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      標(biāo)準(zhǔn)化生物元件的設(shè)計(jì)和構(gòu)建方法及其應(yīng)用與流程

      文檔序號:11809313閱讀:來源:國知局

      技術(shù)特征:

      1.標(biāo)準(zhǔn)化生物元件的構(gòu)建方法,包括如下步驟:

      (1)構(gòu)建目的基因載體組、啟動(dòng)子載體組和終止子載體組;

      所述目的基因載體組由G種含有目的基因的載體組成,每種所述含有目的基因的載體均含有一種目的基因、兩個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶A位點(diǎn)、兩個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶B位點(diǎn),所述目的基因位于所述兩個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶A位點(diǎn)之間,和所述目的基因位于所述兩個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶B位點(diǎn)之間;所述G為大于等于1的自然數(shù),G的值為要體外組裝的目的代謝途徑的基因總數(shù);所述目的基因?yàn)橐w外組裝的目的代謝途徑的基因,每種所述含有目的基因的載體中所含有的目的基因均不同;

      所述啟動(dòng)子載體組由P種含有啟動(dòng)子的載體組成,每種所述含有啟動(dòng)子的載體均含有一種目的啟動(dòng)子、所述兩個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶A位點(diǎn)、所述兩個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶B位點(diǎn),所述目的啟動(dòng)子位于所述兩個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶A位點(diǎn)之間,和所述目的啟動(dòng)子位于所述兩個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶B位點(diǎn)之間;所述P為大于等于2的自然數(shù),每種所述含有啟動(dòng)子的載體中所含有的目的啟動(dòng)子均不同;

      所述終止子載體組由T種含有終止子的載體組成,每種所述含有終止子的載體均含有一種目的終止子、所述兩個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶A位點(diǎn)、所述兩個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶B位點(diǎn),所述目的終止子位于所述兩個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶A位點(diǎn)之間,和所述目的終止子位于所述兩個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶B位點(diǎn)之間;所述T為大于等于1的自然數(shù),每種所述含有終止子的載體中所含有的目的終止子均不同;

      (2)用所述限制性核酸內(nèi)切酶B酶切所述啟動(dòng)子載體組的載體,得到含有目的啟動(dòng)子的片段;用所述限制性核酸內(nèi)切酶B酶切所述目的基因載體組的載體,得到含有目的基因的片段;用所述限制性核酸內(nèi)切酶B酶切所述終止子載體組的載體,得到含有目的終止子的片段;

      (3)將所述含有目的啟動(dòng)子的片段中的一種片段、所述含有目的基因的片段中的一種片段和所述含有目的終止子的片段中的一種片段連接得到一種目的基因表達(dá)盒,該一種所述目的基因表達(dá)盒為一種標(biāo)準(zhǔn)化生物元件。

      2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于:所述限制性核酸內(nèi)切酶A為限制性核酸內(nèi)切酶BsaI;

      所述限制性核酸內(nèi)切酶B為限制性核酸內(nèi)切酶BsmBI或Esp3I;

      所述目的基因載體組的含有目的基因的載體的構(gòu)建包括如下步驟:用一種所述目的基因替換HCkan-O的兩個(gè)BsaI位點(diǎn)間的片段,HCkan-O的其余序列保持不變,得到一種所述含有目的基因的載體;

      所述HCkan-O為一種環(huán)狀載體,其序列如由序列分別如SEQ ID No.6和SEQ ID No.15所示的DNA分子首尾連接得到的環(huán)狀載體的序列所示;

      所述啟動(dòng)子載體組的含有啟動(dòng)子的載體的構(gòu)建包括如下步驟:用一種所述目的啟動(dòng)子替換HCkan-P的兩個(gè)BsaI位點(diǎn)間的片段,HCkan-P的其余序列保持不變,得到一種所述含有啟動(dòng)子的載體;

      所述HCkan-P為一種環(huán)狀載體,其序列如由序列分別如SEQ ID No.3和SEQ ID No.12所示的DNA分子首尾連接得到的環(huán)狀載體的序列所示;

      所述終止子載體組的含有終止子的載體的構(gòu)建包括如下步驟:用一種所述終止子替換HCkan-T的兩個(gè)BsaI位點(diǎn)間的片段,HCkan-T的其余序列保持不變,得到一種所述含有終止子的載體;

      所述HCkan-T為一種環(huán)狀載體,其序列如由序列分別如SEQ ID No.9和SEQ ID No.18所示的DNA分子首尾連接得到的環(huán)狀載體的序列所示。

      3.POT重組載體的構(gòu)建方法,包括如下步驟:

      1)按照權(quán)利要求1或2所述的方法制備標(biāo)準(zhǔn)化生物元件和制備POT載體組;

      所述POT載體組由兩種以上POT載體組成,每種所述POT載體含有兩個(gè)權(quán)利要求1或2中所述的限制性核酸內(nèi)切酶A位點(diǎn)和兩個(gè)權(quán)利要求1或2中所述的限制性核酸內(nèi)切酶B位點(diǎn);

      2)用一種所述標(biāo)準(zhǔn)化生物元件替換所述POT載體組的一種POT載體的所述兩個(gè)限制性核酸內(nèi)切酶B位點(diǎn)間的片段,POT載體的其余序列保持不變,得到一種POT重組載體;

      具體地,所述POT載體組包括如下1)-11)所示的質(zhì)粒中的至少一種:

      1)POT1質(zhì)粒,該質(zhì)粒的序列如SEQ ID No.21所示;

      2)POT2質(zhì)粒,該質(zhì)粒的大小為5987bp,該質(zhì)粒的第3122位至第3143位的序列如SEQ ID No.22所示,第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.23所示,第1位至第2070位的序列與SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同,第2093位至第3121位的序列與SEQ ID No.21的第2093位至第3121位的序列相同,第3144位至第5987位的序列與SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同;

      3)POT3質(zhì)粒,該質(zhì)粒的大小為5987bp,該質(zhì)粒的第3122位至第3143位的序列如SEQ ID No.24所示,第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.25所示,第1位至第2070位的序列與SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同,第2093位至第3121位的序列與SEQ ID No.21的第2093位至第3121位的序列相同,第3144位至第5987位的序列與SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同;

      4)POT4質(zhì)粒,該質(zhì)粒的大小為5987bp,該質(zhì)粒的第3122位至第3143位的序列如SEQ ID No.26所示,第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.27所示,第1位 至第2070位的序列與SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同,第2093位至第3121位的序列與SEQ ID No.21的第2093位至第3121位的序列相同,第3144位至第5987位的序列與SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同;

      5)POT5質(zhì)粒,該質(zhì)粒的大小為5987bp,該質(zhì)粒的第3122位至第3143位的序列如SEQ ID No.28所示,第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.29所示,第1位至第2070位的序列與SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同,第2093位至第3121位的序列與SEQ ID No.21的第2093位至第3121位的序列相同,第3144位至第5987位的序列與SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同;

      6)POT6質(zhì)粒,該質(zhì)粒的大小為5987bp,該質(zhì)粒的第3122位至第3143位的序列如SEQ ID No.30所示,第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.31所示,第1位至第2070位的序列與SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同,第2093位至第3121位的序列與SEQ ID No.21的第2093位至第3121位的序列相同,第3144位至第5987位的序列與SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同;

      7)POT7質(zhì)粒,該質(zhì)粒的大小為5987bp,該質(zhì)粒的第3122位至第3143位的序列如SEQ ID No.32所示,第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.33所示,第1位至第2070位的序列與SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同,第2093位至第3121位的序列與SEQ ID No.21的第2093位至第3121位的序列相同,第3144位至第5987位的序列與SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同;

      8)POT8質(zhì)粒,該質(zhì)粒的大小為5987bp,該質(zhì)粒的第3122位至第3143位的序列如SEQ ID No.34所示,第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.35所示,第1位至第2070位的序列與SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同,第2093位至第3121位的序列與SEQ ID No.21的第2093位至第3121位的序列相同,第3144位至第5987位的序列與SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同;

      9)POT9質(zhì)粒,該質(zhì)粒的大小為5987bp,該質(zhì)粒的第3122位至第3143位的序列如SEQ ID No.36所示,第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.37所示,第1位至第2070位的序列與SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同,第2093位至第3121位的序列與SEQ ID No.21的第2093位至第3121位的序列相同,第3144位至第5987位的序列與SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同;

      10)POT10質(zhì)粒,該質(zhì)粒的大小為5987bp,該質(zhì)粒的第3122位至第3143位的序列如SEQ ID No.38所示,第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.39所示,第1位至第2070位的序列與SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同,第2093位至第3121位的序列與SEQ ID No.21的第2093位至第3121位的序列相同,第3144位至第5987位的序列與SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同;

      11)POT11質(zhì)粒,該質(zhì)粒的大小為5987bp,該質(zhì)粒的第3122位至第3143位的序列如SEQ ID No.40所示,第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.41所示,第1位至第2070位的序列與SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同,第2093位至第3121位的序列與SEQ ID No.21的第2093位至第3121位的序列相同,第3144位至第5987位的序列與SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同。

      4.一種將標(biāo)準(zhǔn)化生物元件體外組裝成目的代謝途徑的方法,包括如下步驟:將序列兩端分別帶有粘性末端的同源重組位點(diǎn)的5’同源臂、序列兩端分別帶有粘性末端的各標(biāo)準(zhǔn)化生物元件、序列兩端分別帶有粘性末端的選擇標(biāo)記基因、序列兩端分別帶有粘性末端的同源重組位點(diǎn)的3’同源臂通過堿基互補(bǔ)配對連接組裝成目的代謝途徑;

      或,

      將所述序列兩端分別帶有粘性末端的同源重組位點(diǎn)的5’同源臂、所述序列兩端分別帶有粘性末端的選擇標(biāo)記基因、所述序列兩端分別帶有粘性末端的各標(biāo)準(zhǔn)化生物元件、所述序列兩端分別帶有粘性末端的同源重組位點(diǎn)的3’同源臂通過堿基互補(bǔ)配對連接組裝成目的代謝途徑;

      所述序列兩端分別帶有粘性末端的各標(biāo)準(zhǔn)化生物元件為用權(quán)利要求1或2中所述的限制性核酸內(nèi)切酶A酶切由權(quán)利要求3所述的方法制備的POT重組載體得到;

      所述各標(biāo)準(zhǔn)化生物元件包含的目的基因總數(shù)為要體外組裝的目的代謝途徑的基因總數(shù),每種所述各標(biāo)準(zhǔn)化生物元件包含的目的基因均不同。

      5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的方法,其特征在于:所述標(biāo)準(zhǔn)化生物元件包含的目的基因?yàn)棣?胡蘿卜素外源合成途徑的基因中的一種;

      所述標(biāo)準(zhǔn)化生物元件中的啟動(dòng)子為TDH3啟動(dòng)子、ADH1啟動(dòng)子、CYC1啟動(dòng)子和TEF2啟動(dòng)子中的一種;

      所述標(biāo)準(zhǔn)化生物元件中的終止子為TEF1終止子、ADH1終止子和TEF2終止子中的一種;

      所述同源重組位點(diǎn)為酵母的HO位點(diǎn)。

      6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法,其特征在于:所述β-胡蘿卜素外源合成途徑的基因?yàn)閏rtE基因、crtI基因和crtYB基因;

      所述crtE基因的序列具體如SEQ ID No.48中第168位至第1298位所示;

      所述crtI基因的序列具體如SEQ ID No.50中第168位至第1916位所示;

      所述crtYB基因的序列具體如SEQ ID No.52中第168位至第2198位所示;

      所述TDH3啟動(dòng)子的序列如SEQ ID No.42所示;

      所述ADH1啟動(dòng)子的序列如SEQ ID No.43所示;

      所述CYC1啟動(dòng)子的序列如SEQ ID No.57所示;

      所述TEF2啟動(dòng)子的序列如SEQ ID No.44所示;

      所述TEF1終止子的序列如SEQ ID No.45所示;

      所述ADH1終止子的序列如SEQ ID No.46所示;

      所述TEF2終止子的序列如SEQ ID No.47所示;

      所述序列兩端分別帶有粘性末端的同源重組位點(diǎn)的5’同源臂為用權(quán)利要求1或2中所述的限制性核酸內(nèi)切酶B酶切PMV-URR1得到,所述PMV-URR1的序列如SEQ ID No.54所示;

      所述序列兩端分別帶有粘性末端的選擇標(biāo)記基因?yàn)橛脵?quán)利要求1或2中所述的限制性核酸內(nèi)切酶B酶切PMV-selective marker得到,所述PMV-selective marker的序列如SEQ ID No.56所示;

      所述序列兩端分別帶有粘性末端的同源重組位點(diǎn)的3’同源臂為用權(quán)利要求1或2中所述的限制性核酸內(nèi)切酶B酶切PMV-URR2得到,所述PMV-URR2的序列如SEQ ID No.55所示。

      7.一種對目的代謝途徑進(jìn)行優(yōu)化的方法,包括如下步驟:

      1)按照權(quán)利要求4-6任一所述的方法體外組裝目的代謝途徑;

      2)將一種所述目的代謝途徑同源重組到宿主菌的染色體中,得到含有一種目的代謝途徑的一種重組菌,根據(jù)重組菌中目的產(chǎn)物的產(chǎn)量優(yōu)化目的代謝途徑,目的產(chǎn)物產(chǎn)量高的重組菌中的目的代謝途徑優(yōu)于目的產(chǎn)物產(chǎn)量低的重組菌中的目的代謝途徑。

      8.如下A-C任一所示的產(chǎn)品:

      A、權(quán)利要求1或2或權(quán)利要求5或6任一所述的方法制備得到的標(biāo)準(zhǔn)化生物元件;

      B、權(quán)利要求3或5或6任一所述的方法制備得到的POT重組載體;

      C、權(quán)利要求4或5或6任一所述的方法制備得到的目的代謝途徑。

      9.如下D-O任一所示的產(chǎn)品:

      D、HCkan-P質(zhì)粒,該質(zhì)粒的序列如由序列分別如SEQ ID No.3和SEQ ID No.12所示的DNA分子首尾連接得到的環(huán)狀載體的序列所示;

      E、HCKan-O質(zhì)粒,該質(zhì)粒的序列如由序列分別如SEQ ID No.6和SEQ ID No.15所示的DNA分子首尾連接得到的環(huán)狀載體的序列所示;

      F、HCkan-T質(zhì)粒,該質(zhì)粒的序列如由序列分別如SEQ ID No.9和SEQ ID No.18所示的DNA分子首尾連接得到的環(huán)狀載體的序列所示;

      G、POT質(zhì)粒,該質(zhì)粒為如下1)-11)所示的質(zhì)粒中的任一種:

      1)POT1質(zhì)粒,該質(zhì)粒的序列如SEQ ID No.21所示;

      2)POT2質(zhì)粒,該質(zhì)粒的大小為5987bp,該質(zhì)粒的第3122位至第3143位的序列 如SEQ ID No.22所示,第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.23所示,第1位至第2070位的序列與SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同,第2093位至第3121位的序列與SEQ ID No.21的第2093位至第3121位的序列相同,第3144位至第5987位的序列與SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同;

      3)POT3質(zhì)粒,該質(zhì)粒的大小為5987bp,該質(zhì)粒的第3122位至第3143位的序列如SEQ ID No.24所示,第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.25所示,第1位至第2070位的序列與SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同,第2093位至第3121位的序列與SEQ ID No.21的第2093位至第3121位的序列相同,第3144位至第5987位的序列與SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同;

      4)POT4質(zhì)粒,該質(zhì)粒的大小為5987bp,該質(zhì)粒的第3122位至第3143位的序列如SEQ ID No.26所示,第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.27所示,第1位至第2070位的序列與SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同,第2093位至第3121位的序列與SEQ ID No.21的第2093位至第3121位的序列相同,第3144位至第5987位的序列與SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同;

      5)POT5質(zhì)粒,該質(zhì)粒的大小為5987bp,該質(zhì)粒的第3122位至第3143位的序列如SEQ ID No.28所示,第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.29所示,第1位至第2070位的序列與SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同,第2093位至第3121位的序列與SEQ ID No.21的第2093位至第3121位的序列相同,第3144位至第5987位的序列與SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同;

      6)POT6質(zhì)粒,該質(zhì)粒的大小為5987bp,該質(zhì)粒的第3122位至第3143位的序列如SEQ ID No.30所示,第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.31所示,第1位至第2070位的序列與SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同,第2093位至第3121位的序列與SEQ ID No.21的第2093位至第3121位的序列相同,第3144位至第5987位的序列與SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同;

      7)POT7質(zhì)粒,該質(zhì)粒的大小為5987bp,該質(zhì)粒的第3122位至第3143位的序列如SEQ ID No.32所示,第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.33所示,第1位至第2070位的序列與SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同,第2093位至第3121位的序列與SEQ ID No.21的第2093位至第3121位的序列相同,第3144位至第5987位的序列與SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同;

      8)POT8質(zhì)粒,該質(zhì)粒的大小為5987bp,該質(zhì)粒的第3122位至第3143位的序列如SEQ ID No.34所示,第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.35所示,第1位至第2070位的序列與SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同,第2093位至第3121位的序列與SEQ ID No.21的第2093位至第3121位的序列相同,第3144位至 第5987位的序列與SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同;

      9)POT9質(zhì)粒,該質(zhì)粒的大小為5987bp,該質(zhì)粒的第3122位至第3143位的序列如SEQ ID No.36所示,第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.37所示,第1位至第2070位的序列與SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同,第2093位至第3121位的序列與SEQ ID No.21的第2093位至第3121位的序列相同,第3144位至第5987位的序列與SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同;

      10)POT10質(zhì)粒,該質(zhì)粒的大小為5987bp,該質(zhì)粒的第3122位至第3143位的序列如SEQ ID No.38所示,第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.39所示,第1位至第2070位的序列與SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同,第2093位至第3121位的序列與SEQ ID No.21的第2093位至第3121位的序列相同,第3144位至第5987位的序列與SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同;

      11)POT11質(zhì)粒,該質(zhì)粒的大小為5987bp,該質(zhì)粒的第3122位至第3143位的序列如SEQ ID No.40所示,第2071位至第2092位的序列如SEQ ID No.41所示,第1位至第2070位的序列與SEQ ID No.21的第1位至第2070位的序列相同,第2093位至第3121位的序列與SEQ ID No.21的第2093位至第3121位的序列相同,第3144位至第5987位的序列與SEQ ID No.21的第3144位至第5987位的序列相同。H、PMV-URR1質(zhì)粒,該質(zhì)粒的序列如SEQ ID No.54所示;

      H、PMV-URR1質(zhì)粒,該質(zhì)粒的序列如SEQ ID No.54所示;

      I、PMV-URR2質(zhì)粒,該質(zhì)粒的序列如SEQ ID No.55所示;

      J、PMV-selective marker質(zhì)粒,該質(zhì)粒的序列如SEQ ID No.56所示;

      K、一種重組菌,該重組菌是將權(quán)利要求8所述的C同源重組到宿主菌的染色體中得到的含有所述目的代謝途徑的重組菌;

      L、SEQ ID No.48中第168位至第1298位所示的DNA或cDNA分子;

      M、SEQ ID No.50中第168位至第1916位所示的DNA或cDNA分子;

      N、SEQ ID No.52中第168位至第2198位所示的DNA或cDNA分子;

      O、一種試劑盒,包括所述D、E和F所示的產(chǎn)品。

      10.權(quán)利要求8所述的產(chǎn)品或權(quán)利要求9所述產(chǎn)品在合成目的產(chǎn)物中的應(yīng)用;

      所述目的產(chǎn)物具體為β-胡蘿卜素。

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