本申請(qǐng)要求2014年3月31日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/973,141和2014年9月5日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?2/046,403的權(quán)益，所述美國臨時(shí)申請(qǐng)各自的內(nèi)容以引用的方式整體且出于所有目的并入本文。

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發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明部分涉及結(jié)合百日咳毒素蛋白的人源化抗體以及其作為治療劑的用途。具體地說，本發(fā)明部分涉及源自鼠抗體1B7和11E6的結(jié)合百日咳毒素蛋白的人源化抗體。

背景

百日咳博德特氏桿菌(Bordetella pertussis，B.pertussis)是感染上呼吸道、引起不可控制的劇烈咳嗽的革蘭氏陰性細(xì)菌。根據(jù)世界衛(wèi)生組織，百日咳博德特氏桿菌感染每年造成全世界估計(jì)300,000例死亡，主要在年幼的未接種的嬰兒中?；加邪偃湛鹊膵雰和枰趦嚎浦匕Y監(jiān)護(hù)病房住院，并且他們的治療通常涉及機(jī)械通氣。成人中的百日咳通常導(dǎo)致被稱為“百日咳(cough of 100 days)”的慢性咳嗽。百日咳的發(fā)病率由于未接種疫苗和疫苗接種不足的個(gè)體(包括尚未完全接種的嬰兒)、免疫力已隨時(shí)間推移減弱的個(gè)體以及無癥狀攜帶者的暴露而增加。

整個(gè)美國最近的新聞報(bào)道表明，在20世紀(jì)90年代引入的百日咳疫苗不提供長期保護(hù)。不存在用于百日咳的批準(zhǔn)的治療?？股刂委煂?duì)百日咳的病程不具有主要作用，因?yàn)殡m然治療可從呼吸道消除百日咳博德特氏桿菌細(xì)菌，但它不中和百日咳毒素蛋白。因此，仍然需要針對(duì)百日咳的更有效的療法。

此外，在發(fā)展中世界，獲得現(xiàn)有百日咳疫苗(然而有缺陷的)是不一致的和非常困難的。

天然存在的抗體是包含四條多肽鏈的多聚體蛋白。所述多肽鏈中的兩個(gè)被稱為重鏈(H鏈)，并且所述多肽鏈中的兩個(gè)被稱為輕鏈(L鏈)。免疫球蛋白重鏈和輕鏈通過鏈間二硫鍵連接。免疫球蛋白重鏈通過鏈間二硫鍵連接。輕鏈由一個(gè)可變區(qū)(V_L)和一個(gè)恒定區(qū)(C_L)組成。重鏈由一個(gè)可變區(qū)(V_H)和至少三個(gè)恒定區(qū)(CH₁、CH₂和CH₃)組成?？勺儏^(qū)決定抗體的特異性。每個(gè)可變區(qū)包含由四個(gè)相對(duì)保守的框架區(qū)(FR)側(cè)接的三個(gè)高變區(qū)(還稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR))。被稱為CDR₁、CDR₂和CDR₃的三個(gè)CDR促進(jìn)抗體結(jié)合特異性。天然存在的抗體已被用作工程化抗體如人源化抗體的起始材料。

已經(jīng)開發(fā)了結(jié)合百日咳毒素蛋白的抗體，但是這些抗體在患者中的有效性是最小的或不明確的。仍然需要針對(duì)百日咳毒素蛋白的具有增加的功效和減少的副作用的改進(jìn)的抗體以用作治療劑。

概述

因此，在不同方面，本發(fā)明涉及一種或多種結(jié)合和/或中和百日咳毒素蛋白的人源化抗體以及所述抗體在治療或預(yù)防百日咳中的用途。

一方面，本發(fā)明涉及一種結(jié)合百日咳毒素蛋白的人源化1B7抗體。所述人源化1B7抗體包含免疫球蛋白重鏈可變區(qū)和免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)。在不同實(shí)施方案中，所述人源化1B7抗體包含免疫球蛋白重鏈可變區(qū)，其包含選自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的氨基酸序列；以及免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)，其包含選自SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12的氨基酸序列。

另一方面，本發(fā)明涉及一種結(jié)合百日咳毒素蛋白的人源化11E6抗體。所述人源化11E6抗體包含免疫球蛋白重鏈可變區(qū)，其包含選自SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18的氨基酸序列；以及免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)，其包含選自SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24的氨基酸序列。

在不同實(shí)施方案中，所述人源化1B7和11E6抗體顯示改進(jìn)的特性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述人源化1B7抗體結(jié)合百日咳毒素蛋白的K_D為小于約3nM、或約2nM、或約1nM、或約0.5nM。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述人源化11E6抗體結(jié)合百日咳毒素蛋白的K_D為小于約12nM、或約10nM、或約8nM、或約6nM、或4nM、或2nM、或約1nM、或約0.5nM。

在不同實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供用于制備所述人源化1B7和11E6抗體的核酸、表達(dá)載體、宿主細(xì)胞以及方法。本發(fā)明還提供包含所述人源化1B7和/或11E6抗體的藥物組合物。

一方面，本發(fā)明的方法涉及治療具有百日咳博德特氏桿菌的患者，所述方法包括向所述患者施用人源化1B7抗體和/或人源化11E6抗體或包含所述一種或多種抗體的藥物組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，人源化1B7抗體和人源化11E6抗體被共同施用至患者，從而產(chǎn)生協(xié)同作用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括向所述患者施用人源化1B7抗體和/或人源化11E6抗體連同抗微生物劑。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法涉及通過向受試者施用人源化1B7抗體和/或人源化11E6抗體或包含所述一種或多種抗體的藥物組合物來在所述受試者中預(yù)防百日咳博德特氏桿菌感染。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法涉及通過針對(duì)患者、包括尚待疫苗接種的嬰兒預(yù)防性地施用人源化1B7抗體和/或人源化11E6抗體或包含所述一種或多種抗體的藥物組合物來預(yù)防百日咳的發(fā)作。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括降低患者中的白血細(xì)胞計(jì)數(shù)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括降低患者中咳嗽的持續(xù)時(shí)間和/或頻率。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括降低患者的鼻咽和肺中百日咳博德特氏桿菌的水平。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法中和百日咳毒素蛋白。

另一方面，本發(fā)明的方法涉及治療具有副百日咳博德特氏桿菌的患者，所述方法包括向所述患者施用人源化1B7抗體和/或人源化11E6抗體或包含所述一種或多種抗體的藥物組合物。另一方面，本發(fā)明的方法涉及通過向受試者施用人源化1B7抗體和/或人源化11E6抗體或包含所述一種或多種抗體的藥物組合物來在所述受試者中預(yù)防副百日咳博德特氏桿菌感染。

本發(fā)明的其他方面和實(shí)施方案將由以下詳述和實(shí)施例而顯而易見。

附圖描述

圖1示出在還原和非還原條件下人源化hu1B7抗體的SDS PAGE凝膠。

圖2示出人源化hu1B7抗體的尺寸排阻色譜。

圖3示出在還原和非還原條件下人源化hu11E6抗體的SDS PAGE凝膠。

圖4示出人源化hu11E6抗體的尺寸排阻色譜。

圖5示出(從左至右)人源化hu1B7A抗體(第三條線)、hu11E6A(第一條線)和兩種抗體的混合物(第二條線)的尺寸排阻色譜。結(jié)果以mL對(duì)mAu進(jìn)行測(cè)量，并且將所有線與預(yù)期分子量(MW，垂直黑線)進(jìn)行比較。

圖6A至圖6D示出人源化hu11E6抗體、人源化hu1B7抗體、鼠m11E6抗體和鼠m1B7抗體的繪制為溫度(℃)對(duì)熒光的熱解折疊。圖6A示出hu11E6抗體(hu11E6-15x)的熱解折疊。頂部線對(duì)應(yīng)于10uM hu11E6-15x，從頂部的第二條線對(duì)應(yīng)于20uM hu11E6-15x，從底部的第二條線對(duì)應(yīng)于5uM hu11E6-15x，并且底部線對(duì)應(yīng)于PBS。圖6B示出hu1B7抗體的熱解折疊。頂部線對(duì)應(yīng)于20uM hu1B7，從頂部的第二條線對(duì)應(yīng)于10uM hu1B7，從底部的第二條線對(duì)應(yīng)于5uM hu1B7，并且底部線對(duì)應(yīng)于PBS。圖6C示出m11E6抗體的熱解折疊。頂部線對(duì)應(yīng)于3uM m11E6，從頂部的第二條線對(duì)應(yīng)于1.5uM m11E6，從底部的第二條線對(duì)應(yīng)于0.75uM m11E6，并且底部線對(duì)應(yīng)于PBS。圖6D示出m1B7抗體的熱解折疊。頂部線對(duì)應(yīng)于3uM m1B7，從頂部的第二條線對(duì)應(yīng)于1.5uM m1B7，從底部的第二條線對(duì)應(yīng)于0.75uM m1B7，并且底部線對(duì)應(yīng)于PBS。

圖7示出百日咳毒素(PTx)ELISA測(cè)定的結(jié)果，所述測(cè)定比較人源化hu1B7和hu11E6抗體對(duì)比小鼠m1B7和m11E6抗體的PTx結(jié)合親和力。結(jié)果被示出為抗體濃度(nM)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化吸光度。

圖8示出競(jìng)爭性ELISA測(cè)定的結(jié)果，所述測(cè)定測(cè)定在兩個(gè)不同實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)生的人源化hu1B7和hu11E6抗體的PTx結(jié)合親和力。結(jié)果被示出為PTx濃度對(duì)吸光度。

圖9示出CHO細(xì)胞體外保護(hù)測(cè)定的結(jié)果，所述測(cè)定測(cè)量人源化hu1B7和hu11E6抗體中和百日咳毒素蛋白的能力。結(jié)果以摩爾比(mol mAb/mol PTx)示出。

圖10示出PTx毒素ELISA測(cè)定的結(jié)果，連同人源化hu1B7和hu11E6抗體的混合物的EC₅₀(μg/mL)值。將所述抗體混合且在4℃下儲(chǔ)存1分鐘、1小時(shí)和22小時(shí)。結(jié)果被示出為抗體濃度(μg/mL)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化吸光度。

圖11展示人源化hu11E6抗體、人源化hu1B7抗體以及人源化hu1B7抗體與人源化hu11E6抗體的混合物的消除(β)半衰期(t1/2β)。所有半衰期均在小鼠中測(cè)定。

圖12示出PTx毒素ELISA測(cè)定的結(jié)果，所述測(cè)定測(cè)定熱處理對(duì)人源化hu1B7A抗體的活性的作用。具體地說，將50μg/mL的抗體在50℃或在70℃下在PBS中在冰上孵育30分鐘，并且在冰上淬滅1分鐘。結(jié)果被測(cè)量為抗體濃度(μg/mL)對(duì)吸光度。

圖13示出PTx毒素ELISA測(cè)定的結(jié)果，所述測(cè)定測(cè)定熱處理對(duì)人源化hu11E6A抗體的活性的作用。具體地說，將50μg/mL的抗體在50℃或在70℃下在PBS中在冰上孵育30分鐘，并且在冰上淬滅1分鐘。結(jié)果被測(cè)量為抗體濃度(μg/mL)對(duì)吸光度。

圖14示出PTx毒素ELISA測(cè)定的結(jié)果，連同人源化hu1B7A抗體、人源化hu11E6A抗體以及所述兩種抗體的混合物的EC₅₀(μg/mL)值。結(jié)果被示出為抗體濃度(μg/mL)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化吸光度。

圖15示出人源化11E6和1B7抗體在治療感染百日咳博德特氏桿菌D420菌株的小鼠中的功效(如通過重量增加％所測(cè)量)。將小鼠用PBS、P-IVIG、鼠m1B7抗體、ch1B7抗體、人源化hu1B7抗體、鼠m11E6抗體、ch11E6抗體、人源化hu11E6抗體或人源化hu1B7與hu11E6抗體的混合物處理，并且在感染后10天時(shí)測(cè)量它們的體重。未感染的首次接受試驗(yàn)的小鼠充當(dāng)基線對(duì)照。

圖16A和圖16B示出人源化11E6和1B7抗體在治療感染百日咳博德特氏桿菌D420菌株的小鼠中的功效(如通過白細(xì)胞計(jì)數(shù)/50μL血液所測(cè)量)。將小鼠用PBS、P-IVIG、鼠m1B7抗體、ch1B7抗體、人源化hu1B7抗體、鼠m11E6抗體、ch11E6抗體、人源化hu11E6抗體或人源化hu1B7與hu11E6抗體的混合物處理，并且在感染后3天和10天時(shí)評(píng)估它們的血液白細(xì)胞計(jì)數(shù)。未感染的首次接受試驗(yàn)的小鼠充當(dāng)基線對(duì)照。

圖17示出人源化11E6和1B7抗體在降低百日咳博德特氏桿菌細(xì)菌的小鼠肺定殖中的功效。

圖18A和圖18B示出人源化11E6和1B7抗體的混合物對(duì)百日咳博德特氏桿菌感染的狒狒的治療作用。具體地，評(píng)定了白血細(xì)胞計(jì)數(shù)和咳嗽計(jì)數(shù)。

圖19示出來自用人源化11E6和1B7抗體治療的百日咳博德特氏桿菌感染的狒狒的肺的病理切片。

圖20A和圖20B示出人源化11E6和1B7抗體的混合物對(duì)百日咳博德特氏桿菌感染的狒狒的治療作用。具體地，評(píng)定了白血細(xì)胞計(jì)數(shù)和鼻洗液細(xì)菌計(jì)數(shù)。

圖21A和圖21B分別示出人源化11E6和1B7抗體在兩只百日咳博德特氏桿菌感染的狒狒(即，狒狒#12913和15913)中的抗體血清濃度和抗體半衰期。在圖21A的Y軸上示出的定時(shí)是如在圖20A和20B中所示(即在時(shí)間＝0時(shí)感染，在3天時(shí)治療)。

詳述

本發(fā)明部分地基于表現(xiàn)出改進(jìn)的生物活性的人源化1B7和11E6抗體的發(fā)現(xiàn)。由于這些抗體針對(duì)百日咳毒素蛋白的結(jié)合和/或中和活性，所以它們適用于治療感染百日咳博德特氏桿菌細(xì)菌的患者。將所公開的抗體工程化以靶向具有高特異性的百日咳毒素蛋白，而在患者中引起最小副作用。此外，所公開的抗體表現(xiàn)出增強(qiáng)的穩(wěn)定性和長體內(nèi)半衰期。在下文更詳細(xì)地論述本發(fā)明的各種特征和方面。

如本文所用，除非另外指示，否則術(shù)語“抗體”意指完整抗體(例如，完整單克隆抗體)或抗體的抗原結(jié)合片段(例如，單克隆抗體的抗原結(jié)合片段)，包括已進(jìn)行修飾、工程化或化學(xué)綴合或?yàn)槿丝贵w的完整抗體或抗原結(jié)合片段。已進(jìn)行修飾或工程化的抗體的實(shí)例是嵌合抗體、人源化抗體和多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)。抗原結(jié)合片段的實(shí)例包括Fab、Fab’、F(ab’)₂、Fv、單鏈抗體(例如scFv)、微抗體以及雙抗體。綴合至毒素部分的抗體是化學(xué)綴合抗體的實(shí)例。

結(jié)合百日咳毒素蛋白的抗體

一方面，本發(fā)明涉及結(jié)合百日咳毒素蛋白的人源化1B7抗體和人源化11E6抗體。在各種實(shí)施方案中，人源化抗體是已進(jìn)行改變以增加其與人抗體的相似性的非人抗體。在一些實(shí)施方案中，人源化抗體是遺傳工程化的抗體，其中來自非人(例如小鼠)抗體(“供體抗體”，其也可是大鼠、倉鼠或其他非人物種)的至少一個(gè)CDR(或其功能片段)被接枝至人抗體(“受體抗體”)。在一些實(shí)施方案中，接枝多于一個(gè)小鼠CDR(例如，接枝所有六個(gè)小鼠CDR)。受體抗體的序列可以是例如成熟人抗體序列(或其片段)、人抗體序列的共有序列(或其片段)或種系區(qū)序列(或其片段)。因此，在一些實(shí)施方案中，人源化抗體可以是具有來自供體抗體的一個(gè)或多個(gè)CDR以及可變區(qū)框架(FR)的抗體。FR可形成人抗體內(nèi)的恒定區(qū)的一部分。

此外，為了保留高結(jié)合親和力，人受體序列中的氨基酸可被來自供體序列的相應(yīng)氨基酸置換，例如其中：(1)氨基酸是在CDR中；(2)氨基酸是在人框架區(qū)中(例如，所述氨基酸緊鄰所述CDR中的一個(gè))。參見以引用的方式并入本文的美國專利號(hào)5,530,101和5,585,089，提供這些專利用于構(gòu)建人源化抗體的詳細(xì)說明。確實(shí)，例如人框架區(qū)中的殘基的這種選擇通常是人源化抗體合意性的中心。雖然人源化抗體通常并入來自小鼠抗體的所有六個(gè)CDR(例如，如由Kabat所定義，但通常還包含如由Chothia定義的高變環(huán)H1)，但是它們還可被制備為具有更少CDR和/或少于完整小鼠CDR序列(例如，CDR的功能片段)。

在各種實(shí)施方案中，人源化輕鏈可變區(qū)融合至輕鏈恒定區(qū)(例如人κ或λ輕鏈)。在各種實(shí)施方案中，人源化重鏈可變區(qū)融合至重鏈恒定區(qū)，包括各自的各種同種異型和同種型。例如，重鏈恒定區(qū)可源自任何免疫球蛋白類型(例如，IgG、IgM、IgA、IgD或IgE)。在一些實(shí)施方案中，使用IgG。對(duì)于IgG，恒定區(qū)可來自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在一些實(shí)施方案中，使用IgG1。此外，存在每種IgG的可選擇的許多同種型，一些是天然存在的并且一些是天然存在的同種型的衍生物。所選擇的IgG的類型將決定抗體的效應(yīng)子功能(例如，調(diào)理吞噬、補(bǔ)體結(jié)合等)。

一方面，本發(fā)明涉及人源化1B7抗體，該人源化1B7抗體結(jié)合百日咳毒素蛋白并且包含免疫球蛋白重鏈可變區(qū)和免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)。該免疫球蛋白重鏈可變區(qū)包含選自以下的氨基酸序列：

1B7：

QVQLQQPGSELVRPGASVKLSCKASGYKFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGNIFPGSGSTNYDEKFNSKATLTVDTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCTRWLSGAYFDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO：1)

cdr1B7：

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGNIFPGSGSTNYDEKFNSRVTLTVDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRWLSGAYFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：2)

abb1B7：

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGNIFPGSGSTNYAQKFQGRVTLTVDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRWLSGAYFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：3)

sdr1B7：

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYKFTSYWMHWVRQAPGQGLEWIGNIFPGSGSTNYAQKFQGRVTLTVDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRWLSGAYFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：4)

fra1B7：

QVQLQQSGSELKKPGASVKISCKASGYKFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGNIFPGSGSTNYDEKFNSRVTLTVDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRWLSGAYFDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO：5)

ven1B7：

QVQLVQSGAELVKPGASVKLSCKASGYKFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGNIFPGSGSTNYDEKFNSKATLTVDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTRWLSGAYFDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO：6)

該免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)包含選自以下的氨基酸序列：

1B7：

QIVLTQSPALMSASPGEKVTMTCSASSSVSFMYWYQQKPRSSPKPWIY

LTSNLPSGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSHPPTFGSGTKLEIK(SEQ ID NO：7)

cdr1B7：

QIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCSASSSVSFMYWYQQKPDQSPKPLIYLTSNLPSGVPARFSGSGSGTSYTLTINSLEAEDAATYYCQQWSSHPPTFGSGTKVEIK(SEQ ID NO：8)

abb1B7：

QIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASSSVSFMYWYQQKPDQSPKPLIYLTSNLPSGVPARFSGSGSGTDYTLTINSLEAEDAATYYCQQWSSHPPTFGSGTKVEIK(SEQ ID NO：9)

sdr1B7：

QIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASSIVSFLYWYQQKPDQSPKPLIYLASNLPSGVPARFSGSGSGTDYTLTINSLEAEDAATYYCQQWSSHPPTFGSGTKVEIK(SEQ ID NO：10)

fra1B7：

QIVLTQSPATLSVSPGERVTLTCSASSSVSFMYWYQQKPGRAPKPLIYLTSNLPSGVPARFSGSGSGTSYTLTINSLEAEDAATYYCQQWSSHPPTFGSGTKLEIK(SEQ ID NO：11)

ven1B7：

QIVLTQSPDFMSATPGEKVTMTCSASSSVSFMYWYQQKPRQSPKPWIYLTSNLPSGVPARFSGSGSGTDYTLTINSMEAEDAATYYCQQWSSHPPTFGSGTKLEIK(SEQ ID NO：12)

所公開的1B7重鏈中的任一個(gè)可與所公開的1B7輕鏈中的任一個(gè)配對(duì)。作為說明，以下對(duì)可并入本發(fā)明組合物和方法的抗體中：SEQ ID NO：1/SEQ ID NO：7；SEQ ID NO：1/SEQ ID NO：8；SEQ ID NO：1/SEQ ID NO：9；SEQ ID NO：1/SEQ ID NO：10；SEQ ID NO：1/SEQ ID NO：11；SEQ ID NO：1/SEQ ID NO：12；SEQ ID NO：2/SEQ ID NO：7；SEQ ID NO：2/SEQ ID NO：8；SEQ ID NO：2/SEQ ID NO：9；SEQ ID NO：2/SEQ ID NO：10；SEQ ID NO：2/SEQ ID NO：11；SEQ ID NO：2/SEQ ID NO：12；SEQ ID NO：3/SEQ ID NO：7；SEQ ID NO：3/SEQ ID NO：8；SEQ ID NO：3/SEQ ID NO：9；SEQ ID NO：3/SEQ ID NO：10；SEQ ID NO：3/SEQ ID NO：11；SEQ ID NO：3/SEQ ID NO：12；SEQ ID NO：4/SEQ ID NO：7；SEQ ID NO：4/SEQ ID NO：8；SEQ ID NO：4/SEQ ID NO：9；SEQ ID NO：4/SEQ ID NO：10；SEQ ID NO：4/SEQ ID NO：11；SEQ ID NO：4/SEQ ID NO：12；SEQ ID NO：5/SEQ ID NO：7；SEQ ID NO：5/SEQ ID NO：8；SEQ ID NO：5/SEQ ID NO：9；SEQ ID NO：5/SEQ ID NO：10；SEQ ID NO：5/SEQ ID NO：11；SEQ ID NO：5/SEQ ID NO：12；SEQ ID NO：6/SEQ ID NO：7；SEQ ID NO：6/SEQ ID NO：8；SEQ ID NO：6/SEQ ID NO：9；SEQ ID NO：6/SEQ ID NO：10；SEQ ID NO：6/SEQ ID NO：11；以及SEQ ID NO：6/SEQ ID NO：12。

在一個(gè)實(shí)施方案中，人源化1B7抗體包含免疫球蛋白重鏈可變區(qū)，其包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列；以及免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)，其包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。

在一個(gè)實(shí)施方案中，人源化1B7抗體包含免疫球蛋白重鏈可變區(qū)，其包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列；以及免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)，其包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列。

在一個(gè)實(shí)施方案中，人源化1B7抗體包含免疫球蛋白重鏈可變區(qū)，其包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列；以及免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)，其包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列。

在一個(gè)實(shí)施方案中，人源化1B7抗體包含免疫球蛋白重鏈可變區(qū)，其包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列；以及免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)，其包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列。

在一個(gè)實(shí)施方案中，人源化1B7抗體包含免疫球蛋白重鏈可變區(qū)，其包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列；以及免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)，其包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列。

在其他實(shí)施方案中，人源化1B7抗體包含免疫球蛋白重鏈可變區(qū)，該免疫球蛋白重鏈可變區(qū)包含與SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6的整個(gè)可變區(qū)、互補(bǔ)決定區(qū)或框架區(qū)序列具有至少約50％同一性、約51％同一性、約52％同一性、約53％同一性、約54％同一性、約55％同一性、約56％同一性、約57％同一性、約58％同一性、約59％同一性、約60％同一性、約61％同一性、約62％同一性、約63％同一性、約64％同一性、約65％同一性、約66％同一性、約67％同一性、約68％同一性、約69％同一性、約70％同一性、約71％同一性、約72％同一性、約73％同一性、約74％同一性、約75％同一性、約76％同一性、約77％同一性、約78％同一性、約79％同一性、約80％同一性、約81％同一性、約82％同一性、約83％同一性、約84％同一性、約85％同一性、約86％同一性、約87％同一性、約88％同一性、約89％同一性或約90％同一性的氨基酸序列。

在其他實(shí)施方案中，人源化1B7抗體包含免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)，該免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)包含與SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12的整個(gè)可變區(qū)、互補(bǔ)決定區(qū)或框架區(qū)序列具有至少約50％同一性、約51％同一性、約52％同一性、約53％同一性、約54％同一性、約55％同一性、約56％同一性、約57％同一性、約58％同一性、約59％同一性、約60％同一性、約61％同一性、約62％同一性、約63％同一性、約64％同一性、約65％同一性、約66％同一性、約67％同一性、約68％同一性、約69％同一性、約70％同一性、約71％同一性、約72％同一性、約73％同一性、約74％同一性、約75％同一性、約76％同一性、約77％同一性、約78％同一性、約79％同一性、約80％同一性、約81％同一性、約82％同一性、約83％同一性、約84％同一性、約85％同一性、約86％同一性、約87％同一性、約88％同一性、約89％同一性或約90％同一性的氨基酸序列。

一方面，本發(fā)明涉及人源化11E6抗體，所述抗體結(jié)合百日咳毒素蛋白并且包含免疫球蛋白重鏈可變區(qū)和免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)。該免疫球蛋白重鏈可變區(qū)包含選自以下的氨基酸序列：

11E6：

EVKVVESGGGLVQPGGSLRLSCTTSGFTFTDYYVSWVRQPPGKALEWLGFIRNKVNGYTTEFSSSVKGRFTISRDNSQSILYLQMNTLRVEDSATYYCARVSYYGRGWYFDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO：13)

cdr11E6：

EVQVVESGGGLVQPGRSLRLSCTTSGFTFTDYYVSWVRQAPGKALEWLGFIRNKVNGYTTEFSSSVKGRFTISRDNSKSILYLQMNSLKIEDTAVYYCARVSYYGRGWYFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：14)

abb11E6：

EVQVVESGGGLVQPGRSLRLSCTTSGFTFTDYYVSWVRQAPGKALEWVGFIRNKVNGYTTEFAASVRGRFTISRDNSKSILYLQMNSLKIEDTAVYYCARVSYYGRGWYFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：15)

sdr11E6：

EVQVVESGGGLVQPGRSLRLSCTTSGFTFTDYYVSWVRQAPGKALEWVGFIRNKVNGYTTEFAASVRGRFTISRDNSKSILYLQMNSLKIEDTAVYYCARVSYYGRGWYFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：16)

fra11E6：

EVQVVESGGGLVQPGGSLRLSCTTSGFTFTDYYVSWVRQPPGKALEWLGFIRNKVNGYTTEFSSSVKGRFTISRDNSKSTLYLQMNTLRVDDTAVYYCARVSYYGRGWYFDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO：17)

ven11E6：

EVQVVESGGGLVQPGRSLRLSCTTSGFTFTDYYVSWVRQAPGKALEWLGFIRNKVNGYTTEFSSSVKGRFTISRDNSKSILYLQMNSLKIEDTAVYYCARVSYYGRGWYFDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO：18)

該免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)包含選自以下的氨基酸序列：

11E6：

DIVMTQSTSSLSASLGDRVTISCRASQDIDNYLSWFQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISSLDQEDIATYFCQQGNTFPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO：19)

cdr11E6：

DIVMTQSPSSLSASVGDRVTISCRASQDIDNYLSWFQQKPGGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDIATYFCQQGNTFPWTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO：20)

abb11E6：

DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIDNYLSWFQQKPGGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDIATYFCQQGNTFPWTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO：21)

sdr11E6：

DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIDNYLSWFQQKPGGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDIATYFCQQGNTFPWTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO：22)

fra11E6：

DIVMTQSPSSLSASVGDRVTISCRASQDIDNYLSWFQQKPGGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDIATYFCQQGNTFPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO：23)

ven11E6：

DIVMTQSPSSLSASVGDRVTISCRASQDIDNYLSWFQQKPGGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDIATYFCQQGNTFPWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO：24)

所公開的11E6重鏈中的任一個(gè)可與所公開的11E6輕鏈中的任一個(gè)配對(duì)。作為說明，以下對(duì)可并入本發(fā)明組合物和方法的抗體中：SEQ ID NO：13/SEQ ID NO：19；SEQ ID NO：13/SEQ ID NO：20；SEQ ID NO：13/SEQ ID NO：21；SEQ ID NO：13/SEQ ID NO：22；SEQ ID NO：13/SEQ ID NO：23；SEQ ID NO：13/SEQ ID NO：24；SEQ ID NO：14/SEQ ID NO：19；SEQ ID NO：14/SEQ ID NO：20；SEQ ID NO：14/SEQ ID NO：21；SEQ ID NO：14/SEQ ID NO：22；SEQ ID NO：14/SEQ ID NO：23；SEQ ID NO：14/SEQ ID NO：24；SEQ ID NO：15/SEQ ID NO：19；SEQ ID NO：15/SEQ ID NO：20；SEQ ID NO：15/SEQ ID NO：21；SEQ ID NO：15/SEQ ID NO：22；SEQ ID NO：15/SEQ ID NO：23；SEQ ID NO：15/SEQ ID NO：24；SEQ ID NO：16/SEQ ID NO：19；SEQ ID NO：16/SEQ ID NO：20；SEQ ID NO：16/SEQ ID NO：21；SEQ ID NO：16/SEQ ID NO：22；SEQ ID NO：16/SEQ ID NO：23；SEQ ID NO：16/SEQ ID NO：24；SEQ ID NO：17/SEQ ID NO：19；SEQ ID NO：17/SEQ ID NO：20；SEQ ID NO：17/SEQ ID NO：21；SEQ ID NO：17/SEQ ID NO：22；SEQ ID NO：17/SEQ ID NO：23；SEQ ID NO：17/SEQ ID NO：24；SEQ ID NO：18/SEQ ID NO：19；SEQ ID NO：18/SEQ ID NO：20；SEQ ID NO：18/SEQ ID NO：21；SEQ ID NO：18/SEQ ID NO：22；SEQ ID NO：18/SEQ ID NO：23；以及SEQ ID NO：18/SEQ ID NO：24。

在一個(gè)實(shí)施方案中，人源化11E6抗體包含免疫球蛋白重鏈可變區(qū)，其包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列；以及免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)，其包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列。

在一個(gè)實(shí)施方案中，人源化11E6抗體包含免疫球蛋白重鏈可變區(qū)，其包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列；以及免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)，其包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列。

在一個(gè)實(shí)施方案中，人源化11E6抗體包含免疫球蛋白重鏈可變區(qū)，其包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列；以及免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)，其包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列。

在一個(gè)實(shí)施方案中，人源化11E6抗體包含免疫球蛋白重鏈可變區(qū)，其包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列；以及免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)，其包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列。

在一個(gè)實(shí)施方案中，人源化11E6抗體包含免疫球蛋白重鏈可變區(qū)，其包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列；以及免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)，其包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列。

在其他實(shí)施方案中，人源化11E6抗體包含免疫球蛋白重鏈可變區(qū)，該免疫球蛋白重鏈可變區(qū)包含與SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18的整個(gè)可變區(qū)、互補(bǔ)決定區(qū)或框架區(qū)序列具有至少約50％同一性、約51％同一性、約52％同一性、約53％同一性、約54％同一性、約55％同一性、約56％同一性、約57％同一性、約58％同一性、約59％同一性、約60％同一性、約61％同一性、約62％同一性、約63％同一性、約64％同一性、約65％同一性、約66％同一性、約67％同一性、約68％同一性、約69％同一性、約70％同一性、約71％同一性、約72％同一性、約73％同一性、約74％同一性、約75％同一性、約76％同一性、約77％同一性、約78％同一性、約79％同一性、約80％同一性、約81％同一性、約82％同一性、約83％同一性、約84％同一性、約85％同一性、約86％同一性、約87％同一性、約88％同一性、約89％同一性或約90％同一性的氨基酸序列。

在其他實(shí)施方案中，人源化11E6抗體包含免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)，該免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)包含與SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24的整個(gè)可變區(qū)、互補(bǔ)決定區(qū)或框架區(qū)序列具有至少約50％同一性、約51％同一性、約52％同一性、約53％同一性、約54％同一性、約55％同一性、約56％同一性、約57％同一性、約58％同一性、約59％同一性、約60％同一性、約61％同一性、約62％同一性、約63％同一性、約64％同一性、約65％同一性、約66％同一性、約67％同一性、約68％同一性、約69％同一性、約70％同一性、約71％同一性、約72％同一性、約73％同一性、約74％同一性、約75％同一性、約76％同一性、約77％同一性、約78％同一性、約79％同一性、約80％同一性、約81％同一性、約82％同一性、約83％同一性、約84％同一性、約85％同一性、約86％同一性、約87％同一性、約88％同一性、約89％同一性或約90％同一性的氨基酸序列。

同源性或同一性可以在本領(lǐng)域中的技能內(nèi)的各種方式測(cè)定，例如使用可公開獲得的計(jì)算機(jī)軟件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟件。使用由程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx所采用的算法進(jìn)行的BLAST(基本局部比對(duì)搜索工具)分析(Karlin等人，(1990)PROC.NATL.ACAD.SCI.USA 87,2264-2268；Altschul,(1993)J.Mol.Evol.36,290-300；Altschul等人，(1997)Nucleic Acids Res.25,3389-3402,以引用的方式并入)被定制用于序列相似性搜索。由BLAST程序使用的方法是首先考慮查詢序列與數(shù)據(jù)庫序列之間的相似區(qū)段，,然后評(píng)估所鑒別的所有匹配的統(tǒng)計(jì)顯著性，并且最終僅總結(jié)滿足預(yù)先選擇的顯著性閾值的那些匹配。關(guān)于序列數(shù)據(jù)庫的相似性搜索中的基本問題的論述，參見Altschul等人,(1994)Nature Genetics 6,119-129，其以引用的方式完全并入。本領(lǐng)域技術(shù)人員可確定用于測(cè)量比對(duì)的適當(dāng)參數(shù)，包括在所比較序列的全長上實(shí)現(xiàn)最大比對(duì)所需的任何算法。用于直方圖、說明、比對(duì)、期望值(即，用于報(bào)告針對(duì)數(shù)據(jù)庫序列的匹配的統(tǒng)計(jì)顯著性閾值)、截?cái)?、矩陣和過濾器的搜索參數(shù)均為默認(rèn)設(shè)置。由blastp、blastx、tblastn和tblastx使用的默認(rèn)計(jì)分矩陣是BLOSUM62矩陣(Henikoff等人,(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89,10915-10919，以引用的方式完全并入)。可以將4個(gè)blastn參數(shù)調(diào)整如下：Q＝10(空位產(chǎn)生罰分)；R＝10(空位延伸罰分)；wink＝1(查詢過程中在每個(gè)第wink.sup.位上產(chǎn)生字命中(word hit))；并且gapw＝16(設(shè)置在其內(nèi)產(chǎn)生空位比對(duì)的窗口寬度)。等效的Blastp參數(shù)設(shè)置可以是Q＝9；R＝2；wink＝1；并且gapw＝32。還可使用NCBI(國家生物技術(shù)信息中心)BLAST高級(jí)選項(xiàng)參數(shù)(例如：-G，開放空位的成本[整數(shù)]：對(duì)于核苷酸默認(rèn)值＝5/對(duì)于蛋白質(zhì)默認(rèn)值是11；-E，延伸空位的成本[整數(shù)]：對(duì)于核苷酸默認(rèn)值＝2/對(duì)于蛋白質(zhì)默認(rèn)值是1；-q，核苷酸錯(cuò)配罰分[整數(shù)]：默認(rèn)值＝-3；-r，核苷酸匹配獎(jiǎng)分[整數(shù)]：默認(rèn)值＝1；-e，期望值[實(shí)數(shù)]：默認(rèn)值＝10；-W，字長[整數(shù)]：對(duì)于核苷酸默認(rèn)值＝11/對(duì)于megablast默認(rèn)值是28/對(duì)于蛋白質(zhì)默認(rèn)值是3；-y，對(duì)于blast延伸的位下降(Dropoff)(X)：對(duì)于blastn默認(rèn)值＝20/對(duì)于其他默認(rèn)值是7；-X，對(duì)于空位比對(duì)的X下降值(以位計(jì))：對(duì)于所有程序默認(rèn)值＝15，不可適用于blastn；以及-Z，對(duì)于空位比對(duì)的最終X下降值(以位計(jì))：對(duì)于blastn默認(rèn)值是50，對(duì)于其他默認(rèn)值是25)進(jìn)行搜索。還可使用對(duì)于成對(duì)蛋白質(zhì)比對(duì)的ClustalW(默認(rèn)參數(shù)可包括，例如，Blosum62矩陣并且空位開放罰分＝10并且空位延伸罰分＝0.1)。在GCG程序包10.0版本中可獲得的序列之間的Bestfit比較使用DNA參數(shù)GAP＝50(空位產(chǎn)生罰分)和LEN＝3(空位延伸罰分)，并且蛋白質(zhì)比較中的等效設(shè)置為GAP＝8和LEN＝2。

在前述實(shí)施方案的每個(gè)中，本文考慮免疫球蛋白重鏈可變區(qū)序列和/或輕鏈可變區(qū)序列可包含相對(duì)于SEQ ID NO：1-24的氨基酸改變(例如，氨基酸取代、缺失或插入)。例如，免疫球蛋白重鏈可變區(qū)序列和/或輕鏈可變區(qū)序列可包含獨(dú)立地選自相對(duì)于SEQ ID NO：1-24的取代、缺失或插入的約1至約50個(gè)突變、約1至約40個(gè)突變、約1至約35個(gè)突變、約1至約30個(gè)突變、約1至約25個(gè)突變、約1至約20個(gè)突變、約1至約15個(gè)突變或約1至約10突變。在各種實(shí)施方案中，該免疫球蛋白重鏈可變區(qū)序列和/或輕鏈可變區(qū)序列具有相對(duì)于SEQ ID NO：1-24的約1個(gè)突變、約2個(gè)突變、約3個(gè)突變、約4個(gè)突變、約5個(gè)突變、約6個(gè)突變、約7個(gè)突變、約8個(gè)突變、約9個(gè)突變、約10個(gè)突變、約11個(gè)突變、約12個(gè)突變、約13個(gè)突變、約14個(gè)突變、約15個(gè)突變、約16個(gè)突變、約17個(gè)突變、約18個(gè)突變、約19個(gè)突變、約20個(gè)突變、約21個(gè)突變、約22個(gè)突變、約23個(gè)突變、約24個(gè)突變、約25個(gè)突變、約26個(gè)突變、約27個(gè)突變、約28個(gè)突變、約29個(gè)突變、約30個(gè)突變、約31個(gè)突變、約32個(gè)突變、約33個(gè)突變、約34個(gè)突變、約35個(gè)突變、約36個(gè)突變、約37個(gè)突變、約38個(gè)突變、約39個(gè)突變、約40個(gè)突變、約41個(gè)突變、約42個(gè)突變、約43個(gè)突變、約44個(gè)突變、約45個(gè)突變、約46個(gè)突變、約47個(gè)突變、約48個(gè)突變、約49個(gè)突變或約50個(gè)突變?？刹⑷氲恼f明性氨基酸包括親水性氨基酸殘基，其可包括選自精氨酸(R)和賴氨酸(K)的極性且?guī)д姾傻挠H水性殘基，選自天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、脯氨酸(P)和半胱氨酸(C)的極性且中性電荷的親水性殘基，選自天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)的極性且?guī)ж?fù)電荷的親水性殘基，或包括組氨酸(H)的芳香族、極性且?guī)д姾傻挠H水性殘基；疏水性氨基酸殘基，其可包括選自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、異亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)或纈氨酸(V)的疏水性、脂肪族氨基酸，或選自苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)或酪氨酸(Y)的疏水性、芳香族氨基酸。

抗體結(jié)合特異性表位的能力可通過平衡解離常數(shù)(K_D)來進(jìn)行描述。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供人源化1B7抗體，該抗體結(jié)合百日咳毒素蛋白的K_D為約20nM或更低、或約15nM或更低、或約10nM或更低、或約5nM或更低。在一個(gè)實(shí)施方案中，人源化1B7抗體結(jié)合百日咳毒素蛋白的K_D為約5nM或更低或約3nM或更低。在示例性實(shí)施方案中，人源化1B7抗體結(jié)合百日咳毒素蛋白的K_D為約5nM、約4.5nM、約4nM、約3.5nM、約3nM、約2.5nM、約2nM、約1.5nM、約1nM或約0.5nM。

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供人源化11E6抗體，該抗體結(jié)合百日咳毒素蛋白的K_D為約20、約19、或約18、或約17、或約16、或約15nM或更低。在一個(gè)實(shí)施方案中，人源化11E6抗體結(jié)合百日咳毒素蛋白的K_D為12nM或更低。在示例性實(shí)施方案中，人源化1B7抗體結(jié)合百日咳毒素蛋白的K_D為約15nM、約14.5nM、約14nM、約13.5nM、約13nM、約12.5nM、約12nM、約11.5nM、約11nM、約10.5nM、約10nM、約9.5nM、約9nM、約8.5nM、約8nM、約7.5nM、約7nM、約6.5nM、約6nM、約5.5_nM、約5nM、約4.5nM、約4nM、約3.5nM、約3nM、約2.5nM、約2nM、約1.5nM、約1_nM或約0.5_nM。

在一些實(shí)施方案中，本文描述的人源化抗體與能夠結(jié)合百日咳毒素蛋白的抗體競(jìng)爭。在該人源化抗體與抗體(競(jìng)爭者抗體)競(jìng)爭結(jié)合百日咳毒素蛋白的情況下，本發(fā)明的人源化抗體將競(jìng)爭者抗體的結(jié)合抑制(完全地或部分地)至可測(cè)量的程度。結(jié)合的抑制可通過本領(lǐng)域中已知的任何方法來測(cè)量。一般來說，如果在人源化抗體存在下，競(jìng)爭者抗體與抗原的結(jié)合被減少至少約10％、至少約20％、至少約30％、至少約40％、至少約50％、至少約60％、至少約70％、至少約80％或至少約90％，則認(rèn)為人源化抗體競(jìng)爭性地抑制競(jìng)爭者抗體的結(jié)合(例如，如由Sato等人,(1990),Infection and Immunity,58(10)：3369-3374所描述的小鼠1B7或11E6抗體，或如由Maynard等人，美國專利號(hào)8,653,243所描述的人源化1B7抗體，這些文獻(xiàn)以引用的方式整體并入本文)。因此，在一些實(shí)施方案中，本文提供的抗體與如由Sato等人,(1990),Infection and Immunity,58(10)：3369-3374所描述的小鼠1B7或11E6抗體競(jìng)爭性地結(jié)合百日咳毒素蛋白。在其他實(shí)施方案中，本文提供的抗體抑制(完全地或部分地)小鼠1B7或11E6抗體的結(jié)合。在一些另外實(shí)施方案中，本文提供的抗體在競(jìng)爭測(cè)定中使小鼠1B7或11E6抗體的結(jié)合減少約10％、約20％、約30％、約40％、約50％、約60％、約70％、約80％、約90％或約100％。

雖然在實(shí)施方案中說明的實(shí)施方案可包含成對(duì)可變區(qū)、成對(duì)全長抗體鏈或成對(duì)CDR1、CDR2和CDR3區(qū)(一個(gè)來自重鏈且一個(gè)來自輕鏈)，但熟練的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到替代實(shí)施方案可包含單一重鏈可變區(qū)或單一輕鏈可變區(qū)、單一全長抗體鏈、或來自一個(gè)抗體鏈(重鏈或輕鏈)的CDR1、CDR2和CDR3區(qū)。

抗體的產(chǎn)生

本文描述了用于產(chǎn)生本發(fā)明的抗體的方法。例如，編碼輕鏈可變區(qū)和/或重鏈可變區(qū)的DNA分子可使用本文提供的序列信息來化學(xué)合成。合成DNA分子可連接至其他適當(dāng)?shù)暮塑账嵝蛄?包括，例如恒定區(qū)編碼序列和表達(dá)控制序列)，以產(chǎn)生編碼所需抗體的基因表達(dá)構(gòu)建體?？商娲?，本文提供的序列可使用合成核酸探針，通過雜交技術(shù)或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)來從雜交瘤中進(jìn)行克隆。

編碼所需抗體的核酸可并入(連接)至表達(dá)載體中，所述表達(dá)載體可通過轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)引入到宿主細(xì)胞中。例如，編碼所需抗體的核酸可通過逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)并入宿主細(xì)胞中。示例性宿主細(xì)胞是大腸桿菌(E.coli)細(xì)胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、人胚腎293(HEK293)細(xì)胞、海拉(HeLa)細(xì)胞、幼倉鼠腎(BHK)細(xì)胞、猴腎細(xì)胞(COS)、人肝細(xì)胞癌細(xì)胞(例如，Hep G2)以及不另外地產(chǎn)生IgG蛋白的骨髓瘤細(xì)胞。轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞可在容許所述宿主細(xì)胞表達(dá)編碼免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)和/或重鏈可變區(qū)的基因的條件下進(jìn)行生長。

具體表達(dá)和純化條件將取決于所采用的表達(dá)系統(tǒng)而不同。例如，如果基因有待在大腸桿菌中表達(dá)，則首先通過將工程化的基因定位在適合的細(xì)菌啟動(dòng)子(例如Trp或Tac)和原核信號(hào)序列下游來將所述基因克隆至表達(dá)載體中。所表達(dá)的分泌性蛋白積聚在折射體或包涵體中，并且可在通過弗氏壓碎器或超聲處理破壞細(xì)胞之后收獲。然后使折射體溶解，并且使蛋白質(zhì)通過本領(lǐng)域中已知的方法再折疊且裂解。

如果工程化的基因有待在真核宿主細(xì)胞(例如，CHO細(xì)胞)中表達(dá)，則首先將工程化的基因插入含有適合的真核啟動(dòng)子、分泌信號(hào)、IgG增強(qiáng)子以及各種內(nèi)含子的表達(dá)載體中。該表達(dá)載體任選地含有編碼恒定區(qū)的全部或一部分的序列，從而使得能夠表達(dá)重鏈或輕鏈的全部或一部分?？墒褂棉D(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)將基因構(gòu)建體引入真核宿主細(xì)胞中。該宿主細(xì)胞表達(dá)V_L或V_H片段、V_L-V_H異二聚體、V_H-V_L或V_L-V_H單鏈多肽、完整免疫球蛋白重鏈或輕鏈或其部分，其各自可連接至具有另一功能的部分。在一些實(shí)施方案中，將宿主細(xì)胞用表達(dá)多肽的單一載體轉(zhuǎn)染，該多肽表達(dá)重鏈(例如，重鏈可變區(qū))或輕鏈(例如，輕鏈可變區(qū))的全部或一部分。在其他實(shí)施方案中，將宿主細(xì)胞用編碼(a)包含重鏈可變區(qū)的多肽和包含輕鏈可變區(qū)的多肽，或(b)整個(gè)免疫球蛋白重鏈和整個(gè)免疫球蛋白輕鏈的單一載體轉(zhuǎn)染。在仍然其他實(shí)施方案中，將宿主細(xì)胞用多于一種表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染(例如，表達(dá)包含重鏈或重鏈可變區(qū)的全部或一部分的多肽的一種表達(dá)載體，和表達(dá)包含輕鏈或輕鏈可變區(qū)的全部或一部分的多肽的另一種表達(dá)載體)。

包含免疫球蛋白重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)的多肽可通過在容許表達(dá)該多肽的條件下生長用編碼所述可變區(qū)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞來產(chǎn)生。在表達(dá)之后，可使用本領(lǐng)域中熟知的技術(shù)，例如親和標(biāo)簽如谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)和組氨酸標(biāo)簽或通過色譜法(作為非限制性實(shí)例，基于大小、電荷和/或特異性結(jié)合)來收獲和純化所述多肽。

結(jié)合百日咳毒素蛋白的單克隆抗體或所述抗體的抗原結(jié)合片段可通過生長用以下各項(xiàng)轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞來產(chǎn)生：(a)編碼完整或部分的免疫球蛋白重鏈的表達(dá)載體和編碼完整或部分的免疫球蛋白輕鏈的單獨(dú)表達(dá)載體；或(b)在容許所述兩個(gè)鏈表達(dá)的條件下編碼兩個(gè)鏈(例如，完整或部分的重鏈和輕鏈)的單一表達(dá)載體。可使用本領(lǐng)域中已知的技術(shù)，例如蛋白A、蛋白G、親和標(biāo)簽如谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)標(biāo)簽和組氨酸標(biāo)簽或通過色譜法來收獲且純化所述完整抗體(或抗原結(jié)合片段)。從單一表達(dá)載體或從兩個(gè)單獨(dú)的表達(dá)載體表達(dá)該重鏈和該輕鏈處于本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)。

抗體修飾

存在本領(lǐng)域中已知的用于降低或消除抗體和抗體片段的抗原性的標(biāo)準(zhǔn)方法。當(dāng)抗體有待施用至人時(shí)，該抗體優(yōu)選地是“人源化的”以降低或消除人體內(nèi)的抗原性?？紤]人源化抗體具有與其來源的非人源化小鼠抗體至少相同或基本上相同的抗原親和力。

然而，應(yīng)注意雖然人源化方法是本領(lǐng)域中已知的，但這類人源化方法經(jīng)常受親和力降低(例如，相對(duì)于原始鼠抗體)阻礙。不希望受理論限制，這可能是由于以下事實(shí)：CDR不由人框架維持可工作構(gòu)型。在這種情況下，對(duì)人框架序列進(jìn)行少量變化。這些單獨(dú)氨基酸變化在不造成與人抗體結(jié)構(gòu)的顯著偏差的情況下改進(jìn)親和力，以使得抗體繼續(xù)類似于人抗體。以所述方式，抗體可出于治療目的用于人體中而不誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。氨基酸改變的選擇以及有待進(jìn)行的特定變化是本發(fā)明的一部分。

在一種人源化方法中，產(chǎn)生嵌合蛋白，其中小鼠免疫球蛋白恒定區(qū)被人免疫球蛋白恒定區(qū)置換。參見例如，Morrison等人,1984,Proc.Nat.Acad.Sci.81：6851-6855；Neuberger等人,1984,Nature 312：604-608；美國專利號(hào)6,893,625(Robinson)；5,500,362(Robinson)；以及4,816,567(Cabilly)。例如，在一些實(shí)施方案中，SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：19中的任一個(gè)可以是與人恒定區(qū)配對(duì)的可變區(qū)。

在被稱為CDR接枝的方法中，輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的CDR被接枝至來自另一物種的框架中。例如，參與抗原結(jié)合的鼠CDR和非-CDR殘基可被接枝至人序列中。還可以接枝參與維持組合位點(diǎn)結(jié)構(gòu)的殘基和參與維持V_L：V_H接觸的殘基。CDR接枝描述于美國專利號(hào)7,022,500(Queen)；6,982,321(Winter)；6,180,370(Queen)；6,054,297(Carter)；5,693,762(Queen)；5,859,205(Adair)；5,693,761(Queen)；5,565,332(Hoogenboom)；5,585,089(Queen)；5,530,101(Queen)；Jones等人(1986)Nature 321：522-525；Riechmann等人(1988)Nature 332：323-327；Verhoeyen等人(1988)Science 239：1534-1536；以及Winter(1998)FEBS Lett 430：92-94。

在被稱為縮短CDR的接枝的一種方法中，參與抗原結(jié)合的縮短CDR(如由Padlan等人,(1995)Faseb J 9：133-139所定義)和非CDR殘基被移植至人序列中。還可以接枝參與維持組合位點(diǎn)結(jié)構(gòu)的殘基和參與維持V_L∶V_H接觸的殘基。

用于降低免疫原性的其他方法包括“SDR-轉(zhuǎn)移”、“鑲飾”和“Frankensteining”。參見例如，Padlan等人,(1995)Faseb J 9：133-139；Wu等人,(1992)Mol Immunol 29：1141-1146；以及Padlan等人,(1991)Mol Immunol 28：489-498。在SDR轉(zhuǎn)移方法中，參與抗原結(jié)合的殘基(即，特異性決定殘基或SDR)被移植至人序列中。還可以移植參與維持組合位點(diǎn)結(jié)構(gòu)的殘基和參與維持V_L∶V_H接觸的殘基。在鑲飾方法中，鼠抗體中的表面可及氨基酸殘基被更頻繁地在人抗體中的相同位置處發(fā)現(xiàn)的氨基酸殘基置換。例如，暴露于溶劑的框架殘基被來自人序列的其同源物置換。保留參與抗原結(jié)合的CDR和非CDR殘基。在Frankensteining方法中，將CDR移植至從最相似的人框架區(qū)構(gòu)建的復(fù)合序列中。還可以移植參與維持組合位點(diǎn)結(jié)構(gòu)的殘基和參與維持V_L∶V_H接觸的殘基。

任何適合的方法(包括上述方法中的任一種)可用于降低或消除抗體的人免疫原性。

此外，有可能在小鼠中產(chǎn)生完全人抗體。缺乏任何非人序列的完全人mAb可通過在例如Lonberg等人,Nature 368：856-859,1994；Fishwild等人,Nature Biotechnology 14：845-851,1996；和Mendez等人,Nature Genetics 15：146-156,1997中提及的技術(shù)從人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行制備。還可通過在例如Knappik等人,J.Mol.Biol.296：57-86,2000；和Krebs等人,J.Immunol.Meth.254：67-84 2001)中提及的技術(shù)從噬菌體展示文庫制備和優(yōu)化人mAb。

如果所述抗體用作治療劑，則可使用標(biāo)準(zhǔn)體外綴合化學(xué)將其綴合至效應(yīng)劑如小分子或放射性核素。如果效應(yīng)劑是多肽，則可將抗體化學(xué)綴合至效應(yīng)子或連接至效應(yīng)子作為融合蛋白。融合蛋白的構(gòu)建在在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技能內(nèi)。

使用抗體的方法

一方面，本發(fā)明的方法涉及治療具有百日咳博德特氏桿菌的患者，所述方法包括向所述患者施用人源化1B7抗體(例如以有效量)和/或人源化11E6抗體(例如以有效量)或包含所述一種或多種抗體的藥物組合物。

另一方面，本發(fā)明的方法涉及一種預(yù)防百日咳博德特氏桿菌感染的方法，所述方法包括向患者施用人源化1B7抗體(例如以有效量)和/或人源化11E6抗體(例如以有效量)或包含所述一種或多種抗體的藥物組合物，并且在一些實(shí)施方案中，所述患者處于百日咳博德特氏桿菌感染的風(fēng)險(xiǎn)(例如，所述患者是疫苗接種前嬰兒和/或所述患者已暴露于百日咳毒素)。

白細(xì)胞增多或白血細(xì)胞計(jì)數(shù)升高是百日咳博德特氏桿菌感染的特征。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括降低患者中的白血細(xì)胞計(jì)數(shù)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法產(chǎn)生白細(xì)胞增多的消退加速。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法產(chǎn)生在感染過程期間最大白血細(xì)胞計(jì)數(shù)的降低。

在各種實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法產(chǎn)生患者中百日咳的改善。在一個(gè)實(shí)施方案中，患者的咳嗽癥狀得以改善。例如，所述方法降低患者中咳嗽的頻率或咳嗽次數(shù)(或咳嗽發(fā)作)。在各種實(shí)施方案中，所述方法使咳嗽次數(shù)或咳嗽發(fā)作減少至少約1次/小時(shí)、至少約2次/小時(shí)、至少約3次/小時(shí)、至少約4次/小時(shí)、至少約5次/小時(shí)、至少約6次/小時(shí)、至少約7次/小時(shí)、至少約8次/小時(shí)、至少約9次/小時(shí)、至少約10次/小時(shí)、至少約15次/小時(shí)、至少約20次/小時(shí)、至少約25次/小時(shí)、至少約30次/小時(shí)、至少約35次/小時(shí)、至少約40次/小時(shí)、至少約45次/小時(shí)、至少約50次/小時(shí)、至少約55次/小時(shí)、至少約60次/小時(shí)、至少約65次/小時(shí)、至少約70次/小時(shí)、至少約75次/小時(shí)、至少約80次/小時(shí)、至少約85次/小時(shí)、至少約90次/小時(shí)、至少約95次/小時(shí)或至少約100次/小時(shí)。在另一個(gè)實(shí)例中，所述方法減少患者中咳嗽的持續(xù)時(shí)間。例如，所述方法使感染過程期間咳嗽的持續(xù)時(shí)間減少至少約三個(gè)月、約兩個(gè)月、約一個(gè)月、約4周、約3周、約2周、約1周、約5天、約4天、約3天、約2天或約1天。在另一實(shí)施方案中，喘息的次數(shù)在患者中減少。

在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法降低患者的鼻咽中百日咳博德特氏桿菌細(xì)菌的水平。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法降低患者的肺中百日咳博德特氏桿菌細(xì)菌的水平(例如，細(xì)菌肺定殖)。例如，所述方法使鼻咽和/或肺中的百日咳博德特氏桿菌水平降低約95％、約90％、約80％、約70％、約60％、約50％、約40％、約30％、約20％、約10％或約5％。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法產(chǎn)生百日咳毒素蛋白的中和(抑制或拮抗)。例如，本發(fā)明的抗體可結(jié)合百日咳毒素蛋白以便部分或完全抑制百日咳毒素蛋白的一種或多種生物活性。中和抗體可抑制或阻斷的百日咳毒素蛋白的生物活性之一是百日咳毒素蛋白結(jié)合細(xì)胞受體的能力。百日咳毒素蛋白的受體結(jié)合區(qū)由分別被稱為亞基S2、亞基S3、亞基S4和亞基S5的四個(gè)多肽亞基組成。由百日咳毒素蛋白的亞基S2、S3、S4和S5結(jié)合的細(xì)胞受體的實(shí)例是N連接的唾液酸糖蛋白家族的成員如胎球蛋白、結(jié)合珠蛋白(haptoblobin)和轉(zhuǎn)鐵蛋白。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，本發(fā)明的人源化抗體防止百日咳毒素蛋白結(jié)合其細(xì)胞受體。在另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明的人源化抗體改變百日咳毒素的細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸步驟，以使得所述毒素不會(huì)到達(dá)細(xì)胞胞質(zhì)。百日咳毒素蛋白的可通過本發(fā)明的抗體抑制的另一種重要活性是百日咳毒素蛋白作為針對(duì)G蛋白的ADP核糖基酶的酶活性。百日咳毒素蛋白中賦予作為ADP核糖基酶的酶活性的亞基是亞基S1。在一些實(shí)施方案中，百日咳毒素蛋白是百日咳海參毒素。在本文被稱為百日咳毒素蛋白的百日咳海參毒素包含所有五個(gè)百日咳毒素蛋白亞基。在其他實(shí)施方案中，百日咳毒素蛋白是截短的百日咳毒素蛋白。如在本文提及的截短的百日咳蛋白包含百日咳毒素蛋白亞基(即，S1、S2、S3、S4和S5)中的至少一個(gè)。各種形式的百日咳毒素蛋白描述于例如美國專利號(hào)8,653,243中，所述專利以引用的方式整體并入本文。

在各種實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物和方法適用于治療或預(yù)防百日咳感染的任何階段。例如，百日咳的潛伏期通常是7–10天，范圍是4–21天，并且很少可以是長達(dá)42天。在各種實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物和方法通過使感染更難以發(fā)生來增加潛伏期的長度。該疾病的臨床病程被分成三個(gè)階段。第一階段，卡他性階段，特征在于鼻炎的發(fā)病隱襲、打噴嚏、低熱和溫和、偶爾咳嗽，類似于感冒?？人灾饾u變得更嚴(yán)重，并且在1-2周之后，第二或陣發(fā)性階段開始。在各種實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物和方法減少卡他性階段的長度并且任選地防止它進(jìn)展至陣發(fā)性階段。在各種實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物和方法治療鼻炎、打噴嚏、低熱和咳嗽中的一種或多種。其正是在通常疑似診斷百日咳的陣發(fā)性階段期間。典型地，患者具有大量、快速咳嗽的突發(fā)或陣發(fā)，顯然是由于將稠厚粘液從氣管支氣管樹驅(qū)逐出的困難所致。在陣發(fā)結(jié)束時(shí)，長吸氣努力通常伴隨特征性高聲喘息。在這種發(fā)作中，患者可能變得發(fā)紺。兒童和嬰幼兒尤其出現(xiàn)非常不適和痛苦。在發(fā)作之后通常是嘔吐和疲憊。在各種實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物和方法減少陣發(fā)的量和/或頻率。在各種實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物和方法防止患者變得發(fā)紺。陣發(fā)性發(fā)作更頻繁地在夜間發(fā)生，平均每24小時(shí)15次發(fā)作。在此階段的最初1或2周，發(fā)作頻率增加，對(duì)于2至3周保持在相同水平，且然后逐漸降低。陣發(fā)性階段通常持續(xù)1至6周，但可能持續(xù)長達(dá)10周。在各種實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物和方法減少此階段的長度。在恢復(fù)期，恢復(fù)是逐漸的?？人宰兊藐嚢l(fā)性降低且在2至3周消失。在各種實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物和方法加速此階段的發(fā)作和/或減少其持續(xù)時(shí)間。此外，在各種實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物和方法預(yù)防或減少陣發(fā)的復(fù)發(fā)，所述復(fù)發(fā)可能與隨后呼吸道感染一起發(fā)生。在各種實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物和方法預(yù)防或減少一種或多種以下發(fā)作：繼發(fā)性細(xì)菌性肺炎、神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥如癲癇和腦病、缺氧、中耳炎、脫水、氣胸、鼻出血、硬腦膜下血腫、疝、直腸脫垂、睡眠困難、尿失禁、肺炎以及肋骨骨折。此外，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物和方法減少或預(yù)防壞死性細(xì)支氣管炎、肺炎(例如，來自百日咳博德特氏桿菌)、肺水腫、肺高血壓癥和死亡。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法涉及將人源化1B7抗體和人源化11E6抗體共同施用至患者。在一些實(shí)施方案中，共同施用產(chǎn)生協(xié)同作用。共同施用人源化1B7抗體和人源化11E6抗體可以是同時(shí)的或順序的。

在一些實(shí)施方案中，人源化1B7抗體和人源化11E6抗體被同時(shí)施用至受試者。如本文所用的術(shù)語“同時(shí)”意指人源化1B7抗體和人源化11E6抗體以不超過約60分鐘、如不超過約30分鐘、不超過約20分鐘、不超過約10分鐘、不超過約5分鐘或不超過約1分鐘的時(shí)間間隔施用。施用人源化1B7抗體和人源化11E6抗體可通過同時(shí)施用單一制劑(例如包含人源化1B7抗體和人源化11E6抗體的制劑)或單獨(dú)試劑(例如，包含人源化1B7抗體的第一制劑和包含人源化11E6抗體的第二制劑)來進(jìn)行。

共同施用不要求治療劑同時(shí)施用，如果它們的施用的定時(shí)是使得人源化1B7抗體和11E6抗體的藥理學(xué)活性在時(shí)間上重疊，從而施加組合治療作用。例如，人源化1B7抗體和人源化11E6抗體可順序地施用。如本文所用的術(shù)語“順序地”意指人源化1B7抗體和人源化11E6抗體以超過約60分鐘的時(shí)間間隔施用。例如，人源化1B7抗體和人源化11E6抗體的順序施用之間的時(shí)間可以是超過約60分鐘、超過約2小時(shí)、超過約5小時(shí)、超過約10小時(shí)、超過約1天、超過約2天、超過約3天或超過約1周間隔。任選的施用時(shí)間將取決于代謝速率、排泄速率和/或所施用的人源化1B7抗體和人源化11E6抗體的藥代動(dòng)力學(xué)活性。

例如，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體在血清濃度方面具有施用后至少約30、或約35、或約40、或約45、或約50、或約55、或約60、或約65、或約70、或約75、或約80小時(shí)或至少約1天、約2天、約3天、約4天、約5天、約6天、約7天、約8天、約9天、約10天、約11天、約12天、約13天、約14天、約15天、約16天、約17天、約18天、約19天、約20天、約21天、約22天、約23天、約24天、或約25天的峰值(例如，β半衰期)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體具有延長的半衰期。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體具有約200、或約225、或約250、或約275、或約300小時(shí)或約7天、約8天、約9天、約10天、約11天、約12天、約13天、約14天、約15天、約16天、約17天、約18天、約19天、約20天、約21天、約22天、約23天、約24天、約25天、約26天、約27天、約28天、約29天、約30天、約31天、約32天、約33天、約34天、或約35天，例如約1或約2周、或約3周、約4周、或約5周的體內(nèi)半衰期。

因此，在一些實(shí)施方案中，患者可接受本發(fā)明抗體的第一施用(例如，輸注或肌內(nèi)(IM)注射)作為治療方法的一部分，并且可在本發(fā)明的抗體的血清濃度和/或體內(nèi)半衰期的峰值之后接受另一施用(例如，輸注或肌內(nèi)注射)(例如，所述另一施用的劑量可與所述第一施用相同或可更低，例如，維持劑量)。在一些實(shí)施方案中，所述另一施用是距所述第一施用約一天，或距所述第一施用約一周。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法提供每周(或約每5或6或7或10天)約1-3(例如，約1、約2或約3)個(gè)劑量(例如，IV劑量或IM劑量)的本發(fā)明的抗體。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法在血清中維持約5μg/mL、約10μg/mL、約20μg/mL、約25μg/mL、約50μg/mL、約75μg/mL、或約100μg/mL、或約125μg/mL、或約150μg/mL、或約175μg/mL、或約200μg/mL、或約225μg/mL、或約250μg/mL、或約300μg/mL的抗體水平的治療窗。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法允許不頻繁給藥和/或較少給藥(例如，允許較少且不太頻繁的給藥的較長半衰期)。

可首先施用人源化1B7抗體或人源化11E6抗體。例如，可在施用人源化11E6抗體的時(shí)間之后向受試者施用人源化1B7抗體。在這種情況下，通常合乎需要的是在約50％(例如，在約40％、約30％、約20％、約10％或約5％)的人源化11E6抗體被受試者代謝或排泄的時(shí)間或在人源化11E6抗體已達(dá)到約50％、約60％、約70％、約80％、約90％或約100％的其藥代動(dòng)力學(xué)活性的時(shí)間之前施用人源化1B7抗體。在另一個(gè)實(shí)例中，可在施用人源化11E6抗體之前向受試者施用人源化1B7抗體。在這種情況下，通常合乎需要的是在約50％(例如，在約40％、約30％、約20％、約10％或約5％)的人源化1B7抗體被受試者代謝或排泄的時(shí)間或在所施用的人源化1B7抗體已達(dá)到約50％、約60％、約70％、約80％、約90％或約100％的其藥代動(dòng)力學(xué)活性的時(shí)間之前施用人源化11E6抗體。

共同施用也不要求治療劑通過同一施用途徑施用至患者。而是，每種治療劑可通過任何適當(dāng)?shù)耐緩嚼缥改c外或非胃腸外來施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述治療劑可口服施用至受試者。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述治療劑可胃腸外施用，包括例如靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下和關(guān)節(jié)內(nèi)注射和輸注等。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述治療劑可通過肌內(nèi)注射施用至受試者。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括向患者施用人源化1B7抗體和/或11E6抗體連同抗微生物劑。預(yù)期共同施用人源化1B7抗體和/或11E6抗體連同抗微生物劑產(chǎn)生協(xié)同作用。可用于本發(fā)明的說明性抗微生物劑包括但不限于阿奇霉素、克拉霉素、紅霉素、三甲氧芐二氨嘧啶-磺胺甲噁唑、羅紅霉素、酮內(nèi)脂(例如，泰利霉素)、氨芐西林、阿莫西林、四環(huán)素、氯霉素、氟喹諾酮(例如，環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、氧氟沙星、莫西沙星)以及頭孢菌素。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗微生物劑是紅霉素。

在各種實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法治療人患者。在一個(gè)實(shí)施方案中，人患者是嬰兒。在一個(gè)實(shí)施方案中，人患者是新生兒。在另一個(gè)實(shí)施方案中，人患者是小于四周、小于三周、小于兩周、小于一周、小于六天、小于五天、小于四天、小于三天、小于兩天或小于一天的新生兒。在一些實(shí)施方案中，所述人是一個(gè)月大、兩個(gè)月大、三個(gè)月大、四個(gè)月大、五個(gè)月大或六個(gè)月大。在一些實(shí)施方案中，人具有在約6至約18個(gè)月、約18至約36個(gè)月、約1至約5歲、約5至約10歲、約10至約15歲、約15至約20歲、約20至約25歲、約25至約30歲、約30至約35歲、約35至約40歲、約40至約45歲、約45至約50歲、約50至約55歲、約55至約60歲、約60至約65歲、約65至約70歲、約70至約75歲、約75至約80歲、約80至約85歲、約85至約90歲、約90至約95歲或約95至約100歲范圍內(nèi)的年齡。

另一方面，本發(fā)明的方法預(yù)防先前暴露于百日咳博德特氏桿菌細(xì)菌的受試者的百日咳博德特氏桿菌感染，該方法包括向受試者施用人源化1B7抗體和/或人源化11E6抗體或包含所述一種或多種抗體的藥物組合物。在各種實(shí)施方案中，該方法提供在預(yù)防暴露于百日咳博德特氏桿菌細(xì)菌的受試者的百日咳博德特氏桿菌感染方面的有效預(yù)防性治療。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體(例如，人源化hu1B7抗體和/或hu11E6抗體)用于先前尚未針對(duì)所述細(xì)菌疫苗接種的受試者中的預(yù)防性應(yīng)用。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體在受試者接受百日咳疫苗接種之前作為預(yù)防性治療施用至所述受試者。在各種實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體用于小于一歲、小于十一個(gè)月、小于十個(gè)月、小于九個(gè)月、小于八個(gè)月、小于七個(gè)月、小于六個(gè)月、小于五個(gè)月、小于四個(gè)月、小于三個(gè)月、小于二個(gè)月、小于一個(gè)月、小于四周、小于三周、小于二周、小于一周、小于六天、小于五天、小于四天、小于三天、小于兩天或小于一天的受試者的預(yù)防性治療中。因此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法涉及橋接?jì)雰夯颊咧谐錾c疫苗接種之間的時(shí)間。

在各種實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法治療或預(yù)防先前針對(duì)百日咳博德特氏桿菌細(xì)菌疫苗接種的受試者的百日咳博德特氏桿菌感染。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述受試者是用DtaP(例如，INFANRIX(具有三種抗原，主要是百日咳毒素(PT)和FHA)、TRIPEDIA(其包含相等量的兩種組分，F(xiàn)HA和PT)和DAPTACEL(其包含五種組分，PT、FHA、百日咳桿菌粘附素以及2型和3型菌毛))疫苗接種的嬰兒或兒童。在另一實(shí)施方案中，所述受試者是用百日咳加強(qiáng)疫苗Tdap(例如BOOSTRIX(具有三種百日咳抗原(PT、FHA和百日咳桿菌粘附素)，相較于INFANRIX以減少的量)和ADACEL(具有與DAPTACEL相同的五種百日咳組分，但具有減少量的PT)疫苗接種的成人。在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的患者可以或可以未接受以下百日咳組合疫苗中的任一種：PEDIARIX、PENTACEL或KINRIX。

預(yù)期本發(fā)明的人源化抗體還可充當(dāng)用于疫苗接種如DtaP或Tdap的佐劑。此外，在各種實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法治療或預(yù)防先前尚未針對(duì)百日咳博德特氏桿菌細(xì)菌疫苗接種的受試者的百日咳博德特氏桿菌感染。

在各種實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物和方法補(bǔ)充或代替用帕利珠單抗(SYNAGIS)治療。

在各種實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物和方法可治療具有不同菌株作為其病因?qū)W的百日咳感染，包括作為非限制性實(shí)例，百日咳桿菌粘附素陰性百日咳。

此外，副百日咳博德特氏桿菌是緊密相關(guān)的物種百日咳博德特氏桿菌。兩種細(xì)菌與人中百日咳的爆發(fā)相關(guān)并且產(chǎn)生類似的毒力因子。百日咳博德特氏桿菌和副百日咳博德特氏桿菌的共感染并不罕見。因此，在本發(fā)明的一方面，本發(fā)明的方法涉及治療具有副百日咳博德特氏桿菌的患者，所述方法包括向所述患者施用人源化1B7抗體和/或人源化11E6抗體或包含所述一種或多種抗體的藥物組合物。在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明的方法預(yù)防先前暴露于副百日咳博德特氏桿菌細(xì)菌的受試者的副百日咳博德特氏桿菌感染，所述方法包括向所述受試者施用人源化1B7抗體和/或人源化11E6抗體或包含所述一種或多種抗體的藥物組合物。

在各種實(shí)施方案中，當(dāng)在感染后約3個(gè)月時(shí)將人源化1B7抗體和/或人源化11E6抗體施用至患者時(shí)，本發(fā)明的方法有效于治療百日咳博德特氏桿菌感染和/或副百日咳博德特氏桿菌感染。在其他實(shí)施方案中，當(dāng)在感染后約2個(gè)月、約1個(gè)月、約4周、約3周、約2周、約7天、約6天、約5天、約4天、約3天、約2天或約1天時(shí)將人源化1B7抗體和/或人源化11E6抗體施用至患者時(shí)，本發(fā)明的方法有效于治療百日咳博德特氏桿菌感染和/或副百日咳博德特氏桿菌感染。在一個(gè)實(shí)施方案中，人源化1B7抗體和/或人源化11E6抗體在感染當(dāng)天施用至患者。

如本文所用，“治療(treat)”、“治療(treating)”和“治療(treatment)”意指治療哺乳動(dòng)物，例如人中的疾病。在各種實(shí)施方案中，這包括：(a)抑制所述疾病，即阻止其發(fā)展和/或(b)減輕所述疾病，即引起疾病狀態(tài)的消退。

藥物組合物和施用

可施用本發(fā)明的藥物組合物以用于治療性和/或預(yù)防性治療。出于這類用途，抗體優(yōu)選地與藥學(xué)上可接受的載體組合。如本文所用，“藥學(xué)上可接受的載體”意指適合用于與人類和動(dòng)物的組織相接觸而無過度毒性、刺激、過敏反應(yīng)或其他問題或并發(fā)癥，與合理的益處/風(fēng)險(xiǎn)比相稱的緩沖劑、載體和賦形劑。載體在與制劑的其他成分可相容并且對(duì)接受者無害的意義上必須是“可接受的”。藥學(xué)上可接受的載體包括與藥物施用相容的緩沖劑、溶劑、分散介質(zhì)、包衣劑、等滲及吸收延遲劑等。所述介質(zhì)和試劑用于藥學(xué)活性物質(zhì)在本領(lǐng)域中是已知的。

含有抗體的藥物組合物(如本文公開的那些)可以劑量單位形式呈遞并且可通過任何適合的方法來制備。藥物組合物應(yīng)被配制為與其預(yù)定的施用途徑相容。施用途徑的實(shí)例包括口服、鼻內(nèi)、肺部、靜脈內(nèi)(IV)、真皮內(nèi)、吸入、經(jīng)皮、局部、經(jīng)粘膜、皮下、肌內(nèi)(IM)、腹膜內(nèi)以及經(jīng)直腸施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，施用本發(fā)明的抗體的途徑是IV輸注。在另一個(gè)實(shí)施方案中，施用本發(fā)明的抗體的途徑是IM注射。

有用的制劑可通過藥物領(lǐng)域中熟知的方法來制備。例如，本發(fā)明的藥物組合物可被配制為膠體分散系統(tǒng)、大分子復(fù)合物、納米膠囊、微球、珠粒、水包油型乳液、膠束、混合膠束或脂質(zhì)體。例如，參見Remington′s Pharmaceutical Sciences,第18版(Mack Publishing Com pany,1990)。

適用于胃腸外施用的制劑組分包括無菌稀釋劑，如注射用水、生理鹽水溶液、不揮發(fā)性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑；抗細(xì)菌劑，如苯甲醇或?qū)αu基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，如EDTA；緩沖劑，如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；以及用于調(diào)整張力的試劑，如氯化鈉或右旋糖。

對(duì)于靜脈內(nèi)施用，適合的載體包括生理鹽水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF,Parsippany,NJ)或磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。所述載體應(yīng)是在制造和儲(chǔ)存條件下穩(wěn)定的，并且應(yīng)針對(duì)微生物進(jìn)行保存。載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇)及其適合混合物。

本文提供的組合物(單獨(dú)地或與其他適合的組分組合)可被制成為待經(jīng)由吸入施用的氣霧劑制劑(即，“霧化”)。氣霧劑制劑可被置于加壓可接受的推進(jìn)劑中，如二氯二氟甲烷、丙烷、氮等。

藥物制劑優(yōu)選地是無菌的。滅菌可例如通過經(jīng)由無菌過濾膜過濾來完成。在組合物被凍干的情況下，則可在凍干和復(fù)原之前或之后實(shí)施過濾滅菌。

藥物制劑優(yōu)選地呈單位劑型。在所述形式中，制劑被細(xì)分含有適當(dāng)量的活性組分的單位劑量。單位劑型可以是包裝制劑，所述包裝含有個(gè)別量的制劑，如在小瓶或安瓿中的包裝片劑、膠囊和粉劑。此外，單位劑型可以是膠囊、片劑、扁囊劑或錠劑自身，或它可以是適當(dāng)數(shù)目的呈包裝形式的任何這些單位劑型。所述組合物還可含有其他相容的治療劑。例如，所述組合物可另外地包含本文描述的抗微生物劑。

組合施用考慮共同施用(使用分開的制劑或單一藥物制劑)，和以任何順序連續(xù)施用，其中優(yōu)選地存在兩種(或所有)活性劑同時(shí)發(fā)揮其生物活性的時(shí)間段。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物包含人源化1B7抗體的制劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物包含人源化11E6抗體的制劑。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的藥物組合物包含人源化1B7抗體和人源化11E6抗體兩者的共制劑。

應(yīng)了解根據(jù)本發(fā)明待施用的抗體(例如，人源化hu1B7抗體和/或hu11E6抗體)的實(shí)際劑量將根據(jù)例如具體劑型和施用模式而變化?？尚薷乃隹贵w的作用的許多因素(例如，體重、性別、飲食、施用時(shí)間、施用途徑、排泄速率、受試者的狀況、藥物組合、遺傳傾向和反應(yīng)敏感性)可由本領(lǐng)域的技術(shù)人員考慮在內(nèi)。施用可在最大耐受劑量內(nèi)連續(xù)進(jìn)行或以一個(gè)或多個(gè)離散劑量進(jìn)行。用于給定組病狀的最佳施用速率可由本領(lǐng)域的技術(shù)人員使用常規(guī)劑量施用測(cè)試來確定。

抗體(例如，人源化hu1B7抗體和/或hu11E6抗體)的單個(gè)劑量可以每單位劑型含有例如約0.01mg至約1,000mg、約0.01mg至約950mg、約0.01mg至約900mg、約0.01mg至約850mg、約0.01mg至約800mg、約0.01mg至約750mg、約0.01mg至約700mg、約0.01mg至約650mg、約0.01mg至約600mg、約0.01mg至約550mg、約0.01mg至約500mg、約0.01mg至約450mg、約0.01mg至約400mg、約0.01mg至約350mg、約0.01mg至約300mg、約0.01mg至約250mg、約0.01mg至約200mg、約0.01mg至約150mg、約0.01mg至約100mg、約0.1mg至約90mg、約0.1mg至約80mg、約0.1mg至約70mg、約0.1mg至約60mg、約0.1mg至約50mg、約0.1mg至約40mg活性成分、約0.1mg至約30mg、約0.1mg至約20mg、約0.1mg至約10mg、約0.1mg至約5mg、約0.1mg至約3mg、約0.1mg至約1mg或每單位劑型約5mg至約80mg的單位劑型施用。例如，單位劑型可以是約0.01mg、約0.02mg、約0.03mg、約0.04mg、約0.05mg、約0.06mg、約0.07mg、約0.08mg、約0.09mg、約0.1mg、約0.2mg、約0.3mg、約0.4mg、約0.5mg、約0.6mg、約0.7mg、約0.8mg、約0.9mg、約1mg、約2mg、約3mg、約4mg、約5mg、約6mg、約7mg、約8mg、約9mg、約10mg、約15mg、約20mg、約25mg、約30mg、約35mg、約40mg、約45mg、約50mg、約55mg、約60mg、約65mg、約70mg、約75mg、約80mg、約85mg、約90mg、約95mg、約100mg、約150mg、約200mg、約250mg、約300mg、約350mg、約400mg、約450mg、約500mg、約550mg、約600mg、約650mg、約700mg、約750mg、約800mg、約850mg、約900mg、約950mg或約1,000mg，包括其之間的所有值和范圍。

在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體(例如，人源化hu1B7抗體和/或hu11E6抗體)以約0.01mg至約100mg每日的量，約0.01mg至約1,000mg每日、約0.01mg至約950mg每日、約0.01mg至約900mg每日、約0.01mg至約850mg每日、約0.01mg至約800mg每日、約0.01mg至約750mg每日、約0.01mg至約700mg每日、約0.01mg至約650mg每日、約0.01mg至約600mg每日、約0.01mg至約550mg每日、約0.01mg至約500mg每日、約0.01mg至約450mg每日、約0.01mg至約400mg每日、約0.01mg至約350mg每日、約0.01mg至約300mg每日、約0.01mg至約250mg每日、約0.01mg至約200mg每日、約0.01mg至約150mg每日、約0.1mg至約100mg每日、約0.1mg至約95mg每日、約0.1mg至約90mg每日、約0.1mg至約85mg每日、約0.1mg至約80mg每日、約0.1mg至約75mg每日、約0.1mg至約70mg每日、約0.1mg至約65mg每日、約0.1mg至約60mg每日、約0.1mg至約55mg每日、約0.1mg至約50mg每日、約0.1mg至約45mg每日、約0.1mg至約40mg每日、約0.1mg至約35mg每日、約0.1mg至約30mg每日、約0.1mg至約25mg每日、約0.1mg至約20mg每日、約0.1mg至約15mg每日、約0.1mg至約10mg每日、約0.1mg至約5mg每日、約0.1mg至約3mg每日、約0.1mg至約1mg每日、或約5mg至約80mg每日的量施用。在各種實(shí)施方案中，該抗體以約0.01mg、約0.02mg、約0.03mg、約0.04mg、約0.05mg、約0.06mg、約0.07mg、約0.08mg、約0.09mg、約0.1mg、約0.2mg、約0.3mg、約0.4mg、約0.5mg、約0.6mg、約0.7mg、約0.8mg、約0.9mg、約1mg、約2mg、約3mg、約4mg、約5mg、約6mg、約7mg、約8mg、約9mg、約10mg、約15mg、約20mg、約25mg、約30mg、約35mg、約40mg、約45mg、約50mg、約55mg、約60mg、約65mg、約70mg、約75mg、約80mg、約85mg、約90mg、約95mg、約100mg、約150mg、約200mg、約250mg、約300mg、約350mg、約400mg、約450mg、約500mg、約550mg、約600mg、約650mg、約700mg、約750mg、約800mg、約850mg、約900mg、約950mg或約1,000mg(包括其之間的所有值和范圍)的每日劑量施用。

在一些實(shí)施方案中，抗體(例如，人源化hu1B7抗體和/或hu11E6抗體)的適合劑量在約0.01mg/kg至約100mg/kg受試者體重的范圍內(nèi)，例如，約0.01mg/kg、約0.02mg/kg、約0.03mg/kg、約0.04mg/kg、約0.05mg/kg、約0.06mg/kg、約0.07mg/kg、約0.08mg/kg、約0.09mg/kg、約0.1mg/kg、約0.2mg/kg、約0.3mg/kg、約0.4mg/kg、約0.5mg/kg、約0.6mg/kg、約0.7mg/kg、約0.8mg/kg、約0.9mg/kg、約1mg/kg、約1.1mg/kg、約1.2mg/kg、約1.3mg/kg、約1.4mg/kg、約1.5mg/kg、約1.6mg/kg、約1.7mg/kg、約1.8mg/kg、1.9mg/kg、約2mg/kg、約3mg/kg、約4mg/kg、約5mg/kg、約6mg/kg、約7mg/kg、約8mg/kg、約9mg/kg、約10mg/kg、約15mg/kg、約20mg/kg、約25mg/kg、約30mg/kg、約35mg/kg、約40mg/kg、約45mg/kg、約50mg/kg、約55mg/kg、約60mg/kg、約65mg/kg、約70mg/kg、約75mg/kg、約80mg/kg、約85mg/kg、約90mg/kg或約100mg/kg體重，包括其間的所有值和范圍。在其他實(shí)施方案中，抗體的適合劑量在約0.01mg/kg至約100mg/kg體重的范圍內(nèi)、在約1mg/kg至約100mg/kg體重的范圍內(nèi)、在約1mg/kg至約90mg/kg體重的范圍內(nèi)、在約1mg/kg至約80mg/kg體重的范圍內(nèi)、在約1mg/kg至約70mg/kg體重的范圍內(nèi)、在1mg/kg至約60mg/kg體重的范圍內(nèi)、在1mg/kg至約50mg/kg體重的范圍內(nèi)、在1mg/kg至約40mg/kg體重的范圍內(nèi)、在1mg/kg至約30mg/kg體重的范圍內(nèi)、在1mg/kg至約20mg/kg體重的范圍內(nèi)、在約5mg/kg至約50mg/kg體重的范圍內(nèi)、在約5mg/kg至約40mg/kg體重的范圍內(nèi)、在約5mg/kg至約30mg/kg體重的范圍內(nèi)、在約5mg/kg至約20mg/kg體重的范圍內(nèi)，包括其間的所有值和范圍。

根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方案，抗體(例如，人源化hu1B7抗體和/或hu11E6抗體)可例如每日多于一次、約一次/天、約每隔一天、約每隔兩天、約一周一次、約每兩周一次、約每月一次、約每兩個(gè)月一次、約每三個(gè)月一次、約每六個(gè)月一次或約每年一次。

抗體可在多種場(chǎng)合施用。單個(gè)劑量之間的間隔可以是每周、每月或每年。間隔也可以是無規(guī)律的，如由測(cè)量受試者中抗體的血液水平所指示。在一些實(shí)施方案中，抗體可作為緩釋制劑施用，在這種情況下需要較低的施用頻率。

在一些方法中，本發(fā)明的抗體以實(shí)現(xiàn)1-1000μg/ml且在一些方法中25-300μg/ml的血漿或血清抗體濃度的劑量施用。例如，本發(fā)明的抗體可以實(shí)現(xiàn)約1-1000μg/ml、1-900μg/ml、1-800μg/ml、1-700μg/ml、1-600μg/ml、1-500μg/ml、1-400μg/ml、1-300μg/ml、1-200μg/ml、1-100μg/ml、10-500μg/ml、10-400μg/ml、10-300μg/ml、10-200μg/ml、10-100μg/ml、100-400μg/ml、100-300μg/ml或100-200μg/ml(包括其間的所有值和范圍)的血漿或血清水平的劑量施用。例如，本發(fā)明的抗體可以實(shí)現(xiàn)約1μg/ml、約5μg/ml、約10μg/ml、約15μg/ml、約20μg/ml、約25μg/ml、約30μg/ml、約35μg/ml、約40μg/ml、約45μg/ml、約50μg/ml、約55μg/ml、約60μg/ml、約65μg/ml、約70μg/ml、約75μg/ml、約80μg/ml、約85μg/ml、約90μg/ml、約95μg/ml、約100μg/ml、約105μg/ml、約110μg/ml、約115μg/ml、約120mgμg/ml、約125μg/ml、約130μg/ml、約135μg/ml、約140μg/ml、約145μg/ml、約150μg/ml、約155μg/ml、約160μg/ml、約165μg/ml、約170μg/ml、約175μg/ml、約180μg/ml、約185μg/ml、約190μg/ml、約195μg/ml、約200μg/ml、約205μg/ml、約210μg/ml、約215μg/ml、約220mgμg/ml、約225μg/ml、約230μg/ml、約235μg/ml、約240μg/ml、約245μg/ml、約250μg/ml、約255μg/ml、約260μg/ml、約265μg/ml、約270μg/ml、約275μg/ml、約280μg/ml、約285μg/ml、約290μg/ml、約295μg/ml或約300μg/ml的血漿或血清水平的劑量施用。

在一些方法中，本發(fā)明的抗體(例如人源化hu1B7抗體和/或hu11E6抗體)實(shí)現(xiàn)至少約1EU/ug、至少約2EU/ug、至少約3EU/ug、至少約4EU/ug、至少約5EU/ug、至少約6EU/ug、至少約7EU/ug、至少約8EU/ug、至少約9EU/ug、至少約10EU/ug、至少約15EU/ug、至少約20EU/ug、至少約25EU/ug、至少約30EU/ug、至少約35EU/ug、至少約40EU/ug、至少約45EU/ug、至少約50EU/ug、至少約55EU/ug、至少約60EU/ug、至少約65EU/ug、至少約70EU/ug、至少約75EU/ug、至少約80EU/ug、至少約85EU/ug、至少約90EU/ug、至少約95EU/ug、至少或約100EU/ug的效力。在一些方法中，本發(fā)明的抗體(例如，人源化hu1B7抗體和/或hu11E6抗體)實(shí)現(xiàn)至少約1EU/ml、至少約2EU/ml、至少約3EU/ml、至少約4EU/ml、至少約5EU/ml、至少約6EU/ml、至少約7EU/ml、至少約8EU/ml、至少約9EU/ml、至少約10EU/ml、至少約15EU/ml、至少約20EU/ml、至少約25EU/ml、至少約30EU/ml、至少約35EU/ml、至少約40EU/ml、至少約45EU/ml、至少約50EU/ml、至少約55EU/ml、至少約60EU/ml、至少約65EU/ml、至少約70EU/ml、至少約75EU/ml、至少約80EU/ml、至少約85EU/ml、至少約90EU/ml、至少約95EU/ml、至少或約100EU/ml的效力。EU代表當(dāng)量，如由WHO多克隆血清標(biāo)準(zhǔn)所定義。在各種實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體能夠在至少約1天、約2天、約3天、約4天、約5天、約6天、約1周、約2周、約3周、約4周、約5個(gè)月、約6個(gè)月、約7個(gè)月、約8個(gè)月、約9個(gè)月、約10個(gè)月、約11個(gè)月或約12個(gè)月之后維持效力。

劑量和頻率取決于因素如施用途徑、劑量的量、所治療的疾病以及抗體在患者中的半衰期而變化。施用的劑量和頻率可取決于治療為預(yù)防性還是治療性而變化。在預(yù)防性應(yīng)用中，經(jīng)長時(shí)間段以相對(duì)低頻率的時(shí)間間隔施用相對(duì)低的劑量。在治療性應(yīng)用中，有時(shí)需要相對(duì)較短間隔下的相對(duì)較高劑量直到疾病進(jìn)展減弱或終止為止，并且優(yōu)選地直到患者展示疾病癥狀的部分或完全改善為止。此后，可向患者施用預(yù)防方案。說明性給藥頻率是每天一次、每天兩次、每天三次、每周一次和每兩周一次。在一些實(shí)施方案中，給藥每兩周一次。

本發(fā)明還提供可簡化本文描述的任何藥劑(例如，有或無各種組合藥劑的人源化抗體)的施用的試劑盒。本發(fā)明的說明性試劑盒包括呈單位劑型的本文所述的任何組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述單位劑型是容器，如可為無菌的預(yù)填充的注射器，其含有本文描述的任何藥劑和藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑、賦形劑或媒介物。試劑盒還包括說明本文所述的任何藥劑的使用的標(biāo)記或印刷說明書。試劑盒還可包括用于施用位置的眼瞼擴(kuò)張器、局部麻醉劑和清潔劑。試劑盒還可包括本文所述的一種或多種另外的藥劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒包括含有有效量的本發(fā)明的組合物和有效量的另一種組合物(如本文所述的那些)的容器。

在一些實(shí)施方案中，試劑盒包括呈單位劑型的預(yù)填充的注射器(例如，注射器筆)。在各種實(shí)施方案中，試劑盒適合于遠(yuǎn)離傳統(tǒng)醫(yī)療中心使用，例如在現(xiàn)場(chǎng)使用，例如在第三世界使用。

實(shí)施例

以下實(shí)施例僅是說明性的，并且不意圖以任何方式限制本發(fā)明的范圍或內(nèi)容。

實(shí)施例1人源化11E6重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的篩選和評(píng)估

產(chǎn)生了編碼嵌合11E6重鏈的表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建體。該構(gòu)建體編碼具有小鼠可變區(qū)、接著人恒定區(qū)的抗體。具體地說，該構(gòu)建體編碼融合至人IgG1重鏈恒定區(qū)的SEQ ID NO：13。類似地，產(chǎn)生了編碼嵌合11E6輕鏈的表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建體。該構(gòu)建體編碼融合至人κ輕鏈恒定區(qū)的SEQ ID NO：19。這兩種表達(dá)構(gòu)建體還編碼啟動(dòng)子、5’非翻譯序列和異源信號(hào)肽以用于在CHO細(xì)胞中表達(dá)且從CHO細(xì)胞分泌。

產(chǎn)生了編碼嵌合11E6重鏈的表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建體。該構(gòu)建體編碼具有小鼠可變區(qū)、接著人恒定區(qū)的抗體。具體地說，該構(gòu)建體編碼融合至人IgG1重鏈恒定區(qū)的SEQ ID NO：13。類似地，產(chǎn)生了編碼嵌合11E6輕鏈的表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建體。該構(gòu)建體編碼融合至人κ輕鏈恒定區(qū)的SEQ ID NO：19。這兩種表達(dá)構(gòu)建體還編碼啟動(dòng)子、5’非翻譯序列和異源信號(hào)肽以用于在CHO細(xì)胞中表達(dá)且從CHO細(xì)胞分泌。

以類似方式，編碼人源化11E6重鏈的四種表達(dá)質(zhì)粒是利用SEQ ID NO：14、15、17和18構(gòu)建的。這些分別被指定為H1、H2、H3和H4。編碼人源化11E6輕鏈的三種表達(dá)質(zhì)粒是利用SEQ ID NO：20、21和23構(gòu)建的。這些分別被指定為L1、L2和L3。

將重鏈和輕鏈嵌合表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至CHO細(xì)胞中，其然后將雙價(jià)嵌合抗體分泌至組織培養(yǎng)基中。類似地，將人源化重鏈和輕鏈構(gòu)建體的所有12種組合共轉(zhuǎn)染至CHO細(xì)胞中。具體地說，將H1與L1、L2、L3和L4一起共轉(zhuǎn)染；將H2與L1、L2、L3和L4一起共轉(zhuǎn)染；并且將H3與L1、L2、L3和L4一起共轉(zhuǎn)染。從每種轉(zhuǎn)染收集培養(yǎng)基，定量樣品中的抗體水平，并且通過ELISA測(cè)定與百日咳毒素的結(jié)合。兩種嵌合構(gòu)建體和所有12種人源化組合產(chǎn)生特異性地結(jié)合百日咳毒素的抗體。H1和H4與L2和L3的組合產(chǎn)生最高ELISA信號(hào)。H4與L3的組合被選擇用于進(jìn)一步評(píng)估。

用百日咳毒素結(jié)合競(jìng)爭測(cè)定來測(cè)定親本鼠抗體、嵌合抗體、H4/L3抗體的解離常數(shù)(Kd)。在這種測(cè)定中，使增加濃度的百日咳毒素暴露于恒定量的抗體。然后通過ELISA定量剩余的未結(jié)合抗體的量。三種抗體的解離常數(shù)是幾乎相同的。

因此，11E6抗體是人源化的而無對(duì)比親本鼠抗體的任何親和力損失。

實(shí)施例2人源化1B7重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的篩選和評(píng)估

用1B7嵌合序列以及人源化1B7重鏈和輕鏈的20種組合來進(jìn)行相同評(píng)估。產(chǎn)生分別編碼1B7嵌合重鏈和輕鏈SEQ ID NO：1和7的表達(dá)質(zhì)粒。制備了編碼SEQ ID NO：2、3、5和6的四種1B7人源化重鏈的表達(dá)質(zhì)粒，其分別被指定為H1、H2、H3、H4。制備了編碼SEQ ID NO：8、9、11、12和10的五種1B7人源化輕鏈的表達(dá)質(zhì)粒，其分別被指定為L1、L2、L3、L4和L5。對(duì)于每種表達(dá)質(zhì)粒，啟動(dòng)子、5’非翻譯區(qū)、信號(hào)肽和恒定區(qū)(IgG1和κ)與用于實(shí)施例1中的11E6構(gòu)建體相同。

將編碼嵌合重鏈和輕鏈的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至CHO細(xì)胞中以產(chǎn)生嵌合1B7抗體。用于人源化1B7重鏈和輕鏈的每種組合的質(zhì)粒也被共轉(zhuǎn)染至CHO細(xì)胞中以產(chǎn)生20種不同的人源化1B7抗體。然后經(jīng)由如在實(shí)施例1中用11E6所進(jìn)行的百日咳毒素結(jié)合ELISA來評(píng)估所述抗體。H1和H2與L3和L4的組合產(chǎn)生最高ELISA信號(hào)。選擇H2/L3用于進(jìn)一步發(fā)展的組合。在百日咳毒素競(jìng)爭測(cè)定中，親本鼠1B7抗體和H2/L3人源化1B7抗體的解離常數(shù)分別是0.15和0.16nM。

因此，1B7抗體是人源化的而無對(duì)比親本鼠抗體的任何親和力損失。

實(shí)施例3：結(jié)合百日咳毒素蛋白的人源化抗體的構(gòu)建

在以上實(shí)施例1和2中鑒別的兩種人源化抗體是在CHO細(xì)胞中產(chǎn)生的。具體地說，對(duì)于每種抗體，制備了兩種逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，一種編碼重鏈且第二種編碼輕鏈。對(duì)于每種抗體，所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體對(duì)用于重復(fù)地轉(zhuǎn)導(dǎo)和遺傳上修飾CHO細(xì)胞的非克隆池。然后將重組CHO細(xì)胞在搖瓶中生長持續(xù)兩周。經(jīng)由蛋白質(zhì)A柱從CHO細(xì)胞組織培養(yǎng)基純化每種抗體。使用SDS-PAGE凝膠對(duì)人源化hu1B7和hu11E6抗體進(jìn)行分析(參見圖1和3)。此外，還通過尺寸排阻色譜法對(duì)人源化hu1B7和hu11E6抗體以及所述兩種抗體的混合物進(jìn)行了分析(參見圖2、4和5)。具體地說，將500μL的于PBS中的抗體(100μg/mL)在4℃下孵育24小時(shí)并且將樣品在具有PBS緩沖液的S200柱上運(yùn)行。

使用SDS-PAGE凝膠對(duì)人源化hu1B7和hu11E6抗體進(jìn)行分析(參見圖1和3)。此外，還通過尺寸排阻色譜法對(duì)人源化hu1B7和hu11E6抗體以及所述兩種抗體的混合物進(jìn)行了分析(參見圖2、4和5)。具體地說，將500μL的于PBS中的抗體(100μg/mL)在4℃下孵育24小時(shí)并且將樣品在具有PBS緩沖液的S200柱上運(yùn)行。

對(duì)于人源化hu1B7抗體獲得以下結(jié)果：濃度：5.78mg/mL(使用1.64(mg/mL)^-1的A280吸光度系數(shù))；內(nèi)毒素<0.25EU/mL(<0.04EU/mg)；并且生物負(fù)載<0.2CFU/mL(通過)。

對(duì)于人源化hu11E6抗體獲得以下結(jié)果：濃度：5.62mg/mL(使用1.56(mg/mL)^-1的A280吸光度系數(shù))；內(nèi)毒素<0.25EU/mL(<0.04EU/mg)；并且生物負(fù)載<0.2CFU/mL(通過)。

如至圖5中所示，抗體制劑未表現(xiàn)出明顯聚集。

實(shí)施例4：人源化抗體的制造

進(jìn)行人源化hu1B7和hu11E6抗體的大規(guī)模制造。具體地說，使用逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)、接著單克隆抗體純化方法來在CHO細(xì)胞中表達(dá)人源化hu1B7和hu11E6抗體。鑒別了用于產(chǎn)生每種抗體的克隆和備份克隆。將每種克隆針對(duì)表達(dá)進(jìn)行表征，并且驗(yàn)證所得抗體的質(zhì)量。將上游工藝放大至100L以用于產(chǎn)生hu1B7抗體且放大至250L以用于產(chǎn)生hu11E6抗體。上游工藝?yán)脽o血清的、化學(xué)成分確定的且可商購細(xì)胞培養(yǎng)基和補(bǔ)料。下游工藝?yán)猛ㄟ^順序色譜法(即，蛋白質(zhì)-A、陰離子交換和陽離子交換)進(jìn)行的三步純化。該制造方法還包括基于清潔劑的病毒滅活步驟和切向流過濾至在10mg/mL下的PBS制劑緩沖液(pH 7.0)中。將兩種抗體制劑通過0.2um過濾器滅菌且批量填充至高密度聚乙烯瓶中。將純化的制劑在<-35℃下長期儲(chǔ)存。人源化hu1B7和hu11E6抗體的產(chǎn)率分別是47和70克。相較于通過標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方法產(chǎn)生的CHO細(xì)胞制造系，產(chǎn)率高多于一個(gè)數(shù)量級(jí)。

進(jìn)行一系列生物分析測(cè)定以用于所制造抗體的分批分析和穩(wěn)定性研究。這些方法包括產(chǎn)物相關(guān)測(cè)試，如A280吸收讀取、SDS-PAGE、SE-HPLC、IEF和ELISA活性測(cè)定，以及工藝相關(guān)測(cè)試，如宿主細(xì)胞DNA和蛋白質(zhì)、內(nèi)毒素、生物負(fù)載和支原體的分析。還測(cè)量了外觀、滲透壓和pH。兩種單克隆抗體在這些測(cè)定中表現(xiàn)出優(yōu)異特征。

實(shí)施例5：人源化抗體的表征

熱穩(wěn)定性測(cè)定用于評(píng)定人源化hu11E6和hu1B7抗體以及其鼠對(duì)應(yīng)物的穩(wěn)定性，如圖6A至圖6D中所示。

進(jìn)行ELISA測(cè)定以測(cè)定人源化hu11E6和hu1B7抗體結(jié)合百日咳毒素蛋白的能力(參見圖7)。具體地說，百日咳毒素蛋白用于包被，而抗小鼠-HRP或抗人Fc-HRP用作第二抗體。TMB(3,3’,5,5’–四甲基聯(lián)苯胺)用作所述測(cè)定的底物。獲得以下EC₅₀(nM)數(shù)據(jù)：

m1B7：0.19±0.01；

hu1B7A：0.23±0.04；

m11E6：2.7±0.7；以及

hu11E6A 1.3±0.2。

如所指示，人源化hu11E6和hu1B7抗體對(duì)百日咳毒素蛋白表現(xiàn)出可比得上或優(yōu)于鼠抗體的高親和力。

圖8示出競(jìng)爭性ELISA測(cè)定的結(jié)果，所述測(cè)定測(cè)定人源化hu1B7和hu11E6抗體的結(jié)合親和力。相較于在合作研究機(jī)構(gòu)(CRO)產(chǎn)生的那些抗體制劑，對(duì)在學(xué)術(shù)研究實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)生的抗體制劑測(cè)定解離常數(shù)。對(duì)于ELISA，百日咳毒素蛋白用于包被，而抗人Fc-HRP用作第二抗體。TMB(3,3’,5,5’–四甲基聯(lián)苯胺)用作底物。

獲得以下Kd(nM)數(shù)據(jù)：

研究實(shí)驗(yàn)室hu1B7A＝1.7±0.2；

CRO hu1B7A 2.6±0.1；

研究實(shí)驗(yàn)室hu11E6A 10.7±0.3；以及

CRO hu11E6A 11.3±0.4。

還通過BIAcore測(cè)量人源化hu1B7和hu11E6抗體的結(jié)合親和力，并且獲得如在表1中所示的以下Kd數(shù)據(jù)。

表1

進(jìn)行CHO細(xì)胞體外保護(hù)測(cè)定以比較人源化hu1B7和hu11E6抗體的中和活性。由兩個(gè)不同的技術(shù)人員進(jìn)行測(cè)定(參見圖9)。具體地說，所述測(cè)定測(cè)量所述抗體中和百日咳毒素蛋白的能力。如在圖9中所示，人源化和小鼠抗體在中和百日咳毒素蛋白方面是可媲美的。

通過混合人源化11E6和1B7抗體來制備所述抗體的混合物，并且在4℃下儲(chǔ)存1分鐘、1小時(shí)和22小時(shí)。使用如先前所述的ELISA測(cè)定來評(píng)估百日咳毒素蛋白的混合物的結(jié)合能力(參見圖10)。獲得以下EC₅₀(nM)數(shù)據(jù)：

1分鐘＝0.12±0.02；

1小時(shí)＝0.10±0.01；以及

22小時(shí)＝0.17±0.07。

如由EC₅₀數(shù)據(jù)所證明，在作為混合物儲(chǔ)存時(shí)在人源化hu1B7抗體與人源化hu11E6抗體之間不存在將干擾其對(duì)百日咳毒素蛋白的結(jié)合親和力的明顯不利相互作用。

以下表2總結(jié)相較于鼠m1B7抗體，人源化hu1B7抗體的藥代動(dòng)力學(xué)(PK)分析。

表2

從PK分析，確定5ug的鼠m1B7抗體完全保護(hù)感染百日咳博德特氏桿菌的小鼠，并且具有約210小時(shí)的消除半衰期。相比之下，20ug的人源化hu1B7具有約89小時(shí)的消除半衰期(參見圖11)并且在7天中具有類似的血液濃度。因此，20ug劑量的人源化hu1B7抗體預(yù)期以與5ug劑量的鼠m1B7抗體類似的方式保護(hù)感染的小鼠。此外，如在圖10中所示，人源化11E6抗體具有約128小時(shí)的消除半衰期，而兩種抗體的混合物具有約76小時(shí)的消除半衰期。

進(jìn)行ELISA測(cè)定以測(cè)定熱量是否影響人源化hu11E6和hu1B7A抗體對(duì)百日咳毒素蛋白的結(jié)合親和力(參見圖12和13)。如先前所描述進(jìn)行ELISA測(cè)定。具體地說，將50μg/mL的抗體在50℃或在70℃下在PBS中在冰上孵育30分鐘，并且在冰上淬滅1分鐘。如在圖12中所示，人源化hu1B7A抗體在50℃或70℃下加熱30分鐘之后保持穩(wěn)定并且不會(huì)不可逆轉(zhuǎn)地解折疊。如在圖13中所示，人源化hu11E6A抗體在50℃下加熱30分鐘之后保持穩(wěn)定，但在70℃下加熱之后不可逆轉(zhuǎn)地解折疊。

進(jìn)行ELISA測(cè)定以比較單獨(dú)人源化hu1B7A或hu11E6A抗體相較于所述兩種抗體的混合物的結(jié)合親和力(參見圖14)。如先前所描述進(jìn)行ELISA測(cè)定。獲得以下EC₅₀(nM)數(shù)據(jù)：

hu1B7A：0.09±0.01；

hu11E6A：0.61±0.07；以及

hu1B7A與hu11E6A的混合物：0.29±0.07。

實(shí)施例6：人源化抗體在治療小鼠中的百日咳博德特氏桿菌感染中的評(píng)估

在小鼠模型中評(píng)估了人源化hu1B7和hu11E6抗體在治療百日咳博德特氏桿菌感染中的功效。

具體地說，將感染百日咳博德特氏桿菌D420菌株的小鼠用人源化hu1B7抗體、人源化hu11E6抗體以及所述兩種抗體的混合物進(jìn)行治療。隨后將感染的小鼠針對(duì)其體重和白血細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行分析。如在圖15中所示，用每種人源化抗體單獨(dú)或組合治療允許感染的小鼠中比用PBS或用鼠m1B7抗體治療的那些小鼠更大的體重增加。圖16A-16B示出用人源化抗體治療還在感染后3天和10天時(shí)顯著減少受感染小鼠的白血細(xì)胞計(jì)數(shù)。

還評(píng)定了抗體治療對(duì)細(xì)菌肺定殖的作用。具體地說，將小鼠用PBS、P-IVIG、人源化hu1B7抗體、人源化hu11E6抗體或兩種抗體的混合物進(jìn)行治療。在感染后10天時(shí)評(píng)估細(xì)菌肺定殖。未感染的首次接受試驗(yàn)的小鼠充當(dāng)基線對(duì)照。將受感染小鼠在感染后第10天通過CO₂吸入安樂死，并且將呼吸道切除以用于通過在含有40ug/ml頭孢氨芐的補(bǔ)充有10％綿羊血(Hemostat Resources)的Regan Lowe瓊脂上連續(xù)接種來計(jì)數(shù)。在37℃下5天之后對(duì)菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。如在圖17中所示，用抗體治療的小鼠相較于未治療的對(duì)照(PBS)或P-IVIG治療的動(dòng)物展示細(xì)菌定殖的顯著降低。對(duì)于用單獨(dú)hu1B7和hu11E6治療的動(dòng)物，P<0.05(*)；并且對(duì)于用hu1B7和11E6的組合治療的動(dòng)物，P<0.01(**)。

總之，這些數(shù)據(jù)支持人源化hu11E6和hu1B7抗體在治療百日咳博德特氏桿菌感染中的體內(nèi)功效。

實(shí)施例7：人源化抗體在治療狒狒中的百日咳博德特氏桿菌感染中的評(píng)估

在狒狒模型中評(píng)估了人源化hu1B7和hu11E6抗體在治療百日咳博德特氏桿菌感染中的功效。

具體地說，將重量約2-3kg的剛斷奶的(6-9月齡)雄性和雌性狒狒(Papio anubus，東非狒狒)通過鼻內(nèi)施用百日咳博德特氏桿菌D420菌株進(jìn)行感染并且用人源化hu1B7和人源化hu11E6抗體靜脈內(nèi)治療。將受感染的狒狒針對(duì)疾病的臨床病征(例如，咳嗽、重量和溫度)、白血細(xì)胞技術(shù)和/或百日咳博德特氏桿菌的鼻腔攜帶水平進(jìn)行分析。

對(duì)于百日咳博德特氏桿菌感染，將百日咳博德特氏桿菌菌株D420以10⁹-10¹⁰cfu/ml懸浮在PBS中。將1ml經(jīng)由氣管內(nèi)導(dǎo)管遞送至狒狒氣管的頂部。將0.5ml經(jīng)由鼻內(nèi)導(dǎo)管遞送至每個(gè)鼻孔的后面。然后將狒狒置于坐姿持續(xù)3分鐘。對(duì)于靜脈切開術(shù)，經(jīng)由用蝶形導(dǎo)管靜脈穿刺收集<5ml血液并且將血液等分至管中以用于白血細(xì)胞測(cè)定和血清分離。在整個(gè)研究中，將狒狒用肌內(nèi)注射氯胺酮進(jìn)行麻醉以用于活動(dòng)包括抗體輸注、百日咳博德特氏桿菌感染、抽血、鼻咽洗液和臨床觀察。只要可能就將這些活動(dòng)組合以最小化麻醉劑的使用。

進(jìn)行了兩個(gè)研究。在一個(gè)中，將三只狒狒各自用6x10⁹CFU的百日咳博德特氏桿菌進(jìn)行感染。三天之后，將所述動(dòng)物中的兩只用人源化hu1B7和人源化hu11E6抗體進(jìn)行治療，并且第三只動(dòng)物保持未治療。在感染后三周，未治療的動(dòng)物變得垂死且將其安樂死。還將另外兩只治療的動(dòng)物安樂死。進(jìn)行了肺切片的組織學(xué)評(píng)估。在第二研究中，將四只狒狒用4x10⁹CFU的百日咳博德特氏桿菌感染，并且三天之后，將所述動(dòng)物中的兩只用人源化hu1B7和人源化hu11E6抗體兩者進(jìn)行治療，并且兩只動(dòng)物保持未治療。經(jīng)由靜脈內(nèi)注射施用所述抗體，并且各自以20mg/kg的劑量使用。

如在圖18A中所示，未治療的動(dòng)物發(fā)展達(dá)到在40,000個(gè)細(xì)胞/uL以上峰值的白細(xì)胞增多。在所述動(dòng)物中，升高的白細(xì)胞計(jì)數(shù)持續(xù)。在感染后三周，所述動(dòng)物突然變得垂死且將其安樂死。相比之下，治療的動(dòng)物中的白細(xì)胞計(jì)數(shù)開始在抗體施用之后兩天內(nèi)減少。所述計(jì)數(shù)持續(xù)下降并且在一周內(nèi)幾乎正常。這些動(dòng)物保持健康且與未治療的動(dòng)物并行殺死。咳嗽計(jì)數(shù)展示類似的模式(圖18B)。對(duì)照動(dòng)物展示從第3天至研究結(jié)束咳嗽的快速增加，在5天時(shí)達(dá)到峰值在超過50次咳嗽/小時(shí)。相比之下，兩只治療的動(dòng)物顯示增加的咳嗽達(dá)第3天(治療)。其到第4天時(shí)快速下降至零。

通過組織病理學(xué)檢查評(píng)估受感染的狒狒的肺(圖19)。在尸體剖檢時(shí)，未治療的動(dòng)物顯示具有實(shí)變的右肺。所述肺的組織病理學(xué)展示嚴(yán)重亞急性至慢性彌散性間質(zhì)性肺炎，伴隨膿腫形成和中度間質(zhì)纖維化。左肺揭示更中度的間質(zhì)性肺炎，伴隨更少瘢痕形成且無膿腫形成的跡象。還存在中度慢性多病灶組織胸膜炎，伴隨膿腫形成區(qū)域。相比之下，在實(shí)體剖檢時(shí)，兩只治療的動(dòng)物的肺是非常正常的。來自一只治療的動(dòng)物的右肺的組織病理學(xué)切片揭示非常輕微的慢性間質(zhì)性肺炎，伴隨非常輕微的間質(zhì)纖維化跡象。左肺在外觀上是基本上正常的。對(duì)于另一治療的動(dòng)物，右肺和左肺具有基本上正常的外觀，其中唯一發(fā)現(xiàn)是支氣管相關(guān)淋巴組織(BALT)的輕微至中度淋巴樣增生。因此，治療的動(dòng)物展示嚴(yán)重肺炎的變化，而治療的動(dòng)物的肺是正常的或展示非常輕微的肺炎。

評(píng)定了受感染的狒狒的白血細(xì)胞計(jì)數(shù)和鼻細(xì)菌計(jì)數(shù)(圖20A和20B)。未處理的動(dòng)物發(fā)展達(dá)到遠(yuǎn)高于40,000個(gè)細(xì)胞/uL的峰值的白細(xì)胞增多。在這些動(dòng)物中，升高的白細(xì)胞計(jì)數(shù)持續(xù)并且到第20天時(shí)未正?；Ｏ啾戎?，所述兩只處理的動(dòng)物展示在第3天在抗體治療時(shí)展示升高的白血細(xì)胞計(jì)數(shù)，然而，所述白血細(xì)胞計(jì)數(shù)從未達(dá)到在未治療的動(dòng)物情況下觀察到的水平，并且到第20天時(shí)，兩只治療的動(dòng)物白血細(xì)胞計(jì)數(shù)均返回至正常水平。類似地，鼻洗液中的百日咳博德特氏桿菌細(xì)菌細(xì)胞計(jì)數(shù)展示在第3天(治療)時(shí)相似的細(xì)菌量。在抗體治療之后，對(duì)于抗體混合物治療的動(dòng)物鼻中的細(xì)菌水平展示快速下降，而兩只對(duì)照動(dòng)物的鼻中的細(xì)菌計(jì)數(shù)到第18天時(shí)保持遠(yuǎn)高于10³cfu。

還測(cè)量了人源化hu1B7和人源化hu11E6抗體的血清濃度和半衰期。為了測(cè)量在靜脈內(nèi)施用20mg/kg的每種抗體之后狒狒血清中人源化1B7和人源化11E6抗體的量，在不同時(shí)間點(diǎn)收集血液樣品，分離血清，并且血清樣品用于抗百日咳毒素(PTx)ELISA中，如先前在實(shí)施例4中所描述。具體地說，百日咳毒素蛋白用于包被，而抗人Fc-HRP用作第二抗體。TMB(3,3’,5,5’–四甲基聯(lián)苯胺)用作所述測(cè)定的底物。兩只治療的狒狒用于此分析(即，狒狒#12913和15913)。圖21A示出人源化hu1B7和人源化hu11E6抗體的抗體血清濃度，如通過以下等式所計(jì)算：

血清濃度＝ae^-αt+be^-βt

圖21B示出所述人源化抗體的抗體半衰期。

總之，兩種人源化抗體(單獨(dú)地或組合)減輕小鼠百日咳模型中的重量損失、白細(xì)胞增多和肺細(xì)菌負(fù)載。此外，在狒狒模型中，抗體的組合逆轉(zhuǎn)兩只治療的動(dòng)物中的疾病病程，從而使它們能夠快速恢復(fù)正?；蚪咏５姆谓M織學(xué)。這些數(shù)據(jù)支持本發(fā)明的人源化抗體作為降低患有百日咳的兒童中的發(fā)病率、長期后遺癥和死亡率的方式的臨床應(yīng)用。

實(shí)施例8：將人源化抗體預(yù)防性施用至新生兒

將人源化hu1B7和hu11E6抗體經(jīng)由肌內(nèi)注射施用至新生兒以經(jīng)由被動(dòng)免疫提供針對(duì)百日咳的預(yù)防性治療。由于在生命的頭4個(gè)月期間百日咳預(yù)示著高死亡或嚴(yán)重疾病與長期后遺癥的風(fēng)險(xiǎn)，所以在出生時(shí)治療能夠在此高風(fēng)險(xiǎn)期和/或直到他們足夠大至接收標(biāo)準(zhǔn)百日咳疫苗期間保護(hù)兒童。這在發(fā)展中國家可能是特別重要的，其中沾染百日咳的風(fēng)險(xiǎn)較高，此疾病每年殺死160,000至300,000名兒童，并且新生兒經(jīng)在出生時(shí)看一次醫(yī)生。

人源化hu1B7和hu11E6抗體(aka SYN-005)的混合物預(yù)期由于其血清半衰期和效力而提供至少四個(gè)月的預(yù)防。

基于從狒狒研究獲得的藥代動(dòng)力學(xué)(PK)數(shù)據(jù)與針對(duì)作為對(duì)新生兒的預(yù)防性治療施用的其他抗體可獲得的數(shù)據(jù)結(jié)合來估計(jì)SYN-005的半衰期。具體地說，SYN-005據(jù)顯示在狒狒中具有11天的β半衰期。

與常規(guī)用于預(yù)測(cè)疫苗功效的世界衛(wèi)生組織(WHO)的多克隆血清標(biāo)準(zhǔn)相比評(píng)定SYN-005的效力。WHO效力是以當(dāng)量(EU)定量的，并且5EU/ml被認(rèn)為是人中的保護(hù)水平。參見Storsaeter J.等人(1998),Vaccine,16(20)：1907-16。具體地說，SYN-005的效力被測(cè)定為2EU/ug。此外，在CHO細(xì)胞功能測(cè)定中，SYN-005的EU顯示比WHO多克隆標(biāo)準(zhǔn)的EU效力高大約七倍。具體地，SYN-005中的兩種人源化抗體能夠中和百日咳毒素，而多克隆環(huán)境中的許多PTx結(jié)合抗體不會(huì)干擾百日咳毒素功能。

因此，SYN-005混合物的保護(hù)性血漿水平預(yù)期是大于5EU/ml。具體地說，預(yù)期SYN-005的40mg/kg肌內(nèi)劑量將在一個(gè)月時(shí)提供100-130ug/ml的血清水平且在四個(gè)月時(shí)提供5ug/ml的血清水平。因?yàn)镾YN-005具有2EU/ug的效力，所以5ug/ml的血清水平等效于10EU/ml，其是針對(duì)預(yù)防性治療的WHO標(biāo)準(zhǔn)所要求的水平的兩倍。此外，1EU的SYN-005比1EU的WHO多克隆標(biāo)準(zhǔn)效力高七倍的觀察結(jié)果提供確保在四個(gè)月時(shí)正在進(jìn)行的預(yù)防的另外界限。

總之，這些數(shù)據(jù)表明單劑量的SYN-005將維持高于保護(hù)新生兒免于百日咳持續(xù)至少四個(gè)月所要求的閾值之上的血漿水平。

以引用的方式并入

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等效物

在不脫離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，本發(fā)明可以其他具體形式來實(shí)施。因此，前述實(shí)施方案在所有方面都應(yīng)被視為說明性的，而非是對(duì)本文中描述的本發(fā)明的限制。

實(shí)施方案

實(shí)施方案

實(shí)施方案1.一種結(jié)合百日咳毒素蛋白的人源化1B7抗體，所述人源化1B7抗體包含免疫球蛋白重鏈可變區(qū)和免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)，其中所述免疫球蛋白重鏈可變區(qū)包含選自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的氨基酸序列；以及所述免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)包含選自SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12的氨基酸序列。

實(shí)施方案2.一種結(jié)合百日咳毒素蛋白的人源化1B7抗體，所述人源化1B7抗體包含選自以下各項(xiàng)的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)和免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)：(a)包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)和包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)；(b)包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)和包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)；(c)包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)和包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)；(d)包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)和包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)；以及(e)包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)和包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)。

實(shí)施方案3.一種結(jié)合百日咳毒素蛋白的人源化11E6抗體，所述人源化11E6抗體包含免疫球蛋白重鏈可變區(qū)和免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)，其中所述免疫球蛋白重鏈可變區(qū)包含選自SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18的氨基酸序列；以及所述免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)包含選自SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24的氨基酸序列。

實(shí)施方案4.一種結(jié)合百日咳毒素蛋白的人源化11E6抗體，所述人源化11E6抗體包含選自以下各項(xiàng)的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)和免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)：(a)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)和包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)；(b)包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)和包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)；(c)包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)和包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)；(d)包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)和包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)；以及(e)包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)和包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)。

實(shí)施方案5.如實(shí)施方案1或2所述的抗體，其中所述抗體結(jié)合所述百日咳毒素蛋白的K_D為3nM或更低。

實(shí)施方案6.如實(shí)施方案3或4所述的抗體，其中所述抗體結(jié)合所述百日咳毒素蛋白的K_D為12nM或更低。

實(shí)施方案7.一種結(jié)合百日咳毒素蛋白的人源化1B7抗體，其中所述抗體結(jié)合所述百日咳毒素蛋白的K_D為3nM或更低。

實(shí)施方案8.如實(shí)施方案7所述的抗體，其中所述K_D是約3nM、或約2nM、或約1nM、或約0.5nM。

實(shí)施方案9.一種結(jié)合百日咳毒素蛋白的人源化11E6抗體，其中所述抗體結(jié)合所述百日咳毒素蛋白的K_D為12nM或更低。

實(shí)施方案10.如實(shí)施方案9所述的抗體，其中所述K_D是約12nM、或約10nM、或約8nM、或約6nM、或4nM、或2nM、或約1nM、或約0.5nM。

實(shí)施方案11.一種分離的核酸，其包含編碼如實(shí)施方案1-10中任一項(xiàng)所述的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)的核苷酸序列。

實(shí)施方案12.一種分離的核酸，其包含編碼如實(shí)施方案1-10中任一項(xiàng)所述的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列。

實(shí)施方案13.一種表達(dá)載體，其含有如實(shí)施方案11所述的核酸。

實(shí)施方案14.一種表達(dá)載體，其含有如實(shí)施方案12所述的核酸。

實(shí)施方案15.如實(shí)施方案14所述的表達(dá)載體，其還包含如實(shí)施方案11所述的核酸。

實(shí)施方案16.一種宿主細(xì)胞，其包含如實(shí)施方案13所述的表達(dá)載體。

實(shí)施方案17.一種宿主細(xì)胞，其包含如實(shí)施方案14所述的表達(dá)載體。

實(shí)施方案18.一種宿主細(xì)胞，其包含如實(shí)施方案15所述的表達(dá)載體。

實(shí)施方案19.如實(shí)施方案17所述的宿主細(xì)胞，其還包含如實(shí)施方案13所述的表達(dá)載體。

實(shí)施方案20.一種產(chǎn)生包含免疫球蛋白重鏈可變區(qū)或免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)的多肽的方法，所述方法包括：(a)將如實(shí)施方案16或17所述的宿主細(xì)胞在使得所述宿主細(xì)胞表達(dá)包含所述免疫球蛋白重鏈可變區(qū)或所述免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)的所述多肽的條件下生長；以及(b)純化包含所述免疫球蛋白重鏈可變區(qū)或所述免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)的所述多肽。

實(shí)施方案21.一種產(chǎn)生結(jié)合百日咳毒素蛋白的抗體的方法，所述方法包括：(a)將如實(shí)施方案18或19所述的宿主細(xì)胞在使得所述宿主細(xì)胞表達(dá)包含所述免疫球蛋白重鏈可變區(qū)和/或所述免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)的條件下生長，從而產(chǎn)生所述抗體；以及(b)純化所述抗體。

實(shí)施方案22.一種藥物組合物，其包含如實(shí)施方案1-10中任一項(xiàng)所述的一種或多種抗體和藥學(xué)上可接受的賦形劑。

實(shí)施方案23.如實(shí)施方案22所述的藥物組合物，其包含如實(shí)施方案1、2、5、7或8中任一項(xiàng)所述的人源化1B7抗體和如實(shí)施方案3、4、6、9或10中任一項(xiàng)所述的人源化11E6抗體。

實(shí)施方案24.如實(shí)施方案23所述的藥物組合物，其中所述組合物被配制為膠體分散系統(tǒng)、大分子復(fù)合物、納米膠囊、微球、珠粒、水包油型乳液、膠束、混合膠束或脂質(zhì)體。

實(shí)施方案25.如實(shí)施方案22-24中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述組合物被配制用于口服、鼻內(nèi)、肺部、皮內(nèi)、經(jīng)皮、皮下、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)遞送。

實(shí)施方案26.一種治療感染百日咳博德特氏桿菌的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用如實(shí)施方案1-10中任一項(xiàng)所述的抗體或如實(shí)施方案22-25中任一項(xiàng)所述的藥物組合物。

實(shí)施方案27.一種治療感染百日咳博德特氏桿菌的患者的方法，所述方法包括向所述患者共同施用有效量的如實(shí)施方案1、2、5、7或8中任一項(xiàng)所述的人源化1B7抗體和有效量的如實(shí)施方案3、4、6、9或10中任一項(xiàng)所述的人源化11E6抗體。

實(shí)施方案28.如實(shí)施方案27所述的方法，其中所述人源化1B7抗體和所述人源化11E6抗體被同時(shí)施用至所述患者。

實(shí)施方案29.如實(shí)施方案27所述的方法，其中所述人源化1B7抗體在將所述人源化11E6抗體施用至所述患者之前施用至所述患者。

實(shí)施方案30.如實(shí)施方案27所述的方法，其中所述人源化1B7抗體在將所述人源化11E6抗體施用至所述患者之后施用至所述患者。

實(shí)施方案31.如實(shí)施方案27所述的方法，其中所述人源化1B7抗體和所述人源化11E6抗體的共同施用產(chǎn)生協(xié)同作用。

實(shí)施方案32.一種治療感染百日咳博德特氏桿菌的患者的方法，所述方法包括向所述患者共同施用如實(shí)施方案1-10中任一項(xiàng)所述的至少一種抗體或如實(shí)施方案22-25中任一項(xiàng)所述的藥物組合物以及抗微生物劑。

實(shí)施方案33.如實(shí)施方案33所述的方法，其中所述抗微生物劑選自阿奇霉素、克拉霉素、紅霉素、三甲氧芐二氨嘧啶-磺胺甲噁唑、羅紅霉素、酮內(nèi)脂、氨芐西林、阿莫西林、四環(huán)素、氯霉素、氟喹諾酮以及頭孢菌素。

實(shí)施方案34.如實(shí)施方案26-33中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述患者是人。

實(shí)施方案35.如實(shí)施方案34所述的方法，其中所述人是嬰兒。

實(shí)施方案36.一種預(yù)防先前暴露于百日咳博德特氏桿菌的受試者的百日咳博德特氏桿菌感染的方法，所述方法包括向所述受試者施用有效量的如實(shí)施方案1-10中任一項(xiàng)所述的抗體或有效量的如實(shí)施方案22-25中任一項(xiàng)所述的藥物組合物。

實(shí)施方案37.如實(shí)施方案26-36中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法包括降低白血細(xì)胞計(jì)數(shù)。

實(shí)施方案38.如實(shí)施方案26-37中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法包括降低咳嗽的持續(xù)時(shí)間和/或頻率。

實(shí)施方案39.如實(shí)施方案26-38中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法包括降低鼻咽和/或肺中的百日咳博德特氏桿菌水平。

實(shí)施方案40.如實(shí)施方案26-39中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述百日咳毒素蛋白被中和。

實(shí)施方案41.如實(shí)施方案40所述的方法，其中所述百日咳毒素蛋白被阻止結(jié)合其細(xì)胞受體。

實(shí)施方案42.如實(shí)施方案40所述的方法，其中所述百日咳毒素蛋白被阻止到達(dá)細(xì)胞胞質(zhì)。

實(shí)施方案43.一種治療感染副百日咳博德特氏桿菌的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的如實(shí)施方案1-10中任一項(xiàng)所述的抗體或有效量的如實(shí)施方案22-25中任一項(xiàng)所述的藥物組合物。

實(shí)施方案44.一種治療感染副百日咳博德特氏桿菌的患者的方法，所述方法包括向所述患者共同施用有效量的如實(shí)施方案1、2、5、7或8中任一項(xiàng)所述的人源化1B7抗體和有效量的如實(shí)施方案3、4、6、9或10中任一項(xiàng)所述的人源化11E6抗體。

實(shí)施方案45.一種預(yù)防先前暴露于百日咳博德特氏桿菌的受試者的副百日咳博德特氏桿菌感染的方法，所述方法包括向所述受試者施用有效量的如實(shí)施方案1-10中任一項(xiàng)所述的抗體或如實(shí)施方案22-25中任一項(xiàng)所述的藥物組合物。

P1實(shí)施方案：

實(shí)施方案1.一種結(jié)合百日咳毒素蛋白的人源化1B7抗體，所述人源化1B7抗體包含免疫球蛋白重鏈可變區(qū)和免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)，其中所述免疫球蛋白重鏈可變區(qū)包含選自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的氨基酸序列；以及所述免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)包含選自SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12的氨基酸序列。

實(shí)施方案2.一種結(jié)合百日咳毒素蛋白的人源化1B7抗體，所述人源化1B7抗體包含選自以下各項(xiàng)的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)和免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)：(a)包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)和包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)；(b)包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)和包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)；(c)包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)和包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)；(d)包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)和包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)；以及(e)包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)和包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)。

實(shí)施方案3.一種結(jié)合百日咳毒素蛋白的人源化11E6抗體，所述人源化11E6抗體包含免疫球蛋白重鏈可變區(qū)和免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)，其中所述免疫球蛋白重鏈可變區(qū)包含選自SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18的氨基酸序列；并且所述免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)包含選自SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24的氨基酸序列。

實(shí)施方案4.一種結(jié)合百日咳毒素蛋白的人源化11E6抗體，所述人源化11E6抗體包含選自以下各項(xiàng)的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)和免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)：(a)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)和包含SEQ ID NO：20的氨基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)；(b)包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)和包含SEQ ID NO：21的氨基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)；(c)包含SEQ ID NO：16的氨基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)和包含SEQ ID NO：22的氨基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)；(d)包含SEQ ID NO：17的氨基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)和包含SEQ ID NO：23的氨基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)；以及(e)包含SEQ ID NO：18的氨基酸序列的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)和包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)。

實(shí)施方案5.如實(shí)施方案1或2所述的抗體，其中所述抗體結(jié)合所述百日咳毒素蛋白的K_D為3nM或更低。

實(shí)施方案6.如實(shí)施方案3或4所述的抗體，其中所述抗體結(jié)合所述百日咳毒素蛋白的K_D為12nM或更低。

實(shí)施方案7.一種結(jié)合百日咳毒素蛋白的人源化1B7抗體，其中所述抗體結(jié)合所述百日咳毒素蛋白的K_D為3nM或更低。

實(shí)施方案8.如實(shí)施方案6所述的抗體，其中所述K_D是約3nM、或約2nM、或約1nM、或約0.5nM。

實(shí)施方案9.一種結(jié)合百日咳毒素蛋白的人源化11E6抗體，其中所述抗體結(jié)合所述百日咳毒素蛋白的K_D為12nM或更低。

實(shí)施方案10.如實(shí)施方案9所述的抗體，其中所述K_D是約12nM、或約10nM、或約8nM、或約6nM、或4nM、或2nM、或約1nM、或約0.5nM。

實(shí)施方案11.一種分離的核酸，其包含編碼如實(shí)施方案1-10中任一項(xiàng)所述的免疫球蛋白重鏈可變區(qū)的核苷酸序列。

實(shí)施方案12.一種分離的核酸，其包含編碼如實(shí)施方案1-10中任一項(xiàng)所述的免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列。

實(shí)施方案13.一種表達(dá)載體，其含有如實(shí)施方案11所述的核酸。

實(shí)施方案14.一種表達(dá)載體，其含有如實(shí)施方案12所述的核酸。

實(shí)施方案15.如實(shí)施方案14所述的表達(dá)載體，其還包含如實(shí)施方案11所述的核酸。

實(shí)施方案16.一種宿主細(xì)胞，其包含如實(shí)施方案13所述的表達(dá)載體。

實(shí)施方案17.一種宿主細(xì)胞，其包含如實(shí)施方案14所述的表達(dá)載體。

實(shí)施方案18.一種宿主細(xì)胞，其包含如實(shí)施方案15所述的表達(dá)載體。

實(shí)施方案19.如實(shí)施方案17所述的宿主細(xì)胞，其還包含如實(shí)施方案13所述的表達(dá)載體。

實(shí)施方案20.一種產(chǎn)生包含免疫球蛋白重鏈可變區(qū)或免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)的多肽的方法，所述方法包括：(a)將如實(shí)施方案16或17所述的宿主細(xì)胞在使得所述宿主細(xì)胞表達(dá)包含所述免疫球蛋白重鏈可變區(qū)或所述免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)的所述多肽的條件下生長；以及(b)純化包含所述免疫球蛋白重鏈可變區(qū)或所述免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)的所述多肽。

實(shí)施方案21.一種產(chǎn)生結(jié)合百日咳毒素蛋白的抗體的方法，所述方法包括：(a)將如實(shí)施方案18或19所述的宿主細(xì)胞在使得所述宿主細(xì)胞表達(dá)包含所述免疫球蛋白重鏈可變區(qū)和/或所述免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)的條件下生長，從而產(chǎn)生所述抗體；以及(b)純化所述抗體。

實(shí)施方案22.一種藥物組合物，其包含如實(shí)施方案1-10中任一項(xiàng)所述的抗體和藥學(xué)上可接受的賦形劑。

實(shí)施方案23.如實(shí)施方案22所述的藥物組合物，其包含如實(shí)施方案1、2、5、7或8中任一項(xiàng)所述的人源化1B7抗體和如實(shí)施方案3、4、6、9或10中任一項(xiàng)所述的人源化11E6抗體。

實(shí)施方案24.如實(shí)施方案23所述的藥物組合物，其中所述組合物被配制為膠體分散系統(tǒng)、大分子復(fù)合物、納米膠囊、微球、珠粒、水包油型乳液、膠束、混合膠束或脂質(zhì)體。

實(shí)施方案25.如實(shí)施方案22-24中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，其中所述組合物被配制用于口服、鼻內(nèi)、肺部、皮內(nèi)、經(jīng)皮、皮下、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)遞送。

實(shí)施方案26.一種治療感染百日咳博德特氏桿菌的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用如實(shí)施方案1-10中任一項(xiàng)所述的抗體或如實(shí)施方案22-25中任一項(xiàng)所述的藥物組合物。

實(shí)施方案27.一種治療感染百日咳博德特氏桿菌的患者的方法，所述方法包括向所述患者共同施用如實(shí)施方案1、2、5、7或8中任一項(xiàng)所述的人源化1B7抗體和如實(shí)施方案3、4、6、9或10中任一項(xiàng)所述的人源化11E6抗體。

實(shí)施方案28.如實(shí)施方案27所述的方法，其中所述人源化1B7抗體和所述人源化11E6抗體被同時(shí)施用至所述患者。

實(shí)施方案29.如實(shí)施方案27所述的方法，其中所述人源化1B7抗體在將所述人源化11E6抗體施用至所述患者之前施用至所述患者。

實(shí)施方案30.如實(shí)施方案27所述的方法，其中所述人源化1B7抗體在將所述人源化11E6抗體施用至所述患者之后施用至所述患者。

實(shí)施方案31.如實(shí)施方案27所述的方法，其中所述人源化1B7抗體和所述人源化11E6抗體的共同施用產(chǎn)生協(xié)同作用。

實(shí)施方案32.一種治療感染百日咳博德特氏桿菌的患者的方法，所述方法包括向所述患者共同施用如實(shí)施方案1-10中任一項(xiàng)所述的至少一種抗體或如實(shí)施方案22-25中任一項(xiàng)所述的藥物組合物以及抗微生物劑。

實(shí)施方案33.如實(shí)施方案33所述的方法，其中所述抗微生物劑選自阿奇霉素、克拉霉素、紅霉素、三甲氧芐二氨嘧啶-磺胺甲噁唑、羅紅霉素、酮內(nèi)脂、氨芐西林、阿莫西林、四環(huán)素、氯霉素、氟喹諾酮以及頭孢菌素。

實(shí)施方案34.如實(shí)施方案26-33中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述患者是人。

實(shí)施方案35.如實(shí)施方案34所述的方法，其中所述人是嬰兒。

實(shí)施方案36.一種預(yù)防先前暴露于百日咳博德特氏桿菌的受試者的百日咳博德特氏桿菌感染的方法，所述方法包括向所述受試者施用如實(shí)施方案1-10中任一項(xiàng)所述的抗體或如實(shí)施方案22-25中任一項(xiàng)所述的藥物組合物。

實(shí)施方案37.如實(shí)施方案26-36中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法包括降低白血細(xì)胞計(jì)數(shù)。

實(shí)施方案38.如實(shí)施方案26-37中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法包括降低咳嗽的持續(xù)時(shí)間和/或頻率。

實(shí)施方案39.如實(shí)施方案26-38中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法包括降低鼻咽和/或肺中的百日咳博德特氏桿菌水平。

實(shí)施方案40.如實(shí)施方案26-39中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述百日咳毒素蛋白被中和。

實(shí)施方案41.如實(shí)施方案40所述的方法，其中所述百日咳毒素蛋白被阻止結(jié)合其細(xì)胞受體。

實(shí)施方案42.如實(shí)施方案40所述的方法，其中所述百日咳毒素蛋白被阻止到達(dá)細(xì)胞胞質(zhì)。

實(shí)施方案43.一種治療感染副百日咳博德特氏桿菌的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用如實(shí)施方案1-10中任一項(xiàng)所述的抗體或如實(shí)施方案22-25中任一項(xiàng)所述的藥物組合物。

實(shí)施方案44.一種治療感染副百日咳博德特氏桿菌的患者的方法，所述方法包括向所述患者共同施用如實(shí)施方案1、2、5、7或8中任一項(xiàng)所述的人源化1B7抗體和如實(shí)施方案3、4、6、9或10中任一項(xiàng)所述的人源化11E6抗體。

實(shí)施方案45.一種預(yù)防先前暴露于百日咳博德特氏桿菌的受試者的副百日咳博德特氏桿菌感染的方法，所述方法包括向所述受試者施用如實(shí)施方案1-10中任一項(xiàng)所述的抗體或如實(shí)施方案22-25中任一項(xiàng)所述的藥物組合物。

實(shí)施方案46.一種組合物，其如本文所公開。

實(shí)施方案47.如本文所述的任一組合物用于以下中的一種或多種的用途：治療百日咳和制造用于治療百日咳的藥劑。