcTGAGaGAGACC-3’”替換為“5’-CGTCTCacctcTGGCaGAGACC-3’”，得到質(zhì)粒POT4。POT2、POT3,POT5-POT 11質(zhì)粒按照類似的方法，將POT1質(zhì)粒的兩段序列通過(guò)表1所示的相應(yīng)替換得到。

表1 POT質(zhì)粒的序列替換

載體POT1-11構(gòu)建圖譜如圖2所示。

實(shí)施例3、體外快速組裝β-胡蘿卜素外源合成途徑

一、含有啟動(dòng)子的各質(zhì)粒HCKan-P-TDH3、HCKan-P-ADH1、HCKan-P-TEF2的構(gòu)建

(一)TDH3啟動(dòng)子、ADH1啟動(dòng)子和TEF2啟動(dòng)子的獲得

提取酵母BY4741的基因組DNA，以其為模板，以F5和R5為引物，使用超保真DNA聚合酶Q5酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增(PCR程序：94℃3min；94℃30s,55℃30s，72℃40s，30個(gè)循環(huán)；72℃7min；4℃+∞)，得到687bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物a1，該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)物含有TDH3啟動(dòng)子，TDH3啟動(dòng)子的序列如SEQ ID No.42所示。

F5：5’-agcgtgggtc tcgggcttca ttatcaatac tgccatttca aagaatacg-3’；

R5：5’-gtgctgggtc tcacatcttt gtttgtttat gtgtgtttat tcgaaact-3’。

將引物替換為F6和R6，其余實(shí)驗(yàn)步驟與上述實(shí)驗(yàn)步驟相同，得到519bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物b1，該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)物含有ADH1啟動(dòng)子，ADH1啟動(dòng)子的序列如SEQ ID No.43所示。

F6：5’-agcgtgggtc tcgggctact gtagccctag acttgatagc c-3’；

R6：5’-gtgctgggtc tcacatcgta tatgagatag ttgatt-3’。

將引物替換為F7和R7，其余實(shí)驗(yàn)步驟與上述實(shí)驗(yàn)步驟相同，得到519bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物c1，該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)物含有TEF2啟動(dòng)子，TEF2啟動(dòng)子的序列如SEQ ID No.44所示。

F7：5’-agcgtgggtc tcgggctggg cgccataacc aaggtat-3’；

R7：5’-gtgctgggtc tcacatcttt agttaattat agttcgttga ccg-3’。

(二)建立10μL酶切連接反應(yīng)

反應(yīng)體系：1μL 10x T4 ligase buffer,0.1μL 100x BSA,10ng HCKan-P,2μL步驟(一)得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物a1、b1或c1,4U BsaI(NEB),0.5U T4DNA ligase(Thermo Scientific)。

反應(yīng)條件：37℃，60min；55℃，15min；80℃，15min；10℃，+∞。

利用上述方法將TDH3啟動(dòng)子、ADH1啟動(dòng)子和TEF2啟動(dòng)子分別克隆到載體HCKan-P，得到HCKan-P-TDH3、HCKan-P-ADH1、HCKan-P-TEF2。

以上酶切連接反應(yīng)的原理如下：BsaI酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物a1，得到基因片段a1；BsaI酶切HCkan-P，得到載體大片段；將基因片段a1與載體大片段連接，得到重組質(zhì)粒，將其命名為HCKan-P-TDH3；

BsaI酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物b1，得到基因片段b1；BsaI酶切HCkan-P，得到載體大片段；將基因片段b1與載體大片段連接，得到重組質(zhì)粒，將其命名為HCKan-P-HCKan-P-ADH1；

BsaI酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物c1，得到基因片段c1；BsaI酶切HCkan-P，得到載體大片段；將基因片段c1與載體大片段連接，得到重組質(zhì)粒，將其命名為HCKan-P-TEF2。

將HCKan-P-TDH3、HCKan-P-ADH1、HCKan-P-TEF2送測(cè)序，結(jié)果正確。

二、含有終止子的各質(zhì)粒HCKan-T-TEF1、HCKan-T-ADH1、HCKan-T-TEF2的構(gòu)建

(一)TEF1終止子、ADH1終止子和TEF2終止子的獲得

提取酵母BY4741的基因組DNA，以其為模板，以F8和R8為引物，使用超保真DNA聚合酶Q5酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增(PCR程序：94℃3min；94℃30s,51℃30s，72℃30s，30個(gè)循環(huán)；72℃7min；4℃+∞)，得到162bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物a2，該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)物含有TEF1終止子，TEF1終止子序列如SEQ ID No.45所示。

F8：5’-agcgtgggtc tcttagcgag attgataaga cttttctagt tgc-3’；

R8：5’-gtgctgggtc tcggaggctg aaaaaagagg ggaattttta g-3’。

將引物替換為F9和R9，其余實(shí)驗(yàn)步驟與上述實(shí)驗(yàn)步驟相同，得到207bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物b2，該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)物含有ADH1終止子，ADH1終止子序列如SEQ ID No.46所示。

F9：5’-agcgtgggtc tcttagccga atttcttatg atttatgatt tttattatta aataagttat-3’；

R9：5’-gtgctgggtc tcggaggccg gtagaggtgt ggtcaat-3’。

將引物替換為F10和R10，其余實(shí)驗(yàn)步驟與上述實(shí)驗(yàn)步驟相同，得到389bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物c2，該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)物含有TEF2終止子，TEF2終止子序列如SEQ ID No.47所示。

F10：5’-agcgtgggtc tcttagcagt aataattatt gcttccatat aatattttta tatacctc-3’；

R10：5’-gtgctgggtc tcggaggaga gtatagaata atgaaaacgt tagtagaaag aag-3’。

(二)建立10μL酶切連接反應(yīng)

反應(yīng)體系：1μL 10x T4 ligase buffer,0.1μL 100x BSA,10ng HCKan-T,2μL步驟(一)得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物a2、b2或c2,,4U BsaI(NEB),0.5U T4DNA ligase(Thermo Scientific)。

反應(yīng)條件：37℃，60min；55℃，15min；80℃，15min；10℃，+∞。

利用上述方法將TEF1、ADH1和TEF2分別克隆到載體HCKan-T，分別得到HCKan-T-TEF1、HCKan-T-ADH1、HCKan-T-TEF2。

以上酶切連接反應(yīng)的原理如下：

BsaI酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物a2，得到基因片段a2；BsaI酶切HCkan-T，得到載體大片段；將基因片段a2與載體大片段連接，得到重組質(zhì)粒，將其命名為HCKan-T-TEF1；

BsaI酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物b2，得到基因片段b2；BsaI酶切HCkan-T，得到載體大片段；將基因片段b2與載體大片段連接，得到重組質(zhì)粒，將其命名為HCKan-T-ADH1；

BsaI酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物c2，得到基因片段c2；BsaI酶切HCkan-T，得到載體大片段；將基因片段c2與載體大片段連接，得到重組質(zhì)粒，將其命名為HCKan-T-TEF2。

將HCKan-T-TEF1、HCKan-T-ADH1、HCKan-T-TEF2送測(cè)序，結(jié)果正確。

三、含有β-胡蘿卜素合成各相關(guān)基因的各質(zhì)粒HCKan-O-crtE、HCKan-O-crtI、HCKan-O-crtYB的構(gòu)建

(一)crtE、crtI、crtYB基因的獲得

1、基于法夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous)beta胡蘿卜素途徑中的crtE基因、crtI基因和crtYB基因，通過(guò)密碼子優(yōu)化，使crtE基因、crtI基因和crtYB基因的密 碼子具有酵母偏好性，并去除克隆及常規(guī)操作所用到的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。將優(yōu)化的crtE基因、crtI基因和crtYB基因序列分別克隆在pMV載體中，分別得到PMV-crtE、PMV-crtI、PMV-crtYB質(zhì)粒。

PMV-crtE質(zhì)粒的序列如SEQ ID No.48所示。

SEQ ID No.48中第168位至第1298位為crtE基因序列，crtE蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.49所示。

PMV-crtI質(zhì)粒的序列如SEQ ID No.50所示。

SEQ ID No.50中第168位至第1916位為crtI基因序列，crtI蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.51所示

PMV-crtYB質(zhì)粒的序列如SEQ ID No.52所示。

SEQ ID No.52中第168位至第2198位為crtYB基因序列，crtYB蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.53所示

(二)以PMV-crtE為模板，以F11和R11為引物，使用Q5酶進(jìn)行PCR(94℃3min；94℃30s,55℃30s，72℃90s，30個(gè)循環(huán)；72℃7min；4℃+∞)擴(kuò)增，得到1145bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。建立10μL酶切連接反應(yīng)(反應(yīng)體系：1μL 10x T4 ligase buffer,0.1μL 100x BSA,10ng HCKan-P,2μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,4U BsaI(NEB),0.5U T4DNA ligase(Thermo Scientific)，反應(yīng)條件：37℃，60min；55℃，15min；80℃，15min；10℃，+∞)，將crtE克隆到載體HCKan-O，得到HCKan-O-crtE，該酶切連接反應(yīng)的原理為：BsaI酶切該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)物，得到crtE基因片段；BsaI酶切HCKan-O，得到載體大片段；將crtE基因片段與載體大片段連接，得到重組質(zhì)粒，將其命名為HCKan-O-crtE。

F11：5’-agcgtgGGTCTCaGATGGACTACGCTAACATCTTGACCGC-3’；

R11：5’-gtgctgGGTCTCgGCTACAATGGGATGTCAGCCAACTTC-3’。

將模板替換為PMV-crtI，將引物替換為F12和R12，其余實(shí)驗(yàn)步驟與上述實(shí)驗(yàn)步驟相同，得到1763bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。通過(guò)相同的酶切連接反應(yīng)，將crtI克隆到載體HCKan-O，得到HCKan-O-crtI，該酶切連接反應(yīng)的原理為：BsaI酶切該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)物，得到crtI基因片段；BsaI酶切HCKan-O，得到載體大片段；將crtI基因片段與載體大片段連接，得到重組質(zhì)粒，將其命名為HCKan-O-crtI。

F12：5’-agcgtgGGTCTCaGATGGGTAAGGAACAAGACCAAGAC-3’；

R12：5’-gtgctgGGTCTCgGCTAGAAAGCCAAAACACCAACAGATC-3’。

將模板替換為PMV-crtYB，將引物替換為F13和R13，其余實(shí)驗(yàn)步驟與上述實(shí)驗(yàn)步驟相同，得到2036bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。通過(guò)相同的酶切連接反應(yīng)，將crtYB克隆到載體HCKan-O，得到HCKan-O-crtYB，該酶切連接反應(yīng)的原理為：BsaI酶切該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)物，得到crtYB基因片段；BsaI酶切HCKan-O，得到載體大片段；將crtYB基因片段與載體大片段連接，得到重組質(zhì)粒，將其命名為HCKan-O-crtYB。

F13：5’-agcgtgGGTCTCaGATGACCGCTTTGGCTTACTACCAAA-3’；

R13：5’-gtgctgGGTCTCgGCTATTGACCTTCCCAACCAGACATAAC-3’。

將HCKan-O-crtE、HCKan-O-crtI、HCKan-O-crtYB送測(cè)序，結(jié)果正確。

四、啟動(dòng)子、β-胡蘿卜素合成相關(guān)基因、終止子的POT整合

以crtE基因?yàn)槔?，選取上述構(gòu)建好的質(zhì)粒HCKan-P-TDH3、HCKan-O-crtE、HCKan-T-TEF1，建立10μL酶切連接反應(yīng)(1μL 10x T4 ligase buffer,0.1μL 100x BSA,5U BsmBI(NEB),200ng POT2,200ng HCKan-P-TDH3,400ng HCKan-O-crtE,200ng HCKan-T-TEF1)(55℃，60min；加0.5U T4DNA ligase(Thermo Scientific)；25℃，60min；55℃，15min；80℃，15min；10℃，+∞)，將TDH3啟動(dòng)子、crtE基因、TEF1終止子一起克隆到POT2載體，得到POT2-pTDH3-crtE-tTEF1。該酶切連接反應(yīng)的原理為：BsmBI酶切HCKan-P-TDH3，得到pTDH3片段；BsmBI酶切HCKan-O-crtE，得到crtE片段；BsmBI酶切HCKan-T-TEF1，得到tTEF1片段；BsmBI酶切POT2，得到4940長(zhǎng)度的載體大片段；將pTDH3片段、crtE片段、tTEF1片段按照5’-3’順序通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)連接到載體大片段上，得到重組質(zhì)粒，將其命名為POT2-pTDH3-crtE-tTEF1。將POT2-pTDH3-crtE-tTEF1送測(cè)序，結(jié)果正確。

按照上述方法，將HCKan-P-TDH3替換為HCKan-P-ADH1，將HCKan-O-crtE替換為HCKan-O-crtI，將HCKan-T-TEF1替換為HCKan-T-ADH1，將POT2替換為POT4，其余步驟不變，得到重組質(zhì)粒POT4-pADH1-crtI-tADH1。將POT4-pADH1-crtI-tADH1送測(cè)序，結(jié)果正確。

按照上述方法，將HCKan-P-TDH3替換為HCKan-P-TEF2，將HCKan-O-crtE替換為HCKan-O-crtYB，將HCKan-T-TEF1替換為HCKan-T-TEF2，將POT2替換為POT5，其余步驟不變，可以得到重組質(zhì)粒POT5-pTEF2-crtYB-tTEF2。將POT5-pTEF2-crtYB-tTEF2送測(cè)序，結(jié)果正確。

POT2-pTDH3-crtE-tTEF1中的含有TDH3啟動(dòng)子、crtE基因和TEF1終止子的片段pTDH3-crtE-tTEF1片段、POT4-pADH1-crtI-tADH1中的含有ADH1啟動(dòng)子、crtI基因和ADH1終止子的片段pADH1-crtI-tADH1、POT5-pTEF2-crtYB-tTEF2中的含有TEF2啟動(dòng)子、crtYB基因和TEF2終止子的片段pTEF2-crtYB-tTEF2為β-胡蘿卜素外源合成途徑的各標(biāo)準(zhǔn)化生物元件。此處crtE、crtI、crtYB基因分別用TDH3啟動(dòng)子、ADH1啟動(dòng)子和TEF2啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。

五、β-胡蘿卜素外源合成途徑的標(biāo)準(zhǔn)化生物元件的體外連接與轉(zhuǎn)化

作為同源重組的同源臂的重組目標(biāo)序列(URR1和URR2)長(zhǎng)度為500bp，隨機(jī)生成。設(shè)定的GC含量為50％，并經(jīng)過(guò)NCBI blast檢測(cè)，在已測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)中沒有任何同源。本發(fā)明中所用的URR1和URR2序列分別如SEQ ID No.55和SEQ ID No.56所示，但本發(fā)明保護(hù)的內(nèi)容不僅僅限于本序列。

(一)PMV-URR1的序列如SEQ ID No.54所示，SEQ ID No.54中第168位至第667位為URR1序列。

PMV-URR2的序列如SEQ ID No.55所示，SEQ ID No.55中第168位至第667位為URR2序列。

(二)PMV-LEU的序列如SEQ ID No.56所示，SEQ ID No.56中第168位至第2448位為營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記LEU2的序列。營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記可以是TRP1或LEU2或HIS3。

(三)將POT2-pTDH3-crtE-tTEF1、POT4-pADH1-crtI-tADH1、POT5-pTEF2-crtYB-tTEF2用BsaI酶切，將PMV-URR1、PMV-URR2、PMV-LEU2用BsmBI酶切，得到各酶切產(chǎn)物，將各酶切產(chǎn)物用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，得到超大長(zhǎng)度的外源DNA片段URR1-pTDH3-crtE-tTEF1-pADH1-crtI-tADH1-pTEF2-crtYB-tTEF2-LEU2-URR2。

β-胡蘿卜素途徑的體外連接組裝成的大片段如圖3所示。

(四)將外源DNA片段

RR1-pTDH3-crtE-tTEF1-pADH1-crtI-tADH1-pTEF2-crtYB-tTEF2-LEU2-URR2利用同源重組整合到來(lái)源于釀酒酵母S288C的釀酒酵母JDY52(該酵母為BY4727和BY4733交配后形成 二倍體菌株產(chǎn)孢得到的單倍體菌株，基因型為：MATa,his3Δ 200 leu2Δ 0 lys2Δ 0 trp1Δ 63ura3Δ 0 met15Δ 0)的HO位點(diǎn)，得到轉(zhuǎn)化子，將得到的轉(zhuǎn)化子通過(guò)營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記和PCR鑒定。

其中PCR鑒定的步驟如下：以轉(zhuǎn)化子的基因組DNA為模板，以Primer A和Primer B為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為586bp的目的片段的轉(zhuǎn)化子為含有URR1的轉(zhuǎn)化子，以Primer C和Primer D為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為752bp的目的片段的轉(zhuǎn)化子為含有URR1、TDH3啟動(dòng)子、crtE基因的轉(zhuǎn)化子，以Primer E和Primer F為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為735bp的目的片段的轉(zhuǎn)化子為含有crtE基因、TEF1終止子、ADH1啟動(dòng)子、crtI的轉(zhuǎn)化子，以Primer G和Primer H為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為880bp的目的片段的轉(zhuǎn)化子為含有crtI基因、ADH1終止子、TEF2啟動(dòng)子、crtYB的轉(zhuǎn)化子，以Primer I和Primer J為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為1335bp的目的片段的轉(zhuǎn)化子為含有crtYB基因、TEF2終止子和LEU2的轉(zhuǎn)化子，以Primer K和Primer L為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為977bp的目的片段的轉(zhuǎn)化子為含有LEU2和URR2的轉(zhuǎn)化子，以Primer M和Primer N為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為555bp的目的片段的轉(zhuǎn)化子為含有URR2的轉(zhuǎn)化子，含有所有目的片段的轉(zhuǎn)化子為最終得到的目的轉(zhuǎn)化子。

Primer A:5’-GGGTTCGCAAGTCCTGTTTCTATGCCTTTCTCTTAGTAATTCACG-3’；

Primer B:5’-CCAGAATCCGGGGCCTCTAAAGTAGAGCTAGGTTCGGAC-3’；

Primer C:5’-ACCCAACGATGTGGGGACGGCGTTGCAACTTCGAGGACCT-3’；

Primer D:5’-ACTCCAATGGGATAGCGGTCAAGATGTTAGCGTAGTCCAT-3’；

Primer E:5’-GGAAGCTATCTTGAAGAAGTTGGCTGACATCCCATTGTA-3’；

Primer F:5’-TGATAGCGGTTGGCTTGTCTTGGTCTTGTTCCTTACCCAT-3’；

Primer G:5’-GTAAGCCATTGAAGTCTAACGGAACCGGTATCGACTCTCA-3’；

Primer H:5’-TGTAGATCAAGTGGATTTGGTAGTAAGCCAAAGCGGTCAT-3’；

Primer I:5’-TACTCTTTGCCATTGGTTGCTTACGCTGAAGACTTGGCTA-3’；

Primer J:5’-GGTCACCTGGCAAAACGACGATCTTCTTAGGGGCAGACAT-3’；

Primer K:5’-CTGCCGCCATGATCCTAGTTAAGAACCCAACCCACCT-3’；

Primer L:5’-CCCCGACAGTGCGATTTAGCGAGCCTCTAACTCTTTCG-3’；

Primer M:5’-GCGTGCCTGCTCTCTCGTATTTCTCCTGGAGATC-3’；

Primer N:5’-CTGTTACTGATATGTCTGAGGAAAGTTGATCAAGACCC-3’。

六、β-胡蘿卜素含量的測(cè)定

β-胡蘿卜素含量的具體測(cè)定方法參見文獻(xiàn)“Ukibe K,Katsuragi T,Tani Y,Takagi H.Efficient screening for astaxanthin-overproducing mutants of the yeast Xanthophyllomyces dendrorhous by flow cytometry.FEMS Microbiol Lett.2008，286(2):241-8”。

將步驟五鑒定得到的目的轉(zhuǎn)化子分別接種于YPD培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2-3天后離心收集酵母細(xì)胞，將其凍干，破壁后用體積百分含量90％的丙酮水溶液對(duì)酵母細(xì)胞內(nèi)的類胡蘿卜素進(jìn)行提取，以β-胡蘿卜素(Sigma-Aldrich產(chǎn)品,產(chǎn)品目錄號(hào)為C4582-5mG)為標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行HPLC檢測(cè)分析，根據(jù)峰面積得到目的轉(zhuǎn)化子β-胡蘿卜素的相對(duì)產(chǎn)量。

實(shí)施例4、β-胡蘿卜素外源合成途徑的優(yōu)化

一、按照實(shí)施例3的步驟一至步驟四的方法，以β-胡蘿卜素外源合成途徑為例，將β- 胡蘿卜素外源合成途徑的各標(biāo)準(zhǔn)化生物元件的啟動(dòng)子進(jìn)行設(shè)置，使crtE、crtI、crtYB基因分別用TDH3啟動(dòng)子(強(qiáng)啟動(dòng)子)、TEF2啟動(dòng)子(中啟動(dòng)子)、CYC1啟動(dòng)子(弱啟動(dòng)子，序列如SEQ ID No.57所示)中的其中一種進(jìn)行啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，以調(diào)控crtE、crtI、crtYB基因的表達(dá)，并按照實(shí)施例3中步驟五的方法對(duì)URR1、β-胡蘿卜素外源合成途徑的各標(biāo)準(zhǔn)化生物元件、營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記、URR2按照5’-3’方向進(jìn)行連接，得到外源DNA片段，并轉(zhuǎn)化酵母，通過(guò)營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記和PCR鑒定轉(zhuǎn)化子，共得到27種不同啟動(dòng)子組合的酵母菌轉(zhuǎn)化子，按照實(shí)施例3中步驟六的方法檢測(cè)該27種不同啟動(dòng)子組合的酵母菌轉(zhuǎn)化子的β-胡蘿卜素相對(duì)產(chǎn)量，以此優(yōu)化β-胡蘿卜素外源合成途徑的啟動(dòng)子組合。上述27種不同啟動(dòng)子組合的酵母菌的β-胡蘿卜素合成各相關(guān)基因的啟動(dòng)子如表1所示。

表1 27種不同啟動(dòng)子組合的酵母菌

結(jié)果表明，各酵母菌的β-胡蘿卜素含量從高到低的順序?yàn)椋?17＞#23＞#26＞#14＞#8＞#2＞#18＞#5＞#15＞#11＞#24＞#27＞#9＞#6＞#3＞#12＞#20＞#21＞#13＞#22＞#16＞#1＞#4＞#7＞#25＞#10＞#19，即含有弱啟動(dòng)子pCYC1的酵母菌β-胡蘿卜素的含量均較低；而且crtYB基因啟動(dòng)子為pTEF2的酵母菌的β-胡蘿卜素含量最高。這說(shuō)明為得到高β-胡蘿卜素含量的酵母菌，β-胡蘿卜素途徑中的基因都需要一定強(qiáng)度的啟動(dòng)子(中啟動(dòng)子或強(qiáng)啟動(dòng)子)調(diào)控，而且調(diào)控crtYB基因的啟動(dòng)子不能太強(qiáng)。