本發(fā)明涉及Arg-Leu-Val-Cys-Val，涉及它的制備方法，涉及它的鎮(zhèn)痛活性，涉及它的抗腫瘤活性，涉及它的抗血栓活性及涉及它的溶血栓活性。因而本發(fā)明涉及它在制備鎮(zhèn)痛藥物、抗腫瘤藥物、抗血栓藥物和溶血栓藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

發(fā)明抗腫瘤、抗血栓、溶血栓、抗凝血和鎮(zhèn)痛作用寡肽是發(fā)明人長期關(guān)注的領(lǐng)域。雖然發(fā)明人發(fā)明公開過一系列具有這些活性的寡肽，但是集這些活性為一體的寡肽一直沒有得到。經(jīng)過近10年的序列設(shè)計(jì)和近5年的實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)Arg-Leu-Val-Cys-Val是集鎮(zhèn)痛作用，抗炎作用，抗腫瘤作用抗血栓作用和溶血栓作用為一體的寡肽。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個(gè)內(nèi)容是提供Arg-Leu-Val-Cys-Val。

本發(fā)明的第二個(gè)內(nèi)容是提供Arg-Leu-Val-Cys-Val的合成方法，該方法包括：

(1)在DCC和HOBt的催化下按照標(biāo)準(zhǔn)方法制備Boc-Leu-Val-OBzl；

(2)Boc-Leu-Val-OBzl在Pd/C催化下氫解轉(zhuǎn)化成Boc-Leu-Val

(3)在DCC和HOBt的催化下制備Boc-Cys(Bzl)-Val-OBzl；

(4)Boc-Cys(Bzl)-Ser-OBzl在濃度為4N的氯化氫-乙酸乙酯溶液中，0℃脫Boc，轉(zhuǎn)化成Cys(Bzl)-Val-OBzl

(5)在DCC和HOBt的催化下制備Boc-Arg(NO₂)-Leu-Val-OBzl；

(6)Boc-Arg(NO₂)-Leu-Val-OBzl在濃度為2N的NaOH水溶液中，0℃轉(zhuǎn)化成Boc-Arg(NO₂)-Leu-Val；

(7)在DCC和HOBt的催化下制備Boc-Arg(NO₂)-Leu-Val-Cys(Bzl)-Val-OBzl；

(8)Boc-Arg(NO₂)-Leu-Val-Cys(Bzl)-Val-OBzl在TFA和TFSMA中，0℃脫保護(hù)轉(zhuǎn)化成Arg-Leu-Val-Cys-Val。

本發(fā)明的第三個(gè)內(nèi)容是評價(jià)Arg-Leu-Val-Cys-Val的鎮(zhèn)痛作用。

本發(fā)明的第四個(gè)內(nèi)容是評價(jià)Arg-Leu-Val-Cys-Val的抗腫瘤作用。

本發(fā)明的第五個(gè)內(nèi)容是評價(jià)Arg-Leu-Val-Cys-Val的抗血栓作用。

本發(fā)明的第六個(gè)內(nèi)容是評價(jià)Arg-Leu-Val-Cys-Val的溶血栓作用。

附圖說明

圖1.Arg-Leu-Val-Cys-Val的合成路線.i)二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)，1-羥基苯并三唑(HOBt)，N-甲基嗎啉(NMM)，四氫呋喃(THF)；ii)濃度為4N的氯化氫-乙酸乙酯溶液，0℃；iii)H₂，Pd/C；iv)TFA，TFMSA，0℃。

具體實(shí)施方式

為了進(jìn)一步闡述本發(fā)明，下面給出一系列實(shí)施例。這些實(shí)施例完全是例證性的，它們僅用來對本發(fā)明進(jìn)行具體描述，不應(yīng)當(dāng)理解為對本發(fā)明的限制。

實(shí)施例1制備Boc-Leu-Val-OBzl

冰浴下2.31g(10mmol)Boc-Leu溶解于10ml無水THF，加入1.36g(10mmol)HOBt，加入2.47g(12mmol)DCC與10ml無水THF的溶液，活化30分鐘，加入2.07g(10mmol)Val-OBzl，用NMM調(diào)節(jié)pH＝9，反應(yīng)結(jié)束后過濾除去二環(huán)己基脲(DCU)。濾液減壓濃縮，殘留物用乙酸乙酯溶解，再次過濾DCU，濾液用NaHCO₃飽和溶液洗3遍，用NaCl飽和溶液洗3遍，5％的KHSO₄溶液洗3遍，NaCl飽和溶液洗3遍，5％的NaHCO₃溶液萃洗3遍，NaCl飽和溶液萃洗3遍，乙酸乙酯層用無水Na₂SO₄干燥12小時(shí)，濾除Na₂SO₄，濾液減壓濃縮，得到5.2g(100％)標(biāo)題化合物，為黃色油狀物。ESI-MS(m/e)：421[M+H]⁺。

實(shí)施例2制備Leu-Val-OBzl

冰浴下將4.20g(10mmol)Boc-Leu-Val-OBzl用10ml干燥過的乙酸乙酯溶解，攪拌10min，加入50mL氯化氫-乙酸乙酯溶液(4N)反應(yīng)4h，原料點(diǎn)消失。反應(yīng)混合物減壓濃縮至干，殘留物加40mL干燥過的乙酸乙酯溶解，得到的溶液減壓濃縮至干。殘留物按該操作重復(fù)3次。殘留物加無水乙醚，用塑料鏟研磨，減壓濃縮除去乙醚。殘留物按該操作重復(fù)3次。得到3.02g(97％)標(biāo)題化合物，為無色粉末。ESI⁺-MS(m/e)：322[M+H]⁺。

實(shí)施例3制備Boc-Arg(NO₂)-Leu-Val-OBzl

按照實(shí)施例1的方法從3.19g(10mmol)Boc-Arg(NO₂)和3.21g(10mmol)Leu-Val-OBzl得到3.02g(49％)標(biāo)題化合物，為無色粉末。ESI⁺-MS(m/e)：623 [M+H]⁺。

實(shí)施例4制備Boc-Arg(NO₂)-Leu-Val

冰浴下將6.21g(10mmol)Boc-Arg(NO₂)-Leu-Val-OBzl溶解于甲醇，攪拌10min，逐滴加入2N NaOH溶液，調(diào)節(jié)pH到13-14。保持冰浴反應(yīng)4個(gè)小時(shí)，反應(yīng)完全。冰浴下反應(yīng)液用飽和KHSO₄溶液調(diào)節(jié)pH到中性，先減壓濃縮除甲醇，再用飽和KHSO₄溶液調(diào)節(jié)pH到2。反應(yīng)液用乙酸乙酯萃取3遍。得到的溶液用飽和NaCl溶液洗至中性，用無水Na₂SO₄干燥12小時(shí)，過濾，濾液減壓濃縮，得到4.93g(100％)標(biāo)題化合物，為無色油狀物。ESI-MS(m/e)：532[M+H]⁺。

實(shí)施例5制備Boc-Cys(Bzl)-Val-OBzl

按照實(shí)施例1的方法從3.11g(10mmol)Boc-Cys(Bzl)和2.07g(10mmol)Val-OBzl得到4.23g(95％)標(biāo)題化合物，為無色油狀物。ESI+-MS(m/e)：539[M+K。

實(shí)施例6制備Cys(Bzl)-Val-OBzl的制備

按照實(shí)施例2的方法從5.0g(10mmol)Boc-Cys(Bzl)-Val-OBzl得到3.9g(98％)標(biāo)題化合物，為無色粉末。ESI⁺-MS(m/e)：401[M+H]⁺。

實(shí)施例7制備Boc-Arg(NO₂)-Leu-Val-Cys(Bzl)-Val-Obzl

按照實(shí)施例1的方法從5.37g(10mmol)Boc-Arg(NO₂)-Leu-Val和4.0g(10mmol)Cys(Bzl)-Val-OBzl得到3.67g(40％)標(biāo)題化合物，為無色果凍狀物。ESI⁺-MS(m/e)：915[M+H]⁺；¹H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝8.32(d，1H)，8.15(d，1H)，7.83(m，2H)，7.32(m，10H)，7.22(m，1H)，6.95(d，1H)，5.12(s，2H)，4.67(t，1H)，4.40(t，2H)，4.22(m，2H)，3.90(m，1H)，3.75(s，2H)，3.11(s，2H)，2.72(m，1H)，2.53(m，2H)，1.98(m，2H)，1.70-1.40(m，6H)，1.37(s，9H)，0.87(s，3H)，0.85(s，3H)，0.84(s，3H)，0.83(s，3H)，0.80(s，3H)，0.78(s，3H)。

實(shí)施例8制備Arg-Leu-Val-Cys-Val

冰浴下將456mg(0.5mmol)Boc-Arg(NO₂)-Leu-Val-Cys(Bzl)-Val-OBzl用12mL三氟醋酸溶解，攪拌10min，加入3mL TFMSA(三氟甲磺酸)反應(yīng)30min后，原料點(diǎn)消失。反應(yīng)混合物用無水乙醚稀釋，用塑料鏟磨洗，傾倒乙醚。殘留物再用無水乙醚稀釋，用塑料鏟磨洗，傾倒乙醚。該操作重復(fù)3次。得到的棕黃色粉末用三蒸水溶解，用氨水調(diào)pH至7，用Sephdex G10柱純化，收集的餾分凍干，得到173mg(62％)標(biāo)題化合物。ESI-MS(m/e)：590[M+H]⁺；Mp 174.2～174.9℃.(c＝0.08，甲醇).IR：3326，2964，2257，1786，1650，1523，1407，1364，1275，1245，1224，1160，1027，1004，863，824，760，710，637.¹H-NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝8.46(m，1H)， 8.06(m，4H)，7.38(m，5H)，4.49(m，1H)，4.19(m，2H)，3.77(m，3H)，3.00(m，4H)，2.10(m，2H)，1.63(m，2H)，1.45(m，3H)，1.21(m，3H)，0.85(m，18H)。

實(shí)施例9評價(jià)Arg-Leu-Val-Cys-Val的鎮(zhèn)痛活性

雄性ICR小鼠(20±2g)裝到小鼠固定器中，鼠尾暴露于固定器外，于鼠尾距離尾尖三分之一處標(biāo)記，作為光感感受器的感應(yīng)點(diǎn)，照射鼠尾距離尾尖三分之二的位置。測痛儀預(yù)熱30min，記時(shí)，將小鼠鼠尾遮住光感儀。燈閃爍時(shí)開始記時(shí)，鼠尾離開光感儀時(shí)停止記時(shí)，測得的時(shí)間即為小鼠產(chǎn)生痛感的時(shí)間，連續(xù)測定3次，每次測量間隔為5min，取平均值。未服藥小鼠產(chǎn)生痛感的時(shí)間為基礎(chǔ)痛感時(shí)間。服藥引起的小鼠產(chǎn)生痛感時(shí)間變化反映了藥物的鎮(zhèn)痛活性。小鼠，隨機(jī)分組，每組14只，測定基礎(chǔ)痛感時(shí)間后，小鼠或口服0.2mL Arg-Leu-Val-Cys-Val(RLVCV)的生理鹽水溶液，劑量為1μmol/kg或口服0.2mL生理鹽水或口服阿司匹林的生理鹽水溶液，劑量為1200μmol/kg。測量給藥后30，60，90，120，150和180min小鼠產(chǎn)生痛感的時(shí)間。數(shù)據(jù)用均值±SD秒表示，列如表1，用方差分析并進(jìn)行t檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)表明，口服生理鹽水30，60，90，120，150和180min之后小鼠產(chǎn)生痛感的時(shí)間與口服生理鹽水之前的基礎(chǔ)痛感時(shí)間沒有顯著差異；口服1200μmol/kg阿司匹林60，90，120，150和180min之后小鼠產(chǎn)生痛感的時(shí)間顯著長于口服阿司匹林之前的基礎(chǔ)痛感時(shí)間；口服1μmol/kgArg-Leu-Val-Cys-Val 30，60，90，120，150和180min之后小鼠產(chǎn)生痛感的時(shí)間顯著長于口服Arg-Leu-Val-Cys-Val之前的基礎(chǔ)痛感時(shí)間?？梢?，口服1μmol/kgArg-Leu-Val-Cys-Val60，90，120，150和180min之后的鎮(zhèn)痛活性與口服1200μmol/kg阿司匹林相當(dāng)。而口服1μmol/kgArg-Leu-Val-Cys-Val30min之后的鎮(zhèn)痛活性比口服1200μmol/kg阿司匹林還強(qiáng)。

表1Arg-Leu-Val-Cys-Val(RLVCV)的鎮(zhèn)痛活性

n＝14；a)與基礎(chǔ)痛感時(shí)間比p＞0.05；b)與基礎(chǔ)痛感時(shí)間比p＜0.05；c)與基礎(chǔ)痛感時(shí)間比p＜0.05.

實(shí)施例10評價(jià)Arg-Leu-Val-Cys-Val的抗腫瘤活性

無菌條件下取接種于ICR小鼠7-10天的S180肉瘤，加入適量生理鹽水配制成瘤細(xì)胞懸液，細(xì)胞數(shù)為2×10⁷/mL，接種于健康雄性ICR小鼠前肢腋皮下，每只小鼠注射0.2mL。腫瘤接種24h后，小鼠每日腹腔注射0.2mLArg-Leu-Val-Cys-Val的生理鹽水溶液，連續(xù)給藥10天，劑量為1μmol/kg；或小鼠每日腹腔注射0.2mL阿霉素的生理鹽水溶液，連 續(xù)給藥10天，劑量為2μmol/kg；或小鼠每日腹腔注射0.2mL生理鹽水，連續(xù)給藥10天。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行至第11天，稱小鼠體重，乙醚麻醉剖取各組小鼠的腫瘤，稱重并以瘤重表示化合物的活性，數(shù)據(jù)列入表3。結(jié)果表明1μmol/kg Arg-Leu-Val-Cys-Val治療小鼠的瘤重明顯小于生理鹽水治療小鼠的瘤重，Arg-Leu-Val-Cys-Val顯示確切的抗腫瘤活性。

表2Arg-Leu-Val-Cys-Val對S180荷瘤小鼠的瘤重的影響

n＝15；瘤重為均值±SD g；a)與生理鹽水比p＜0.01。

實(shí)施例11評價(jià)Arg-Leu-Val-Cys-Val的抗血栓活性

1)將聚乙烯管拉成一端為斜口的細(xì)管，定長為10.0cm，分別為右經(jīng)靜脈(管徑較粗)及左頸動(dòng)脈(管徑較細(xì))插管；中段聚乙烯管定長為8.0cm，血栓線壓在頸動(dòng)脈插管方向，插管前需在管中充滿肝素。

2)體重250±雄性大鼠口服1μmol/kgArg-Leu-Val-Cys-Val或167μmol/kg阿司匹林或0.3mL/100g生理鹽水30分鐘后，腹腔注射20％的烏拉坦進(jìn)行麻醉。仰臥位將大鼠固定于鼠板上，剪開頸部皮膚，分離右頸總動(dòng)脈及左頸靜脈，血管下壓線，結(jié)扎遠(yuǎn)心端，靜脈靠遠(yuǎn)心端處剪一小口，進(jìn)行靜脈端插管，注射肝素，系線固定，再用動(dòng)脈夾夾住動(dòng)脈近心端，靠近遠(yuǎn)心端方向剪一小口，進(jìn)行動(dòng)脈端結(jié)扎，系線固定后松開動(dòng)脈夾，建立體外循環(huán)旁路。循環(huán)15分鐘后先剪斷靜脈端觀察血液循環(huán)是否正常，若正常從動(dòng)脈端取出血栓線，在紙上沾干浮血后稱重，以栓重表示化合物的活性，數(shù)據(jù)列入表4。結(jié)果表明，Arg-Leu-Val-Cys-Val治療大鼠的血栓重明顯小于生理鹽水治療大鼠的血栓重，Arg-Leu-Val-Cys-Val顯示確切的抗血栓活性。。

表3Arg-Leu-Val-Cys-Val的抗栓活性

n＝12；a)與生理鹽水比p＜0.05.

實(shí)施例12評價(jià)Arg-Leu-Val-Cys-Val的溶栓活性

將大鼠靜息飼養(yǎng)一天，隨機(jī)分組，每組12只，禁食不禁水。

1)將體重250±雄性SD大鼠用20％烏拉坦溶液進(jìn)行麻醉(6mL/kg腹腔)。麻醉后的大鼠固定于鼠板上，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈，于近心端夾動(dòng)脈夾，近心端和遠(yuǎn)心端分別傳入手術(shù)線，在遠(yuǎn)心端插取血管，松開動(dòng)脈夾取約1mL動(dòng)脈血。迅速將動(dòng)脈血注射入垂直的造栓管(長16mm，內(nèi)徑2.5mm，外徑5mm，管底用1mL EP管底座)中，(注意不可有氣泡)每個(gè)造栓管中注入0.1mL大鼠動(dòng)脈血液，往管內(nèi)迅速插入血栓固定螺栓(長20mm，)，血液凝固40min，用針灸針取出血栓，稱取血栓重量。

2)旁路插管由三部分組成，其中中段為聚乙烯膠管，長60mm，內(nèi)徑3.5mm，兩端為相同的聚乙烯管，長100mm，內(nèi)徑1mm，外景2mm，該管的一段拉成尖管，另一端的外部套一段長7mm，外徑3.5mm的聚乙烯管。三段管的內(nèi)壁均為硅烷化。

3)將血栓包裹的血栓固定螺栓置于中段的聚乙烯膠管內(nèi)，膠管的兩端分別與兩根聚乙烯的加粗端相套，用注射器通過尖管端注滿肝素生理鹽水溶液(50IU/kg)。將充滿肝素鈉的生理鹽水溶液一端插入左側(cè)靜脈，另一端用注射器加入準(zhǔn)確量的肝素鈉抗凝后，拔掉肝素鈉的注射器，插入動(dòng)脈端。用頭皮針將生理鹽水(3mL/kg)或者尿激酶的生理鹽水溶液(20000IU/kg)或Arg-Leu-Val-Cys-Val的生理鹽水溶液(1μmol/kg)的通過旁路管的中段，刺入遠(yuǎn)離血栓固定螺栓的近靜脈處，打開動(dòng)脈夾，使血流通過旁路管道從動(dòng)脈流入靜脈的時(shí)刻為循環(huán)起始時(shí)間，緩慢的將注射器中的液體注入到血液中(約6min)，使生理鹽水，尿激酶，Arg-Leu-Val-Cys-Val通過血液循環(huán)，按靜脈-心臟-動(dòng)脈的順序作用到血栓上。60min后取出附有血栓的螺栓，蘸去浮血，記錄重量。以血栓減重代表溶栓活性。數(shù)據(jù)列入表4。結(jié)果表明，Arg-Leu-Val-Cys-Val治療大鼠的血栓減重明顯大于生理鹽水治療大鼠的血栓減重，Arg-Leu-Val-Cys-Val顯示確切的溶血栓活性。

表4Arg-Leu-Val-Cys-Val的溶栓活性

n＝10；a)與生理鹽水比p＜0.01。