技術領域

本發(fā)明在蛋白工程改造的領域中，具體涉及腦膜炎球菌因子H結合蛋白(fHbp)，其已知是有用的疫苗免疫原。

背景技術：

腦膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)是一種革蘭陰性莢膜細菌，其寄居在大約10％人群的上呼吸道?？色@得針對血清群A、C、W135和Y的綴合物疫苗可用，但可用于在兩個劑量方案中預防血清群B的唯一疫苗是在2013年批準的BEXSERO?產(chǎn)品。

BEXSERO?中的保護性免疫原之一是fHbp，其也被稱為蛋白‘741’(參考文獻中的SEQ ID NO:2536；本文中的SEQ ID 1)，‘NMB1870’，‘GNA1870’[2-4]，‘P2086’，‘LP2086’或‘ORF2086’[5-7]。該蛋白的3D結構是已知的[8，9]，且該蛋白具有通過短接頭連接的兩個β-桶。許多出版物都報道了該蛋白在腦膜炎球菌疫苗中的保護效力，例如參見參考文獻10-14。fHbp脂蛋白在所有血清群的各種菌株中都表達。已將fHbp序列分為三種變體[2](在本文中稱為v1、v2和v3)，并且已通常發(fā)現(xiàn)針對給定變體產(chǎn)生的血清針對表達該變體的菌株是殺細菌的，但其對表達其它兩種變體之一的菌株無活性，即存在變體內(nèi)交叉保護、但不存在變體間交叉保護(除了一些v2和v3交叉反應性)。

為了增加家族內(nèi)交叉反應性，fHbp序列已被工程改造以含有針對所有三種變體的特異性[15]。蛋白工程改造也已經(jīng)被用于去除fHbp與鐵載體[16]和與因子H[17-25]的相互作用。對于所有三種變體已經(jīng)報道了與fH的相互作用的破壞，并且據(jù)推測提供了優(yōu)異的疫苗免疫原[22，26]。然而，對于v2多肽，參考文獻23和24報道了固有不穩(wěn)定性，這也見于fH結合被破壞的突變體。該不穩(wěn)定性似乎由N-末端β-桶結構域導致，并且參考文獻23警告，該桶中的任何取代可能促進不穩(wěn)定。

本發(fā)明的一個目標是提供進一步的fHbp v2和v3突變體，但具有增強的穩(wěn)定性。

發(fā)明公開內(nèi)容

v2中來自菌株2996的全長fHbp具有以下氨基酸序列(SEQ ID NO:2)：

MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ

成熟脂蛋白缺乏SEQ ID NO:2的前19個氨基酸(加下劃線；提供了SEQ ID NO:4)，且SEQ ID NO:2的ΔG形式缺乏前26個氨基酸(SEQ ID NO:5)。

v3中來自菌株M1239的全長fHbp具有以下氨基酸序列(SEQ ID NO:3)：

MNRTAFCCLSLTTALILTACSSGGGGSGGGGVAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDSI PQNGTLTLSAQGAEKTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQNHSAVVALQIEKINNPDKTDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPGGKAEYHGKAFSSDDPNGRLHYSIDFTKKQGYGRIEHLKTLEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ

成熟脂蛋白缺乏SEQ ID NO:3的前19個氨基酸(加下劃線；提供了SEQ ID NO:40)，且SEQ ID NO:3的ΔG形式缺乏前31個氨基酸(SEQ ID NO:17)。

本發(fā)明人已經(jīng)鑒定了SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3內(nèi)可以被修飾以增加多肽的穩(wěn)定性的殘基。這些殘基通?？缭絭2和v3序列存在，所以其修飾可以提供具有增強穩(wěn)定性的v2和v3 fHbp序列。而且，本發(fā)明人已經(jīng)顯示，除了增加穩(wěn)定性以外，這些殘基的突變可以有利地減少與人因子H (fH)的結合。然而，此外，本文公開的突變可以與其它突變組合，例如以減少與人因子H (fH)的結合，其中幾個突變是本領域中已知的。

因此，通常本發(fā)明提供了突變體v2或v3 fHbp，其相對于野生型fHbp(例如，相對于SEQ ID NO:2或3)具有增加的穩(wěn)定性，并且，任選地，其對于人因子H比對于野生型fHbp(例如，相對于SEQ ID NO:2或3)具有更低的親和力。穩(wěn)定性的增加和fH親和力的任選降低優(yōu)選由一種或多種相同突變導致，但是在一些實施方案中，它們可能是由于組合突變的分開作用。具有增加的穩(wěn)定性和降低的fH親和力兩者的突變體fHbp蛋白是優(yōu)選的。

在第一個實施方案中，本發(fā)明提供了包含突變體fHbp v2氨基酸序列的多肽，其中：(a)所述氨基酸序列與SEQ ID NO:5具有至少k%序列同一性，和/或包含SEQ ID NO:5的片段；但(b)所述氨基酸序列在以下殘基中的一個或多個處不同于SEQ ID NO:5：S32、V33、L39、L41、F69、V100、I113、F122、L123、V124、S125、G126、L127、G128、S151、H239和/或E240。

當特征(a)涉及片段時，所述片段將包括(b)中列出的殘基中的至少一個，但當與SEQ ID NO:5中的該殘基相比時，該殘基將不同。(a)的片段將通常為至少7個氨基酸長，例如來自SEQ ID NO:5的8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、24、26、28、40、45、50、55、60個或更多個連續(xù)氨基酸。所述片段將通常包括來自SEQ ID NO:5的至少一個表位。對于fHbp確立了表位鑒定和作圖[11；27-31]。與SEQ ID NO:5共享至少30個連續(xù)氨基酸將是典型的，并且通常突變體fHbp v2氨基酸序列將包括來自SEQ ID NO:5的幾個(例如2、3、4、5個或更多個)片段?？傮w而言，突變體fHbp v2氨基酸序列可以與SEQ ID NO:5具有至少k%序列同一性且包括SEQ ID NO:5的幾個片段。

k的值可以選自80、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或更高。其優(yōu)選為90(即，突變體fHbp v2氨基酸序列與SEQ ID NO:5具有至少90％同一性)且更優(yōu)選為95。

施用于宿主動物之后，所述多肽可以引發(fā)可以識別由SEQ ID NO:4組成的野生型腦膜炎球菌多肽的抗體。這些抗體理想地是殺細菌的(參見下文)。這些抗體可以包括不識別v1或v3多肽(例如，由SEQ ID NO:46組成的野生型腦膜炎球菌多肽和由SEQ ID NO:40組成的野生型腦膜炎球菌多肽)的一些抗體，盡管它們還可以包括與v1和/或v3多肽交叉反應的一些抗體。

在相同實驗條件下，所述多肽具有比相同多肽更高的穩(wěn)定性，但(b)的序列差異，例如比由SEQ ID NO:4組成的野生型腦膜炎球菌多肽更高的穩(wěn)定性。穩(wěn)定性增強可以使用差示掃描量熱法(DSC)進行評價，例如如參考文獻32和33中所討論。DSC先前已經(jīng)用來評價v2 fHbp的穩(wěn)定性[24]。用于DSC評價穩(wěn)定性的合適條件可以使用緩沖溶液(例如25mM Tris)中的20μM多肽與6至8(例如7-7.5)的pH與100-200mM NaCl (例如150mM)。

在一些實施方案中，本發(fā)明的多肽相對于SEQ ID NO:5是截短的。與野生型成熟序列相比，SEQ ID NO:5已經(jīng)在N-末端截短最多達且包括聚-甘氨酸序列(比較SEQ ID NO:4和5)，但SEQ ID NO:5可以在C-末端截短和/或在N-末端進一步截短。

穩(wěn)定性的增加理想地為至少5℃，例如至少10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃或更高。這些溫度是指如通過DSC所評價的熱轉變中點(Tm)的提高。野生型fHbp在解折疊期間顯示兩個DSC峰(N-末端結構域一個，C-末端結構域一個)，并且當本發(fā)明的多肽包括兩個這樣的結構域時，所述提高是指N-末端結構域的穩(wěn)定性，這對于野生型v2序列可以甚至低于40℃發(fā)生[24](而C-末端結構域可以具有80℃或更高的Tm)。因此，本發(fā)明的突變體fHbp v2氨基酸序列優(yōu)選具有N-末端結構域，其具有至少45℃，例如，>50℃、>55℃、>60℃、>65℃、>70℃、>75℃或甚至>80℃的Tm。

在第二個實施方案中，本發(fā)明提供了包含突變體fHbp v3氨基酸序列的多肽，其中：(a)所述氨基酸序列與SEQ ID NO:17具有至少j%序列同一性，和/或包含SEQ ID NO:17的片段；但(b)所述氨基酸序列在以下殘基中的一個或多個處不同于SEQ ID NO:17：S32、I33、L39、L41、F72、V103、T116、F125、L126、V127、S128、G129、L130、G131、S154、H242和/或E243。

當特征(a)涉及片段時，所述片段將包括(b)中列出的殘基中的至少一個，但當與SEQ ID NO:17中的該殘基相比時，該殘基將不同。(a)的片段將通常為至少7個氨基酸長，例如來自SEQ ID NO:17的8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、24、26、28、40、45、50、55、60個或更多個連續(xù)氨基酸。所述片段將通常包括來自SEQ ID NO:17的至少一個表位。對于fHbp確立了表位鑒定和作圖[11；27-31]。與SEQ ID NO:17共享至少30個連續(xù)氨基酸將是典型的，并且通常突變體fHbp v3氨基酸序列將包括來自SEQ ID NO:17的幾個(例如2、3、4、5個或更多個)片段?？傮w而言，突變體fHbp v3氨基酸序列可以與SEQ ID NO:17具有至少j%序列同一性且包括SEQ ID NO:17的幾個片段。

j的值可以選自80、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或更高。其優(yōu)選為90(即，突變體fHbp v3氨基酸序列與SEQ ID NO:17具有至少90％同一性)且更優(yōu)選為95。

施用于宿主動物之后，所述多肽可以引發(fā)可以識別由SEQ ID NO:40組成的野生型腦膜炎球菌多肽的抗體。這些抗體理想地是殺細菌的(參見下文)。這些抗體可以包括不識別v1或v2多肽(例如，由SEQ ID NO:46組成的野生型腦膜炎球菌多肽和由SEQ ID NO:4組成的野生型腦膜炎球菌多肽)的一些抗體，盡管它們還可以包括與v1和/或v2多肽交叉反應的一些抗體。

在相同實驗條件下，所述多肽具有比相同多肽更高的穩(wěn)定性，但(b)的序列差異，例如比由SEQ ID NO:40組成的野生型腦膜炎球菌多肽更高的穩(wěn)定性。穩(wěn)定性增強可以使用差示掃描量熱法(DSC)進行評價，例如如參考文獻32和33中所討論。DSC先前已經(jīng)用來評價v3 fHbp的穩(wěn)定性[23]。用于DSC評價穩(wěn)定性的合適條件可以使用緩沖溶液(例如25mM Tris)中的20μM多肽與6至8(例如7-7.5)的pH與100-200mM NaCl (例如150mM)。

在一些實施方案中，本發(fā)明的多肽相對于SEQ ID NO:17是截短的。與野生型成熟序列相比，SEQ ID NO:17已經(jīng)在N-末端截短最多達且包括聚-甘氨酸序列(比較SEQ ID NO:40和17)，但SEQ ID NO:17可以在C-末端截短和/或在N-末端進一步截短。

穩(wěn)定性的增加理想地為至少5℃，例如至少10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃或更高。這些溫度是指如通過DSC所評價的熱轉變中點(Tm)的提高。野生型fHbp在解折疊期間顯示兩個DSC峰(N-末端結構域一個，C-末端結構域一個)，并且當本發(fā)明的多肽包括兩個這樣的結構域時，所述提高是指N-末端結構域的穩(wěn)定性，這對于野生型v3序列可以在約60℃或更低時發(fā)生[24](而C-末端結構域可以具有80℃或更高的Tm)。因此，本發(fā)明的突變體fHbp v3氨基酸序列優(yōu)選具有N-末端結構域，其具有至少65℃，例如，>70℃、>75℃或甚至>80℃的Tm。

相對于SEQ ID NO:5的突變

本發(fā)明的第一個實施方案的多肽包含與SEQ ID NO:5具有至少k%同一性的氨基酸序列，和/或包含SEQ ID NO:5的片段。然而，與SEQ ID NO:5相比，該氨基序列具有在氨基酸殘基S32、V33、L39、L41、F69、V100、I113、F122、L123、V124、S125、G126、L127、G128、S151、H239和/或E240中的一個或多個處，例如，在這17個殘基中的2、3、4、5或更多個處的修飾。這些殘基根據(jù)SEQ ID NO:5編號；以匹配新生野生型序列(SEQ ID NO:2)，所述編號應當改變+26(即SEQ ID NO:5的Ser-32是SEQ ID NO:2的Ser-58)，且以匹配成熟野生型序列(SEQ ID NO:4)，所述編號應當改變+7(其還允許與參考文獻25的容易比較)。

用于突變的優(yōu)選殘基是S32、V100、L123、V124、S125、G126、L127、G128、H239和/或E240。這些殘基處的突變得到與野生型v2相比具有良好穩(wěn)定性的蛋白。在該子集內(nèi)，優(yōu)選殘基是S32、L123、V124、S125、G126、L127和/或G128。最優(yōu)選位置是S32、L123、V124、S125、G126、L127和/或G128，其中殘基S32和/或L123是特別優(yōu)選的，例如，S32V和/或L123R。當V100、S125和/或G126中的一個或多個被突變時，還優(yōu)選突變該三者(trio)之外的殘基。

指定殘基可以被缺失，但其優(yōu)選被不同的氨基酸取代。例如，Ser-32可以被其它19個天然存在的氨基酸中的任一個取代。在一些實施方案中，當進行取代時，替代氨基酸可以是簡單氨基酸，諸如甘氨酸或丙氨酸。在其它實施方案中，替代氨基酸是保守取代，例如其在以下四組內(nèi)進行：(1)酸性的，即天冬氨酸、谷氨酸；(2)堿性的，即賴氨酸、精氨酸、組氨酸；(3)非極性的，即丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不帶電的極性的，即甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。在其它實施方案中，所述取代是非保守的。在一些實施方案中，所述取代不使用丙氨酸。

指定殘基處的優(yōu)選取代如下：S32V；V33C；L39C；L41C；F69C；V100T；I113S；F122C；L123R；V124I；S125G或S125T；G126D；L127I；G128A；S151C；H239R；E240H。

當突變體fHbp v2氨基酸序列包括E240處的取代時，如果僅E240被突變，則該取代將不是被丙氨酸，盡管如果(b)中列出的進一步氨基酸被取代，例如如果殘基E240和H239均被突變，則其可以是丙氨酸。理想地，E240自身不被突變，所以具有E240處的取代的突變體fHbp v2氨基酸序列也應當包括第二殘基處(例如E240和H239兩者處)的取代(參見突變體#1和#11)。

當突變體fHbp v2氨基酸序列包括F122處的取代時，如果僅F122被突變，則該取代將不是被丙氨酸，盡管如果(b)中列出的進一步氨基酸被取代，例如如果殘基F122和S151均被突變，則其可以是丙氨酸。理想地，F(xiàn)122自身不被突變，所以具有F122處的取代的突變體fHbp v2氨基酸序列也應當包括第二殘基處的取代。當F122被取代時，優(yōu)選的是，S151也被取代，例如兩者均被半胱氨酸取代，以允許形成二硫橋(參見突變體#10)。

當突變體fHbp v2氨基酸序列包括L123處的取代時，如果僅L123被突變，則該取代將不是被丙氨酸，盡管如果(b)中列出的進一步氨基酸被取代，例如如果殘基L123和S32均被突變，則其可以是丙氨酸。如果L123自身被突變，則優(yōu)選被精氨酸取代(例如，參見突變體#4)。然而，在一些實施方案中，L123自身不被突變，所以具有L123處的取代的突變體fHbp v2氨基酸序列也可以包括第二殘基處的取代。當L123被取代時，可以優(yōu)選的是：(i) S32也被取代，如突變體#3中所見，并且任選地S125也被取代，如突變體#20和#22中所見；或(ii)殘基124-128中的一個或多個也被取代，例如，如突變體#12中所見。

當突變體fHbp v2氨基酸序列包括V124處的取代時，優(yōu)選的是如果僅V124被突變，則該取代將不是被丙氨酸，盡管如果(b)中列出的進一步氨基酸被取代，例如如果殘基123-128中的一個或多個也被突變，則其可以是丙氨酸。如果V124自身被突變，則優(yōu)選被異亮氨酸取代。然而，理想地，V124自身不被突變，所以具有V124處的取代的突變體fHbp v2氨基酸序列也應當包括第二殘基處的取代。當V124被取代時，優(yōu)選的是，殘基124-128中的一個或多個也被取代，例如，如突變體#12中所見。

當突變體fHbp v2氨基酸序列包括L127處的取代時，優(yōu)選的是如果僅L127被突變，則該取代將不是被丙氨酸，盡管如果(b)中列出的進一步氨基酸被取代，例如如果殘基123-128中的一個或多個也被突變，則其可以是丙氨酸。如果L127自身被突變，則優(yōu)選被異亮氨酸取代。然而，理想地，L127自身不被突變，所以具有L127處的取代的突變體fHbp v2氨基酸序列也應當包括第二殘基處的取代。當L127被取代時，優(yōu)選的是，殘基124-128中的一個或多個也被取代，例如，如突變體#12中所見。

當突變體fHbp v2氨基酸序列包括S32處的取代時，優(yōu)選的是，如果僅S32被突變，則該取代將不是被丙氨酸，盡管如果(b)中列出的進一步氨基酸被取代，例如如果殘基L123和S32均被突變，則其可以是丙氨酸。如果S32自身被突變，則優(yōu)選被纈氨酸取代。然而，理想地，S32自身不被突變，所以具有S32處的取代的突變體fHbp v2氨基酸序列也應當包括第二殘基處的取代。當S32被取代時，優(yōu)選的是：(i) L123也被取代，如突變體#3中所見，并且任選地S125也被取代，如突變體#20和#22中所見；或(ii) S125也被取代，例如，如突變體#19和#21中所見。

當突變體fHbp v2氨基酸序列包括I113處的取代時，如果僅I113被突變，則該取代將不是被丙氨酸，盡管如果(b)中列出的進一步氨基酸被取代，則其可以是丙氨酸。如果I113自身被突變，則優(yōu)選被絲氨酸取代，例如，如突變體#7中所見。

當突變體fHbp v2氨基酸序列包括V33處的取代時，這優(yōu)選不是被異亮氨酸。當突變體fHbp v2氨基酸序列包括I113處的取代時，這優(yōu)選不是被蘇氨酸或被丙氨酸。當突變體fHbp v2氨基酸序列包括S151處的取代時，這優(yōu)選不是被苯丙氨酸。當突變體fHbp v2氨基酸序列包括H239和E240兩者處的取代時，這優(yōu)選不是取代為R239和Q240。

當進行多于一個取代時，這些可以選自如下組2A至2O：

2A：殘基239和240，例如突變體#1。

2B：殘基32和123，例如突變體#3。

2C：殘基125和126，例如突變體#5。

2D：殘基100、125和126，例如突變體#6。

2E：殘基33和39，例如突變體#8。

2F：殘基41和69，例如突變體#9。

2G：殘基122和151，例如突變體#10。

2H：殘基100、125、126、239和240，例如突變體#11。

2I：殘基32和125，例如突變體#19和#21。

2J：殘基32、123和125，例如突變體#20和#22。

2K：殘基33和39，兩者均被Cys取代，例如突變體#8。

2L：殘基41和69，兩者均被Cys取代，例如突變體#9。

2M：殘基122和151，兩者均被Cys取代，例如突變體#10。

2N：殘基123、124、125、126、127和128，例如突變體#12。

2O：殘基32、123、124、125、126、127和128。

因此，例如，如果殘基239待被取代，則用于取代的優(yōu)選第二殘基是240(即組2A)；而且，殘基100、125和126也可能被修飾(即組2H，其是組2A和2D的組合)。在組2A至2N和2O內(nèi)，在指定位置處的優(yōu)選取代是上面列出的那些。對于組2K、2L和2M，意圖引入二硫橋。在組2A至2N內(nèi)，優(yōu)選的突變體是2A、2B、2C、2D、2I、2J和2N。更優(yōu)選的是2C、2I和2N，其中2N是特別優(yōu)選的。組2B提供最優(yōu)選的突變，特別是S32V和L123R(例如SEQ ID NO:20和45)。組2O是突變的另一個優(yōu)選集合，其組合2B、2C和三個進一步突變(例如，以得到SEQ ID NO:58)。

v2序列中指明用于突變的氨基酸殘基相對于來自菌株2996的SEQ ID NO:5進行編號。來自任何其它菌株的v2 fHbp中的相應氨基酸殘基可以通過序列比對容易地鑒定，例如是這樣的氨基酸：當使用成對比對算法(例如，Needleman-Wunsch全局比對算法，如下面詳述)與SEQ ID NO:5比對時，其與本文提及的氨基酸比對。經(jīng)常地，所述氨基酸將與SEQ ID NO:5中所見的是相同的(例如殘基32將是絲氨酸)，但如果這不是這樣的情況，所述比對將容易地鑒定。

除了目的在于增強穩(wěn)定性的上述突變以外，本發(fā)明的多肽可以包括一個或多個進一步突變，例如，以破壞多肽與鐵載體的相互作用，或更優(yōu)選地，以破壞多肽結合至fH的能力。

參考文獻19和25報道了fH和v2 fHbp之間的相互作用可以被殘基R80、D211、E218、E248、T220+H222 (雙重突變)和G236處的突變所破壞。根據(jù)SEQ ID NO:5編號，這些殘基是R73、D203、E210、E240、T213+H215和G228。這些位置中，在D203、E210或T213+H215處突變的多肽是優(yōu)選的，因為參考文獻25報道了這些突變體中的重要抗原沒有損害。參考文獻25中研究的具體取代是R73A、D203A、E210A、T213A+H215A、G228I和E240A；這些取代適合于根據(jù)本發(fā)明使用。

參考文獻24報道了fH和v2 fHbp之間的相互作用可以被殘基R145、S193、F194、L195、A265、E267、K268、V272、I273、L274、E283、T286、H288、F292、T304和E313以及E283+T304(雙重突變)處的突變所破壞。根據(jù)SEQ ID NO:5編號，這些殘基是R73、S121、F122、L123、A192、E194、K195、V199、I200、L201、E210、T213、H215、F219、T231和E240以及E210+T231。這些中的四個與參考文獻25(E210、T213、H215、E240)重疊。參考文獻24中研究的具體取代是丙氨酸(除了A265P和T304E)，并且這些取代適合于根據(jù)本發(fā)明使用。

參考文獻24報道了，v2中的某些取代可以增加對于fH的親和力，并且如果目的在于破壞與fH的結合，則應當避免這些，例如SEQ ID NO:5中的E85(參考文獻24中的殘基157)。

與鐵載體相互作用的殘基可以使用參考文獻16和34中的指導進行突變，例如通過比對本文中的SEQ ID NO:5與參考文獻16的SEQ ID NO:4，以鑒定可以與鐵載體(例如與兒茶酚酸酯(catecholates)、異羥肟酸酯或羧酸酯)相互作用的殘基。

可以突變的進一步殘基包括，但不限于，S23、L24、D30、Q31、R34、D95和/或L102，例如使用參考文獻35中建議的突變。

第一個實施方案的多肽可以包含SEQ ID NO:18至36中的任一種。類似地，考慮到‘ΔG’突變(即，最多達且包括天然聚-Gly序列的新生N-末端的截短)，則第一個實施方案的多肽可以包含SEQ ID NO:18至36(排除其氨基酸1-26)中的任一種。例如，第一個實施方案的多肽可以包含SEQ ID NO:45，或者可以包含SEQ ID NO:58。

考慮到進一步點突變的可能性(例如，以破壞與鐵載體和/或fH的相互作用)，第一個實施方案的多肽可以包含SEQ ID NO:18至36中的任一種(或SEQ ID NO:18至36(排除其氨基酸1-26)中的任一種，諸如SEQ ID NO:45)，但通過最多達5個單一氨基酸變化(即1、2、3、4或5個單一氨基酸取代、缺失和/或插入)進行修飾，條件是施用于宿主動物之后，修飾的序列可以引發(fā)結合至由SEQ ID NO:46的氨基酸序列組成的腦膜炎球菌fHbp多肽的抗體。這樣的氨基酸變化不應當逆轉這些序列中相對于野生型序列的突變，例如SEQ ID NO:45不應當在殘基V32或R123處突變。

本發(fā)明還提供了包含fHbp v2氨基酸序列的多肽，其中所述v2氨基酸序列與v2野生型氨基酸序列是相同的，除了對應于SEQ ID NO:5的Leu-123的氨基酸位置處的突變，條件是所述突變不是取代為丙氨酸(例如，其中所述突變是取代為精氨酸)。例如，所述多肽可以包含SEQ ID NO:5，但具有L123處的突變(除了L123A以外)。

SEQ ID NO:59和60是v2突變體的兩種進一步實例，即菌株8047的突變體#3和#4的成熟形式。

相對于SEQ ID NO:17的突變

本發(fā)明的第二個實施方案的多肽包含與SEQ ID NO:17具有至少j%同一性的氨基酸序列，和/或包含SEQ ID NO:17的片段。然而，與SEQ ID NO:17相比，該氨基序列具有在氨基酸殘基S32、I33、L39、L41、F72、V103、T116、F125、L126、V127、S128、G129、L130、G131、S154、H242和/或E243中的一個或多個處，例如，在這17個殘基中的2、3、4、5或更多個處的修飾。這些殘基根據(jù)SEQ ID NO:17編號；以匹配新生野生型序列(SEQ ID NO:3)，所述編號應當改變+31(即SEQ ID NO:17的Ser-32是SEQ ID NO:3的Ser-63)，且以匹配成熟野生型序列(SEQ ID NO:40)，所述編號應當改變+12。

用于突變的優(yōu)選殘基是S32、V103、L126、V127、S128、G129、L130、G131、H242和/或E243。在該子集內(nèi)，優(yōu)選殘基是S32、L126、V127、S128、G129、L130和/或G131。最優(yōu)選位置是S32、L126、V127、S128、G129、L130和/或G131，其中殘基S32和/或L126是特別優(yōu)選的，例如，S32V和/或L126R。

指定殘基可以被缺失，但其優(yōu)選被不同的氨基酸取代。例如，Ser-32可以被其它19個天然存在的氨基酸中的任一個取代。在一些實施方案中，當進行取代時，替代氨基酸可以是簡單氨基酸，諸如甘氨酸或丙氨酸。在其它實施方案中，替代氨基酸是保守取代，例如其在以下四組內(nèi)進行：(1)酸性的，即天冬氨酸、谷氨酸；(2)堿性的，即賴氨酸、精氨酸、組氨酸；(3)非極性的，即丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不帶電的極性的，即甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。在其它實施方案中，所述取代是非保守的。在一些實施方案中，所述取代不使用丙氨酸。

指定殘基處的優(yōu)選取代如下：S32V；I33C；L39C；L41C；F72C；V103T；T116S；F125C；L126R；V127I；S128G or S128T；G129D；L130I；G131A；S154C；H242R；E243H。

當突變體fHbp v3氨基酸序列包括E243處的取代時，如果僅E243被突變，則該取代將不是被丙氨酸，盡管如果(b)中列出的進一步氨基酸被取代，例如如果殘基E243和H242均被突變，則其可以是丙氨酸。理想地，E243自身不被突變，所以具有E243處的取代的突變體fHbp v3氨基酸序列也應當包括第二殘基處(例如E243和H242兩者處)的取代。

當突變體fHbp v3氨基酸序列包括F125處的取代時，如果僅F125被突變，則該取代將不是被丙氨酸，盡管如果(b)中列出的進一步氨基酸被取代，例如如果殘基F125和S154均被突變，則其可以是丙氨酸。理想地，F(xiàn)125自身不被突變，所以具有F125處的取代的突變體fHbp v3氨基酸序列也應當包括第二殘基處的取代。當F125被取代時，優(yōu)選的是，S154也被取代，例如兩者均被半胱氨酸取代，以允許形成二硫橋。

當突變體fHbp v3氨基酸序列包括L126處的取代時，如果僅L126被突變，則該取代將不是被丙氨酸，盡管如果(b)中列出的進一步氨基酸被取代，例如如果殘基L126和S32均被突變，則其可以是丙氨酸。如果L126自身被突變，則優(yōu)選被精氨酸取代。然而，在一些實施方案中，L126自身不被突變，所以具有L126處的取代的突變體fHbp v3氨基酸序列也可以包括第二殘基處的取代。當L126被取代時，可以優(yōu)選的是：(i) S32也被取代，并且任選地S128也被取代；或(ii)殘基127-131中的一個或多個也被取代。

當突變體fHbp v3氨基酸序列包括V127處的取代時，優(yōu)選的是如果僅V127被突變，則該取代將不是被丙氨酸，盡管如果(b)中列出的進一步氨基酸被取代，例如如果殘基126-131中的一個或多個也被突變，則其可以是丙氨酸。如果V127自身被突變，則優(yōu)選被異亮氨酸取代。然而，理想地，V127自身不被突變，所以具有V127處的取代的突變體fHbp v3氨基酸序列也應當包括第二殘基處的取代。當V127被取代時，優(yōu)選的是，殘基127-131中的一個或多個也被取代。

當突變體fHbp v3氨基酸序列包括L130處的取代時，優(yōu)選的是如果僅L130被突變，則該取代將不是被丙氨酸，盡管如果(b)中列出的進一步氨基酸被取代，例如如果殘基126-131中的一個或多個也被突變，則其可以是丙氨酸。如果L130自身被突變，則優(yōu)選被異亮氨酸取代。然而，理想地，L130自身不被突變，所以具有L130處的取代的突變體fHbp v3氨基酸序列也應當包括第二殘基處的取代。當L130被取代時，優(yōu)選的是，殘基127-131中的一個或多個也被取代。

當突變體fHbp v3氨基酸序列包括S32處的取代時，優(yōu)選的是，如果僅S32被突變，則該取代將不是被丙氨酸，盡管如果(b)中列出的進一步氨基酸被取代，例如如果殘基中的一個或多個，如果殘基L126和S32均被突變，則其可以是丙氨酸。如果S32自身被突變，則優(yōu)選被纈氨酸取代。然而，理想地，S32自身不被突變，所以具有S32處的取代的突變體fHbp v3氨基酸序列也應當包括第二殘基處的取代。當S32被取代時，優(yōu)選的是：(i) L126也被取代，并且任選地S128也被取代，或(ii) S128也被取代。

當突變體fHbp v3氨基酸序列包括T113處的取代時，如果僅T113被突變，則該取代將不是被丙氨酸，盡管如果(b)中列出的進一步氨基酸被取代，則其可以是丙氨酸。如果T113自身被突變，則優(yōu)選被絲氨酸取代。

當突變體fHbp v3氨基酸序列包括I33處的取代時，這優(yōu)選不是被纈氨酸。當突變體fHbp v3氨基酸序列包括T116處的取代時，這優(yōu)選不是被異亮氨酸。當突變體fHbp v3氨基酸序列包括G129處的取代時，這優(yōu)選不是被絲氨酸。當突變體fHbp v3氨基酸序列包括H242和E243兩者處的取代時，這優(yōu)選不是取代為R242和Q243。

當進行多于一個取代時，這些可以選自如下組3A至3O：

3A：殘基242和243。

3B：殘基32和126。

3C：殘基128和129。

3D：殘基103、128和129。

3E：殘基33和39。

3F：殘基41和72。

3G：殘基125和154。

3H：殘基103、128、129、242和243。

3I：殘基32和128。

3J：殘基32、126和128。

3K：殘基33和39，兩者均被Cys取代。

3L：殘基41和72，兩者均被Cys取代。

3M：殘基125和154，兩者均被Cys取代。

3N：殘基126、127、128、129、130和131。

3O：殘基32、126、127、128、129、130和131。

因此，例如，如果殘基242待被取代，則用于取代的優(yōu)選第二殘基是243(即組3A)；而且，殘基103、128和129也可能被修飾(即組3H，其是組3A和3D的組合)。在組3A至3N和3O內(nèi)，在指定位置處的優(yōu)選取代是上面列出的那些。對于組3K、3L和3M，意圖引入二硫橋。在組3A至3N內(nèi)，優(yōu)選的突變體是3A、3B、3C、3D、3I、3J和3N。更優(yōu)選的是3C、3I和3N，其中3N是特別優(yōu)選的。組3B提供最優(yōu)選的突變，特別是S32V和L126R(例如，包含SEQ ID NO:44)。組3O是另一個優(yōu)選突變，其組合3B、3C和三個進一步突變(例如，以得到SEQ ID NO:61)。單獨的突變L126R提供SEQ ID NO:53。

V3序列中指明用于突變的氨基酸殘基相對于來自菌株M1239的SEQ ID NO:17進行編號。來自任何其它菌株的v3 fHbp中的相應氨基酸殘基可以通過序列比對容易地鑒定，例如是這樣的氨基酸：當使用成對比對算法(例如，Needleman-Wunsch全局比對算法，如下面詳述)與SEQ ID NO:17比對時，其與本文提及的氨基酸比對。經(jīng)常地，所述氨基酸將與SEQ ID NO:17中所見的是相同的(例如殘基32將是絲氨酸)，但如果這不是這樣的情況，所述比對將容易地鑒定。

除了目的在于增強穩(wěn)定性的上述突變以外，本發(fā)明的多肽可以包括一個或多個進一步突變，例如，以破壞多肽與鐵載體的相互作用，或更優(yōu)選地，以破壞多肽結合至fH的能力。

參考文獻24報道了fH和v3 fHbp之間的相互作用可以被殘基Q107、I147、L156、A157、L195、V196、V272、E283、T286、T304、V311、E313和E283+T304(雙重突變)處的突變所破壞。根據(jù)SEQ ID NO:17編號，這些殘基是：Q35、I78、L87、A88、L126、V127、V202、E213、T216、T234、V241、E243和E213+T234。參考文獻24中研究的具體取代是丙氨酸(除了A157E和T231E)，并且這些取代適合于根據(jù)本發(fā)明使用。殘基T216和E243也報道于參考文獻23中。參考文獻36報道了fH和v3 fHbp之間的相互作用可以被殘基H288和G318(根據(jù)SEQ ID NO:17編號的H218和G248)處的突變所破壞，且這些取代適合于根據(jù)本發(fā)明使用，例如H218R、G248D。

參考文獻24報道了，v3中的某些取代可以增加對于fH的親和力，并且如果目的在于破壞與fH的結合，則應當避免這些，例如SEQ ID NO:17中的P44(參考文獻24中的殘基106)。

與鐵載體相互作用的殘基可以使用參考文獻16和34中的指導進行突變，例如通過比對本文中的SEQ ID NO:17與參考文獻16的SEQ ID NO:4，以鑒定可以與鐵載體(例如與兒茶酚酸酯(catecholates)、異羥肟酸酯或羧酸酯)相互作用的殘基。

第二個實施方案的多肽可以包含SEQ ID NO:41至44中的任一種。考慮到進一步點突變的可能性(例如，以破壞與鐵載體和/或fH的相互作用)，第一個實施方案的多肽可以包含SEQ ID NO:41至44中的任一種，但通過最多達5個單一氨基酸變化(即1、2、3、4或5個單一氨基酸取代、缺失和/或插入)進行修飾，條件是施用于宿主動物之后，修飾的序列可以引發(fā)結合至由SEQ ID NO:40的氨基酸序列組成的腦膜炎球菌fHbp多肽的抗體。這樣的氨基酸變化不應當逆轉這些序列中相對于野生型序列的突變，例如SEQ ID NO:44不應當在殘基V32或R126處突變。

本發(fā)明還提供了包含fHbp v3氨基酸序列的多肽，其中所述v3氨基酸序列與v3野生型氨基酸序列是相同的，除了對應于SEQ ID NO:17的Leu-126的氨基酸位置處的突變，條件是所述突變不是取代為丙氨酸(例如，其中所述突變是取代為精氨酸)。例如，所述多肽可以包含SEQ ID NO:17，但具有L126處的突變(除了L126A以外)。

多肽

可通過各種方式，例如通過化學合成(至少部分)，通過使用蛋白酶消化較長多肽，通過從RNA翻譯，通過從細胞培養(yǎng)物(例如從重組表達或從腦膜炎奈瑟氏菌培養(yǎng)物)純化等制備本發(fā)明的多肽。大腸桿菌宿主中的異源表達是優(yōu)選的表達途徑。

本發(fā)明的多肽理想地為至少100個氨基酸長，例如150aa、175aa、200aa、225aa或更長。它們包括突變體fHbp v2和/或v3氨基酸序列，并且突變體fHbp v2或v3氨基酸序列應當類似地為至少100個氨基酸長，例如150aa、175aa、200aa、225aa或更長。

fHbp是腦膜炎奈瑟氏菌的天然脂蛋白。也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其當在大腸桿菌中具有其天然前導序列或具有異源前導序列表達時被脂化。本發(fā)明的多肽可具有可被脂化的N-末端半胱氨酸殘基，例如，包含棕櫚?；鶊F，通常形成三棕櫚酰-S-甘油-半胱氨酸。在其它實施方案中，所述多肽不被脂化。

優(yōu)選制備實質(zhì)上純或實質(zhì)上分離的形式的多肽(即實質(zhì)上不含其它奈瑟氏菌或宿主細胞多肽)。通常，在非天然存在的環(huán)境中提供所述多肽，例如，將其與其天然存在的環(huán)境分離。在某些實施方案中，與起始材料相比，所述多肽存在于富含所述多肽的組合物中。因此提供純化的多肽，其中純化意指所述多肽存在于實質(zhì)上不含其它表達多肽的組合物中， 其中實質(zhì)上不含意指所述組合物的總多肽中的超過50% (例如>75%、>80%、>90%、>95%或>99%)為本發(fā)明的多肽。

多肽可以采用各種形式(例如，天然的，融合體，糖基化的，非糖基化的，脂化的，二硫橋等)。

SEQ ID NO 4、5、17和40不包括N-末端甲硫氨酸。如果通過在生物宿主中翻譯來產(chǎn)生本發(fā)明的多肽，則需要起始密碼子，其在大多數(shù)宿主中將提供N-末端甲硫氨酸。因此，本發(fā)明的多肽將至少在新生階段包括位于所述SEQ ID NO序列上游的甲硫氨酸殘基。

新生序列的切割意味著，突變體fHbp v2或v3氨基酸序列可能本身提供多肽的N-末端。然而，在其它實施方案中，本發(fā)明的多肽可以包括突變體fHbp v2或v3氨基酸序列的上游的N-末端序列。在一些實施方案中，所述多肽在N-末端具有單個甲硫氨酸，隨后緊接著突變體fHbp v2或v3氨基酸序列；在其它實施方案中，可以使用更長的上游序列。這樣的上游序列可以較短(例如，40個或更少氨基酸，即39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1個氨基酸)。實例包括指導蛋白運輸?shù)那皩蛄?，或有利于克隆或純化的短肽序?例如組氨酸標簽，即His_n，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更多)。其它合適的N-末端氨基酸序列是本領域技術人員將顯而易見的，例如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3中存在的天然上游序列。

本發(fā)明的多肽也可以包括突變體fHbp v2或v3氨基酸序列的最后氨基酸下游的氨基酸。這樣的C-末端延伸可以較短(例如，40個或更少氨基酸，即39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1個氨基酸)。實例包括指導蛋白運輸?shù)那皩蛄?，有利于克隆或純化的短肽序?例如包含組氨酸標簽，即His_n，其中n＝3、4、5、6、7、8、9、10或更多)，或增強多肽穩(wěn)定性的序列。其它合適的C-末端氨基酸序列是本領域技術人員將顯而易見的。

在一些實施方案中，本發(fā)明排除包括組氨酸標簽(參見參考文獻24和25)和在C-末端包括六組氨酸標簽的多肽。

術語“多肽”是指任何長度的氨基酸聚合物。所述聚合物可以是線性或支鏈聚合物，其可以包含修飾的氨基酸，并且其可以被非氨基酸中斷。該術語也涵蓋天然或通過干預修飾的氨基酸聚合物；所述干預例如，二硫鍵形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作或修飾，諸如與標記組分綴合。該定義還包括，例如，含有氨基酸的一個或多個類似物(包括例如，非天然氨基酸等)以及本領域已知的其它修飾的多肽。多肽可以作為單鏈或締合鏈（associated chain）存在。

可以將本發(fā)明的多肽附接或固定至固體支持物。

本發(fā)明的多肽可以包含可檢測標記，例如，放射性標記、熒光標記或生物素標記。這在免疫測定技術中是特別有用的。

如參考文獻164中所公開，fHbp可以被分割為三個結構域，稱為A、B和C。以SEQ ID NO:1為例，所述三個結構域為(A) 1-119，(B) 120-183和(C) 184-274：

MNRTAFCCLSLTTALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEVKTVNGIRHIGLAAKQ

結構域“A”的成熟形式，從其N-末端的Cys-20至Lys-119，稱為“A_成熟”。

多個fHbp序列是已知的，并且這些可以容易地用標準方法進行比對。通過這樣的比對，技術人員可以(a)通過與MC58序列中的坐標比較來鑒定任何給定fHbp序列中的結構域“A”(和A_成熟)、“B”和“C”，和(b)鑒定多個fHbp序列中的單個殘基，例如，用于鑒定取代。然而，為了便于參考，結構域定義如下：

- 給定fHbp序列中的結構域“A”是當使用逐對比對算法與SEQ ID NO:1比對時，以與SEQ ID NO:1的Met-1比對的氨基酸開始且以與SEQ ID NO:1的Lys-119比對的氨基酸結束的該序列的片段。

- 給定fHbp序列中的結構域“A_成熟”是當使用逐對比對算法與SEQ ID NO:1比對時，以與SEQ ID NO:1的Cys-20比對的氨基酸開始且以與SEQ ID NO:1的Lys-119比對的氨基酸結束的該序列的片段。

- 給定fHbp序列中的結構域“B”是當使用逐對比對算法與SEQ ID NO:1比對時，以與SEQ ID NO:1的Gln-120比對的氨基酸開始且以與SEQ ID NO:1的Gly-183比對的氨基酸結束的該序列的片段。

- 給定fHbp序列中的結構域“C”是當使用逐對比對算法與SEQ ID NO:1比對時，以與SEQ ID NO:1的Lys-184比對的氨基酸開始且以與SEQ ID NO:1的Gln-274比對的氨基酸結束的該序列的片段。

用于定義所述結構域的優(yōu)選逐對比對算法是Needleman-Wunsch全局比對算法[158]，其使用默認參數(shù)(例如，缺口開放罰分＝10.0，缺口延伸罰分＝0.5，使用EBLOSUM62評分矩陣)。在EMBOSS軟件包中的needle工具方便地進行該算法[159]。

在一些實施方案中，將本發(fā)明的突變體fHbp v2或v3氨基酸序列截短以去除其結構域A。然而，通常，優(yōu)選的是，突變體fHbp v2或v3氨基酸序列應當包括N-末端β-桶和C-末端β-桶兩者。

在一些實施方案中，多肽包含如上所述的氨基酸序列，除了N-末端處的最多達10 個(即1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個)氨基酸和/或C-末端處的最多達10 個(即1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個)氨基酸缺失。

本發(fā)明的多肽通常由人工氨基酸序列(即任何天然存在的腦膜炎球菌中不存在的序列)組成。

對于因子H的親和力可以使用表面等離振子共振(例如，如參考文獻18和21-24關于固定的人fH所公開)進行定量評價。提供至少10倍、且理想地至少100倍的親和力減少(即，解離常數(shù)K_D的增加)的突變是優(yōu)選的(當在相同實驗條件下相對于相同、但沒有突變的多肽測量時)。

核酸

本發(fā)明提供了編碼上如上所定義的本發(fā)明的多肽的核酸。

可以許多方式從基因組或cDNA文庫等制備本發(fā)明的核酸，例如，通過完全或部分化學合成(例如，DNA的亞磷酰胺合成)，通過使用核酸酶(例如限制性酶)消化較長核酸，通過連接較短核酸或核苷酸(例如使用連接酶或聚合酶)。

本發(fā)明的核酸可以采用各種形式，例如，單鏈的、雙鏈的、載體、引物、探針的、標記的、未標記的等。

本發(fā)明的核酸優(yōu)選為分離的或實質(zhì)上分離的形式。

術語“核酸”包括DNA和RNA，還有其類似物，諸如含有修飾主鏈的類似物，還有肽核酸(PNA)等。

根據(jù)本發(fā)明的核酸可以進行標記，例如，用放射性或熒光標記進行標記。

本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的核苷酸序列的載體(諸如質(zhì)粒)(例如克隆或表達載體，諸如適合于核酸免疫的載體)和用這樣的載體轉化的宿主細胞。

殺細菌應答

本發(fā)明的優(yōu)選多肽可以引發(fā)針對腦膜炎球菌殺細菌的抗體應答?？梢栽谛∈笾蟹奖愕販y量殺細菌抗體應答，并且是疫苗效力的標準指標(例如，參見參考文獻37的尾注14；還有參考文獻38)。

本發(fā)明第一實施方案的多肽可優(yōu)選引發(fā)針對表達v2 fHbp序列的腦膜炎奈瑟氏菌菌株(例如以下菌株中的一種或多種)殺細菌的抗體應答：961-5945、2996、96217、312294、11327、a22、gb013 (=M01-240013)、e32、m1090、m4287、860800、599、95N477、90-18311、c11、m986、m2671、1000、m1096、m3279、bz232、dk353、m3697、ngh38和/或L93/4286。殺細菌應答例如可以針對var2菌株M2091 (ATCC 13091)進行評價。

本發(fā)明第一實施方案的優(yōu)選多肽可以在小鼠中引發(fā)抗體，其在血清殺細菌測定中針對菌株M2091是殺細菌的。

本發(fā)明第二實施方案的多肽可優(yōu)選引發(fā)針對表達v3 fHbp序列的腦膜炎奈瑟氏菌菌株(例如菌株M1239、16889、gb355 (=M01-240355)、m3369、m3813、ngp165中的一種或多種)殺細菌的抗體應答。殺細菌應答可以例如針對已經(jīng)完全測序(參見EMBL ID CP002422 [40])的var3菌株M01-240355(其為奈瑟氏菌MLST參考菌株(參考文獻39中的id 19265))進行評價。

本發(fā)明第二實施方案的優(yōu)選多肽可以在小鼠中引發(fā)抗體，其在血清殺細菌測定中針對菌株M01-240355是殺細菌的。

例如，包含這些多肽的免疫原性組合物可以提供>1:4的血清殺細菌滴度(其使用人補體的Goldschneider測定[41-43])，和/或提供>1:128的血清殺細菌滴度(其使用幼兔補體)。

免疫

本發(fā)明的多肽可用作免疫原性組合物的活性成分，所以本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的多肽的免疫原性組合物。

本發(fā)明還提供在哺乳動物中產(chǎn)生抗體應答的方法，其包括向哺乳動物施用本發(fā)明的免疫原性組合物。所述抗體應答優(yōu)選為保護性和/或殺細菌抗體應答。本發(fā)明還提供了本發(fā)明的多肽，其用于這樣的方法中。

本發(fā)明還提供了用于保護哺乳動物免于奈瑟氏菌(例如腦膜炎球菌)感染的方法，其包括向哺乳動物施用本發(fā)明的免疫原性組合物。

本發(fā)明提供了本發(fā)明的多肽，其用于用作藥物(例如，免疫原性組合物或疫苗)或作為診斷試劑。其還提供了本發(fā)明的核酸或多肽在制備用于預防哺乳動物中的奈瑟氏菌(例如腦膜炎球菌)感染的藥物中的用途。

哺乳動物優(yōu)選是人。所述人可以是成人或優(yōu)選為兒童。當所述疫苗用于預防性用途時，所述人優(yōu)選是兒童(例如幼童或嬰兒)；當疫苗用于治療用途時，所述人優(yōu)選是成人。意圖用于兒童的疫苗也可施用于成人，例如，以評估安全性、劑量、免疫原性等。

所述用途和方法特別可用于預防/治療疾病，包括但不限于腦膜炎(特別是細菌性腦膜炎，諸如腦膜炎球菌性腦膜炎)和菌血癥。例如，它們適合于針對由腦膜炎奈瑟氏菌(例如血清群B中)引起的侵襲性腦膜炎球菌疾病主動免疫個體。

治療性治療的效力可以通過在施用本發(fā)明的組合物之后監(jiān)測奈瑟氏菌感染來測試。預防性治療的效力可以通過在施用所述組合物之后監(jiān)測針對fHbp的免疫應答來測試。本發(fā)明的組合物的免疫原性可通過向測試受試者(例如， 12-16月齡的兒童，或動物模型)施用它們，然后確定標準參數(shù)，包括血清殺細菌抗體(SBA)和ELISA滴度(GMT)來確定。通常在施用所述組合物之后約4 周確定這些免疫應答，并與施用所述組合物之前測定的值進行比較。至少4倍或8倍的 SBA增加是優(yōu)選的。當施用多于一個劑量的組合物時，可以進行多于一次施用后確定。

本發(fā)明的優(yōu)選組合物可以在患者中賦予抗體滴度，所述抗體滴度優(yōu)于各抗原組分對于可接受百分比的人受試者的血清保護的標準。具有高于其中宿主被認為針對抗原血清轉化的抗體滴度的相關抗體滴度的抗原是眾所周知的并且，這樣的滴度由組織諸如WHO公布。優(yōu)選多于80%的統(tǒng)計學顯著的受試者的樣品發(fā)生血清轉化，更優(yōu)選多于90%，仍更優(yōu)選多于93%，最優(yōu)選96-100%。

本發(fā)明的組合物將通常直接施用于患者。直接遞送可通過腸胃外注射(例如皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或至組織間隙)，或通過直腸、經(jīng)口、陰道、局部、透皮、鼻內(nèi)、眼、耳、肺或其它粘膜施用完成。優(yōu)選在大腿或上臂進行肌內(nèi)施用。注射可以經(jīng)由針頭(例如皮下針頭)進行，但或者可以使用無針注射。肌內(nèi)劑量通常為約0.5 ml。

本發(fā)明可用于引發(fā)全身和/或粘膜免疫。

劑量治療可以是單劑量時間表或多劑量時間表。多劑量可用于初次免疫時間表和/或加強免疫時間表。初次劑量時間表之后可以是加強劑量時間表?？梢猿Ｒ?guī)確定引發(fā)劑量之間(例如4-16周)和引發(fā)和加強劑量之間的合適時機。

本發(fā)明的免疫原性組合物將通常包括藥學上可接受的載體，其可以是本身不誘導產(chǎn)生對接受所述組合物的患者有害的抗體的任何物質(zhì)，且可以在無不當毒性的情況下施用。藥學上可接受的載體可包括液體，諸如水、鹽水、甘油和乙醇。輔助物質(zhì)，諸如濕潤劑或乳化劑、pH緩沖物質(zhì)等也可存在于這樣的載體中。合適運體的充分討論可見參考文獻44。

奈瑟氏菌感染機體的各個區(qū)域，所以可將本發(fā)明的組合物以各種形式制備。例如，可將所述組合物制備為可注射劑，作為液體溶液或懸浮液。也可制備適合在注射前溶解或懸浮于液體媒介物中的固體形式?？蓪⑺鼋M合物制備用于外用施用，例如，油膏、乳膏或粉末?？蓪⑺鼋M合物制備用于口服施用，例如，作為片劑或膠囊，或作為糖漿(任選調(diào)味的)?？蓪⑺鼋M合物制備為使用細粉或噴霧進行肺部施用，例如作為吸入劑?？蓪⑺鼋M合物制備為栓劑或陰道栓?？蓪⑺鼋M合物制備用于鼻腔、耳部或眼部施用，例如作為滴劑。適合于腸胃外注射的組合物是最優(yōu)選的。

所述組合物優(yōu)選是無菌的。其優(yōu)選不含熱原。其優(yōu)選被緩沖的，例如在pH 6到pH 8之間，通常為約pH 7。當組合物包含氫氧化鋁鹽時，優(yōu)選使用組氨酸緩沖劑[45]。本發(fā)明的組合物相對于人可以是等張的。

免疫原性組合物包含免疫有效量的免疫原，以及需要的任何其它的其它指定組分。“免疫有效量”意指以單一劑量或作為一系列劑量的部分向個體施用該量對于治療或預防是有效的。術語“預防”意味著減少和/或消除疾病的進展，或消除疾病的發(fā)作。例如，可以引發(fā)(例如，通過接種疫苗)受試者的免疫系統(tǒng)以觸發(fā)免疫應答和排斥感染，使得消除疾病的發(fā)作。因此，接種疫苗的受試者可以被感染，但能夠比對照受試者更好地排斥感染。該量取決于待治療個體的健康和身體狀況、待治療個體的年齡、分類組(例如非人靈長類動物、靈長類動物等)、個體的免疫系統(tǒng)合成抗體的能力、期望的保護程度、疫苗制劑、治療醫(yī)生對醫(yī)學情況的評估和其它相關因素而不同。預期所述量將落入可通過常規(guī)試驗確定的相對寬范圍內(nèi)。劑量治療可以是單劑量時間表或多劑量時間表(例如，包括加強劑量)。所述組合物可與其它免疫調(diào)節(jié)劑結合施用。

本發(fā)明的組合物中可以使用的佐劑包括但不限于不溶性金屬鹽，水包油乳劑(例如MF59或AS03，兩者均含有角鯊烯)，皂苷，LPS的無毒衍生物(諸如單磷酰脂質(zhì)A或3-O-脫?；疢PL)，免疫刺激性寡核苷酸，脫毒的細菌ADP-核糖基化毒素，微粒，脂質(zhì)體，咪唑并喹諾酮類，或其混合物。充當免疫刺激劑的其它物質(zhì)公開于參考文獻46的第7章。

使用氫氧化鋁和/或磷酸鋁佐劑是特別優(yōu)選的，并且多肽通常吸附至這些鹽。這些鹽包括氧基氫氧化物和羥基磷酸鹽(例如參見參考文獻46的第8和9章)。所述鹽可采取任何合適的形式(例如，凝膠、晶體、無定形等)。

其它抗原性組分

本發(fā)明的組合物包括突變體v2和/或v3 fHbp序列。所述組合物應當不包括抗原的復雜或未定義的混合物是有用的，例如，優(yōu)選組合物中不包括外膜囊泡。本發(fā)明的多肽優(yōu)選在異源宿主中重組表達，然后純化。

除了包括fHbp序列以外，本發(fā)明的組合物還可包括一種或多種其它奈瑟氏菌免疫原，因為靶向每種細菌多于一種免疫原的疫苗降低選擇逃逸突變體的可能性。因此，組合物可包括第二多肽，當施用于哺乳動物時，所述第二多肽引發(fā)針對腦膜炎球菌殺細菌的抗體應答。所述第二多肽可以是腦膜炎球菌 fHbp，但經(jīng)常不是fHbp，例如，其可以是例如NHBA序列、NadA序列等。

任何這樣的進一步奈瑟氏球菌免疫原可以作為本發(fā)明的突變體v2或v3 fHbp的單獨多肽呈現(xiàn)或可以作為與修飾fHbp的融合多肽呈現(xiàn)。例如，腦膜炎球菌936多肽和fHbp多肽的融合體是已知的[55,56]。包含SEQ ID NO:44和/或SEQ ID NO:45的融合蛋白是特別優(yōu)選的，任選其中SEQ ID NO:44和/或45如本文別處所述修飾最多達5個單個氨基酸變化(即，1、2、3、4或5個單個氨基酸取代、缺失和/或插入)。

本發(fā)明的組合物可以包括NHBA抗原。NHBA抗原作為基因NMB2132包括于腦膜炎球菌血清群B菌株MC58的公開基因組序列[47]中(GenBank登錄號GI：7227388；本文為SEQ ID NO:6)。從那時起已經(jīng)公開了來自許多菌株的NHBA抗原的序列。例如，NHBA的等位基因形式可見于參考文獻48的圖5和15中和參考文獻1的實施例13和圖21中(其中的SEQ ID 3179至3184)。也已經(jīng)報道了NHBA抗原的各種免疫原性片段。用于本發(fā)明使用的優(yōu)選的287抗原包含以下氨基酸序列：(a)與SEQ ID NO:6具有50％或更高同一性(例如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO:6的至少‘n’個連續(xù)氨基酸的片段，其中‘n’是7或更高(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高)。(b)的優(yōu)選片段包含來自SEQ ID NO:6的表位。在施用于受試者之后，本發(fā)明的最有用的NHBA抗原可以引發(fā)可以結合至由氨基酸序列SEQ ID NO:6組成的腦膜炎球菌多肽的抗體。在施用于受試者之后，用于本發(fā)明使用的有利的NHBA抗原可以引發(fā)殺細菌性抗腦膜炎球菌抗體。

本發(fā)明的組合物可以包括NadA抗原。NadA抗原作為基因NMB1994包括于腦膜炎球菌血清群B菌株MC58的公開基因組序列[47]中(GenBank登錄號GI：7227256；本文為SEQ ID NO:7)。從那時起已經(jīng)公開了來自許多菌株的NadA抗原的序列，并且已經(jīng)充分記錄了該蛋白作為奈瑟氏菌黏附素的活性。也已經(jīng)報道了NadA的各種免疫原性片段。用于本發(fā)明使用的優(yōu)選的NadA抗原包含以下氨基酸序列：(a)與SEQ ID NO:7具有50％或更高同一性(例如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO:7的至少‘n’個連續(xù)氨基酸的片段，其中‘n’是7或更高(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高)。(b)的優(yōu)選片段包含來自SEQ ID NO:7的表位。在施用于受試者之后，本發(fā)明的最有用的NadA抗原可以引發(fā)可以結合至由氨基酸序列SEQ ID NO:7組成的腦膜炎球菌多肽的抗體。在施用于受試者之后，用于本發(fā)明使用的有利的NadA抗原可以引發(fā)殺細菌性抗腦膜炎球菌抗體。SEQ ID NO:15是一種這樣的片段。

本發(fā)明的組合物可以包括NspA抗原。NspA抗原作為基因NMB0663包括于腦膜炎球菌血清群B菌株MC58的公開基因組序列[47]中(GenBank登錄號GI：7225888；本文為SEQ ID NO:8)。該抗原先前從參考文獻49和50已知。從那時起已經(jīng)公開了來自許多菌株的NspA抗原的序列。也已經(jīng)報道了NspA的各種免疫原性片段。用于本發(fā)明使用的優(yōu)選的NspA抗原包含以下氨基酸序列：(a)與SEQ ID NO:8具有50％或更高同一性(例如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO:8的至少‘n’個連續(xù)氨基酸的片段，其中‘n’是7或更高(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高)。(b)的優(yōu)選片段包含來自SEQ ID NO:8的表位。在施用于受試者之后，本發(fā)明的最有用的NspA抗原可以引發(fā)可以結合至由氨基酸序列SEQ ID NO:8組成的腦膜炎球菌多肽的抗體。在施用于受試者之后，用于本發(fā)明使用的有利的NspA抗原可以引發(fā)殺細菌性抗腦膜炎球菌抗體。

本發(fā)明的組合物可以包括腦膜炎球菌HmbR抗原。全長HmbR序列作為基因NMB1668包括于腦膜炎球菌血清群B菌株MC58的公開基因組序列[47]中(本文為SEQ ID NO:9)。本發(fā)明可以使用包含全長HmbR序列的多肽，但其將經(jīng)常使用包含部分HmbR序列的多肽。因此，在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明使用的HmbR序列可以包含與SEQ ID NO:9具有至少i%序列同一性的氨基酸序列，其中i的值為50、60、70、80、90、95、99或更高。在其它實施方案中，根據(jù)本發(fā)明使用的HmbR序列可以包含來自SEQ ID NO:9的至少i個連續(xù)氨基酸的片段，其中j的值是7、8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高。在其它實施方案中，根據(jù)本發(fā)明使用的HmbR序列可以包含(i)與SEQ ID NO:9具有至少i%序列同一性的氨基酸序列和/或(ii)包含來自SEQ ID NO:9的至少j個連續(xù)氨基酸的片段的氨基酸序列。j個氨基酸的優(yōu)選片段包含來自SEQ ID NO:9的表位。這樣的表位將通常包含位于HmbR的表面上的氨基酸。有用的表位包括具有參與HmbR與血紅蛋白的結合的氨基酸的那些，因為結合至這些表位的抗體可以阻斷細菌結合至宿主血紅蛋白的能力。參考文獻51中研究了HmbR的拓撲學及其關鍵功能殘基。在施用于受試者之后，本發(fā)明的最有用的HmbR抗原可以引發(fā)可以結合至由氨基酸序列SEQ ID NO:9組成的腦膜炎球菌多肽的抗體。在施用于受試者之后，用于本發(fā)明使用的有利的HmbR抗原可以引發(fā)殺細菌性抗腦膜炎球菌抗體。

本發(fā)明的組合物可以包括NhhA抗原。NhhA抗原作為基因NMB0992包括于腦膜炎球菌血清群B菌株MC58的公開基因組序列[47]中(GenBank登錄號GI：7226232；本文為SEQ ID NO:10)。從那時起已經(jīng)公開了來自許多菌株的NhhA抗原的序列，例如參考文獻48和52，并且已經(jīng)報道了NhhA的各種免疫原性片段。其也被稱為Hsf。用于本發(fā)明使用的優(yōu)選的NhhA抗原包含以下氨基酸序列：(a)與SEQ ID NO:10具有50％或更高同一性(例如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO:10的至少‘n’個連續(xù)氨基酸的片段，其中‘n’是7或更高(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高)。(b)的優(yōu)選片段包含來自SEQ ID NO:10的表位。在施用于受試者之后，本發(fā)明的最有用的NhhA抗原可以引發(fā)可以結合至由氨基酸序列SEQ ID NO:10組成的腦膜炎球菌多肽的抗體。在施用于受試者之后，用于本發(fā)明使用的有利的NhhA抗原可以引發(fā)殺細菌性抗腦膜炎球菌抗體。

本發(fā)明的組合物可以包括App抗原。App抗原作為基因NMB1985包括于腦膜炎球菌血清群B菌株MC58的公開基因組序列[47]中(GenBank登錄號GI：7227246；本文為SEQ ID NO:11)。從那時起已經(jīng)公開了來自許多菌株的App抗原的序列。也已經(jīng)報道了App的各種免疫原性片段。用于本發(fā)明使用的優(yōu)選的App抗原包含以下氨基酸序列：(a)與SEQ ID NO:11具有50％或更高同一性(例如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO:11的至少‘n’個連續(xù)氨基酸的片段，其中‘n’是7或更高(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高)。(b)的優(yōu)選片段包含來自SEQ ID NO:11的表位。在施用于受試者之后，本發(fā)明的最有用的App抗原可以引發(fā)可以結合至由氨基酸序列SEQ ID NO:11組成的腦膜炎球菌多肽的抗體。在施用于受試者之后，用于本發(fā)明使用的有利的App抗原可以引發(fā)殺細菌性抗腦膜炎球菌抗體。

本發(fā)明的組合物可以包括Omp85抗原。Omp85抗原作為基因NMB0182包括于腦膜炎球菌血清群B菌株MC58的公開基因組序列[47]中(GenBank登錄號GI：7225401；本文為SEQ ID NO:12)。從那時起已經(jīng)公開了來自許多菌株的Omp85抗原的序列。關于Omp85的進一步信息公開于參考文獻53和54。也已經(jīng)報道了Omp85的各種免疫原性片段。用于本發(fā)明使用的優(yōu)選的Omp85抗原包含以下氨基酸序列：(a)與SEQ ID NO:12具有50％或更高同一性(例如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO:12的至少‘n’個連續(xù)氨基酸的片段，其中‘n’是7或更高(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高)。(b)的優(yōu)選片段包含來自SEQ ID NO:12的表位。在施用于受試者之后，本發(fā)明的最有用的Omp85抗原可以引發(fā)可以結合至由氨基酸序列SEQ ID NO:12組成的腦膜炎球菌多肽的抗體。在施用于受試者之后，用于本發(fā)明使用的有利的Omp85抗原可以引發(fā)殺細菌性抗腦膜炎球菌抗體。

本發(fā)明的組合物可以包括936抗原。936抗原作為基因NMB2091包括于腦膜炎球菌血清群B菌株MC58的公開基因組序列[47]中(本文為SEQ ID NO:13)。用于本發(fā)明使用的優(yōu)選的936抗原包含以下氨基酸序列：(a)與SEQ ID NO:13具有50％或更高同一性(例如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO:13的至少‘n’個連續(xù)氨基酸的片段，其中‘n’是7或更高(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高)。(b)的優(yōu)選片段包含來自SEQ ID NO:13的表位。在施用于受試者之后，本發(fā)明的最有用的936抗原可以引發(fā)可以結合至由氨基酸序列SEQ ID NO:13組成的腦膜炎球菌多肽的抗體。936抗原是fHbp的良好融合伴侶(例如，參見參考文獻55和56)。

組合物可以包含：包含SEQ ID NO:14的多肽；包含SEQ ID NO:15的多肽；和本發(fā)明的包含突變體fHbp v2氨基酸序列和SEQ ID NO:13的多肽(參見參考文獻55和56)。

組合物可以包含：包含SEQ ID NO:14的多肽；包含SEQ ID NO:15的多肽；和本發(fā)明的包含突變體fHbp v3氨基酸序列和SEQ ID NO:13的多肽(參見參考文獻55和56)。

在一些實施方案中，將本發(fā)明的多肽與進一步腦膜炎球菌fHbp序列組合。具體而言，可以將v2多肽與v1和/或v3多肽組合以增加菌株覆蓋譜[162]。因此，組合物可以包含：(i)本發(fā)明的包含突變體fHbp v2氨基酸序列的多肽；和(ii)v1 fHbp多肽和/或v3 fHbp多肽。在其它實施方案中，本發(fā)明的多肽可以包含：(i)突變體fHbp v2氨基酸序列和(ii) v1 fHbp氨基酸序列和/或v3 fHbp氨基酸序列。因此，可以將v1和/或v3序列與突變體v2序列作為分開實體組合于組合物中，或融合多肽內(nèi)。

類似地，可以將v3多肽與v1和/或v2多肽組合以增加菌株覆蓋譜[162]。因此，組合物可以包含：(i)本發(fā)明的包含突變體fHbp v3氨基酸序列的多肽；和(ii)v1 fHbp多肽和/或v2 fHbp多肽。在其它實施方案中，本發(fā)明的多肽可以包含：(i)突變體fHbp v3氨基酸序列和(ii) v1 fHbp氨基酸序列和/或v2 fHbp氨基酸序列。因此，可以將v1和/或v2序列與突變體v3序列作為分開實體組合于組合物中，或融合多肽內(nèi)。

而且，可以將突變體v2和v3多肽與彼此組合以增加菌株覆蓋譜。因此，組合物可以包含：(i)本發(fā)明的包含突變體fHbp v2氨基酸序列的多肽；(ii)本發(fā)明的包含突變體fHbp v3氨基酸序列的多肽；和(iii) fHbp v1多肽。在其它實施方案中，本發(fā)明的多肽可以包含：(i)突變體fHbp v2氨基酸序列，(ii)突變體v3 fHbp氨基酸序列和(iii) fHbp v1氨基酸序列。因此，可以將突變體v2和v3序列與v1序列作為分開實體組合于組合物中，或融合多肽內(nèi)。v1序列可以是野生型序列或突變體序列。

v1 fHbp可以包含(a)與SEQ ID NO:16具有至少k%同一性的氨基酸序列，和/或(b)SEQ ID NO:16的片段。上面給出關于‘k’和片段的信息。該片段將通常包括來自SEQ ID NO:16的至少一個表位，且v1 fHbp多肽將包括本發(fā)明的v2或v3氨基酸序列中不存在的至少一個表位，使得由v1 fHbp引發(fā)的抗體可以識別v1菌株。理想地，v1 fHbp可以引發(fā)針對v1菌株、例如針對菌株MC58(可作為‘BAA-335’得自ATCC)殺細菌的抗體。v1 fHbp可以包括破壞其結合至fH的能力的氨基酸突變。

V2 fHbp可以包含(a)與SEQ ID NO:5具有至少k%同一性的氨基酸序列，和/或(b)SEQ ID NO:5的片段。上面給出關于‘k’和片段的信息。該片段將通常包括來自SEQ ID NO:5的至少一個表位，且v2 fHbp多肽將包括本發(fā)明的v3氨基酸序列中不存在的至少一個表位，使得由v2 fHbp引發(fā)的抗體可以識別v2菌株。理想地，v2 fHbp可以引發(fā)針對v2菌株、例如針對菌株M2091 (ATCC 13091)殺細菌的抗體。v2 fHbp可以是第一個實施方案的多肽。

v3 fHbp可以包含(a)與SEQ ID NO:17具有至少k%同一性的氨基酸序列，和/或(b)SEQ ID NO:17的片段。上面給出關于‘k’和片段的信息。該片段將通常包括來自SEQ ID NO:17的至少一個表位，且v3 fHbp多肽將包括本發(fā)明的v2氨基酸序列中不存在的至少一個表位，使得由v3 fHbp引發(fā)的抗體可以識別v3菌株。理想地，v3 fHbp可以引發(fā)針對v3菌株、例如針對菌株M01-240355殺細菌的抗體。v3 fHbp可以是第二個實施方案的多肽。

因此，例如，本發(fā)明提供了多肽，其在單一多肽鏈內(nèi)包含以下中的每一種：(i) fHbp v1氨基酸序列；(ii)突變體fHbp v2氨基酸序列；和(iii)突變體fHbp v3氨基酸序列。施用于宿主動物之后，所述多肽可以引發(fā)結合至以下每一種的抗體：由SEQ ID NO:46的氨基酸序列組成的腦膜炎球菌fHbp多肽；由SEQ ID NO:4的氨基酸序列組成的腦膜炎球菌fHbp多肽；和由SEQ ID NO:40的氨基酸序列組成的腦膜炎球菌fHbp多肽。(i)的序列可以包含與SEQ ID NO:16具有至少k%同一性的氨基酸序列。(ii)的序列可以包含與SEQ ID NO:5具有至少k%同一性的氨基酸序列，但在以下殘基中的一個或多個處不同于SEQ ID NO:5：S32、V33、L39、L41、F69、V100、I113、F122、L123、V124、S125、G126、L127、G128、S151、H239和/或E240。(iii)的序列可以包含與SEQ ID NO:17具有至少k%同一性的氨基酸序列，但在以下殘基中的一個或多個處不同于SEQ ID NO:17：S32、I33、L39、L41、F72、V103、T116、F125、L126、V127、S128、G129、L130、G131、S154、H242和/或E243。在一個優(yōu)選的實施方案中，(i)的序列包含SEQ ID NO:16，其任選地通過最多達5個單一氨基酸變化(即1、2、3、4或5個單一氨基酸取代、缺失和/或插入)進行修飾；(ii)的序列包含SEQ ID NO:45，其任選地通過最多達5個單一氨基酸變化(即1、2、3、4或5個單一氨基酸取代、缺失和/或插入)進行修飾，條件是這樣的氨基酸變化不逆轉這些序列中相對于野生型序列的突變；且(iii)的序列包含SEQ ID NO:44，其任選地通過最多達5個單一氨基酸變化(即1、2、3、4或5個單一氨基酸取代、缺失和/或插入，例如以得到SEQ ID NO:53)進行修飾，條件是這樣的氨基酸變化不逆轉這些序列中相對于野生型序列的突變。氨基酸序列(i)、(ii)和(iii)可以在多肽中以N-至C-末端的任何順序排列，而優(yōu)選為順序(ii)、然后(iii)、然后(i)。例如，本發(fā)明提供了式–A-B-C–的多肽，其中：A包含SEQ ID NO:45，其任選地通過最多達3個單一氨基酸取代進行修飾；B包含SEQ ID NO:44，其任選地通過最多達3個單一氨基酸取代進行修飾；且C包含SEQ ID NO:16，其任選地通過最多達3個單一氨基酸取代(例如，破壞與fH的結合的取代)進行修飾。優(yōu)選的C包含SEQ ID NO:49，其中殘基Arg-34被突變?yōu)镾er，如對于參考文獻21中的‘R41S’突變所報道。

特別優(yōu)選的多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:47。該序列從N-末端至C-末端包括：突變體v2 (SEQ ID NO:45)；突變體v3 (SEQ ID NO:44)；和突變體v1 (SEQ ID NO:49)。在這三種突變體fHbp序列之間，在每種情況下都存在接頭序列，SEQ ID NO:50。在一個實施方案中，所述多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:48，其具有N-末端甲硫氨酸，然后SEQ ID NO:37，然后SEQ ID NO:47。

SEQ ID NO:47(單獨，或在SEQ ID NO:48內(nèi))可以任選地通過最多達5個單一氨基酸變化(即1、2、3、4或5個單一氨基酸取代、缺失和/或插入)進行修飾，條件是這樣的氨基酸變化不逆轉v1、v2和v3序列中相對于野生型序列的突變，即SEQ ID NO:47的氨基酸V32、R123、V285、R379和S543不應當被突變?yōu)镾32、L123、S285、L379和R543。然而，在一個例外實施方案中，V285可以回復至S285和/或V32可以回復至S32。

突變體融合體可以理想地引發(fā)結合至以下中每一種的抗體：由氨基酸序列SEQ ID NO:46組成的野生型v1腦膜炎球菌fHbp多肽；由氨基酸序列SEQ ID NO:4組成的野生型v2腦膜炎球菌fHbp多肽；和由氨基酸序列SEQ ID NO:40組成的野生型v3腦膜炎球菌fHbp多肽。

除了奈瑟氏菌多肽抗原以外，所述組合物可包括用于針對其它疾病或感染免疫的抗原。例如，所述組合物可包括以下其它抗原中的一種或多種：

- 來自腦膜炎奈瑟氏菌血清群A、C、W135和/或Y的糖抗原，諸如參考文獻57中公開的來自血清群C的糖(還參見參考文獻58)或參考文獻59中的糖。

- 來自肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)的糖抗原[例如，60，61，62]。

- 來自甲型肝炎病毒，諸如滅活病毒的抗原[例如，63，64]。

- 來自乙型肝炎病毒的抗原，諸如表面和/或核心抗原[例如，64，65]。

- 白喉抗原，諸如白喉類毒素[例如參考文獻66的第3章]，例如CRM₁₉₇突變體[例如，67]。

- 破傷風抗原，諸如破傷風類毒素(例如參考文獻66的第4章)。

- 來自百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)的抗原，諸如來自百日咳博德特氏菌的百日咳全毒素(PT)和絲狀血凝素(FHA)，也可任選與百日咳桿菌粘附素(pertactin)和/或凝集原2和3組合(例如參考文獻68和69)。

- 來自流感嗜血桿菌B（Haemophilus influenzae B）的糖抗原[例如58]。

- 脊髓灰質(zhì)炎抗原[例如，70，71]，諸如IPV。

- 麻疹、腮腺炎和/或風疹抗原(例如參考文獻66的第9、10和11章)。

- 流感抗原(例如參考文獻66的第19章]，諸如血細胞凝集素和/或神經(jīng)氨酸酶表面蛋白。

- 來自卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)的抗原[例如72]。

- 來自無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)(B群鏈球菌)的蛋白抗原[例如73，74]。

- 來自無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)(B群鏈球菌)的糖抗原。

- 來自釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)(A群鏈球菌)的抗原[例如74，75，76]。

- 來自金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的抗原[例如77]。

所述組合物可以包含這些其它抗原中的一種或多種。

必要時，可使毒性蛋白抗原脫毒(例如通過化學和/或遺傳方式使百日咳毒素脫毒[69])。

當所述組合物中包括白喉抗原時，優(yōu)選還包括破傷風抗原和百日咳抗原。類似地，當包括破傷風抗原時，優(yōu)選還包括白喉和百日咳抗原。類似地，當包括百日咳抗原時，優(yōu)選還包括白喉和破傷風抗原。DTP組合因此是優(yōu)選的。

糖抗原優(yōu)選為綴合物的形式。下文更詳細討論綴合物的載體蛋白。

組合物中的抗原通常各以至少1μg/ml的濃度存在。通常，任何給定抗原的濃度將足以引發(fā)針對該抗原的免疫應答。

本發(fā)明的免疫原性組合物可以治療性地(即，治療已有感染)或預防性地(即，預防將來的感染)使用。

作為本發(fā)明的免疫原性組合物中使用蛋白抗原的替代方案，可使用編碼該抗原的核酸(其可以是RNA，諸如自復制RNA，或DNA，諸如質(zhì)粒)。

在一些實施方案中，除了fHbp序列以外，本發(fā)明的組合物還包含腦膜炎球菌血清群A、C、W135和Y中的1、2、3或4種的綴合的莢膜糖抗原。在其它實施方案中，除了fHbp序列以外，本發(fā)明的組合物還包含至少一種綴合的肺炎球菌莢膜糖抗原。

腦膜炎球菌血清群Y、W135、C和A

目前的血清群C疫苗(Menjugate? [57，78]，Meningitec?和NeisVac-C?)包括綴合的糖。Menjugate?和Meningitec?具有與CRM₁₉₇載體綴合的寡糖抗原，而NeisVac-C?使用與破傷風類毒素載體綴合的完整多糖(脫-O-乙?；?。Menactra?疫苗含有血清群Y、W135、C和A各自的綴合的莢膜糖抗原。

本發(fā)明的組合物可包括腦膜炎球菌血清群Y、W135、C和A中的一種或多種的莢膜糖抗原，其中所述抗原與載體蛋白綴合和/或是寡糖。例如，所述組合物可包括來自 血清群C；血清群A和C；血清群A、C和W135；血清群A、C和Y；血清群C、W135和Y；或來自血清群A、C、W135和 Y中的所有四種的莢膜糖抗原。

每劑量各腦膜炎球菌糖抗原的典型量為1μg至20μg，例如，約1μg、 約2.5μg、約4μg、約5μg或約10μg(表示為糖)。

當混合物包含來自血清群A和C的莢膜糖時，MenA糖∶MenC糖的比率(w/w)可以為大于1(例如，2:1、3:1、4:1、5:1、10:1或更高)。在混合物包含來自血清群Y和血清群C和W135之一或兩者的莢膜糖時，MenY 糖:MenW135糖的比率(w/w)可以大于1(例如，2:1、3:1、4:1、5:1、10:1或更高)，和/或MenY糖:MenC糖的比率(w/w)可以小于1(例如，1:2、1:3、1:4、1:5或更低)。來自血清群A:C:W135:Y的糖的優(yōu)選比率(w/w)為：1:1:1:1；1:1:1:2；2:1:1:1；4:2:1:1；8:4:2:1；4:2:1:2；8:4:1:2；4:2:2:1；2:2:1:1；4:4:2:1；2:2:1:2；4:4:1:2；和2:2:2:1。來自血清群C:W135:Y的糖的優(yōu)選比率(w/w)為：1:1:1；1:1:2；1:1:1；2:1:1；4:2:1；2:1:2；4:1:2；2:2:1；和2:1:1。優(yōu)選使用實質(zhì)上相等質(zhì)量的各種糖。

可以使用寡糖形式的莢膜糖。這些通過以下方便地形成：對純化的莢膜多糖進行片段化(例如通過水解)，隨后通常純化期望大小的片段。

優(yōu)選進行多糖的片段化，以使寡糖的最終平均聚合度(DP)小于30(例如，對于血清群A，10至20，優(yōu)選約10；對于血清群W135和Y，15至25，優(yōu)選約 15-20；對于血清群C，12至22；等)。DP可通過離子交換層析或通過比色測定方便地測量[79]。

如果進行水解，則通常對水解產(chǎn)物進行篩分，以去除短長度寡糖[58]。這可以各種方式諸如超濾和隨后離子交換層析實現(xiàn)。對于血清群A，優(yōu)選去除聚合度小于或等于約6的寡糖；對于血清群W135和Y，優(yōu)選去除聚合度小于約4的寡糖。

參考文獻78中公開了優(yōu)選的MenC糖抗原，如Menjugate?中所使用。

所述糖抗原可以進行化學修飾。這對于降低血清群A的水解是特別有用的[80]。可以進行腦膜炎球菌糖的脫-O-乙?；τ诠烟?，修飾可發(fā)生在解聚之前或之后。

當本發(fā)明的組合物包括MenA糖抗原時，所述抗原優(yōu)選為修飾糖，其中天然糖上的一個或多個羥基被封閉基團所替代[80]。該修飾改善對水解的耐受性。

共價綴合

本發(fā)明的組合物中的莢膜糖通常與載體蛋白綴合。通常，綴合增強糖的免疫原性，因為所述綴合可將糖從T-非依賴性抗原轉化為T-依賴性抗原，因此引發(fā)免疫記憶。綴合對于兒科疫苗是特別有用的，并且是眾所周知的技術。

典型的載體蛋白是細菌毒素，諸如白喉或破傷風毒素或類毒素或其突變體。CRM₁₉₇白喉毒素突變體[81]是有用的，并且是PREVNAR?產(chǎn)品中的載體。其他合適的載體蛋白包括腦膜炎奈瑟氏菌外膜蛋白復合物[82]、合成肽[83,84]、熱休克蛋白[85,86]、百日咳蛋白[87,88]、細胞因子[89]、淋巴因子[89]、激素[89]、生長因子[89]、包含多種來自各種病原體衍生抗原的人CD4⁺ T細胞表位的人工蛋白[90]諸如N19[91]、來自流感嗜血桿菌(H.influenzae)的蛋白D[92-94]、肺炎球菌溶血素[95]或其無毒衍生物[96]、肺炎球菌表面蛋白PspA[97]、攝鐵蛋白[98]、來自艱難梭狀芽胞桿菌(C.difficile)的毒素A或B[99]、重組銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)胞外蛋白 A(rEPA)[100]等。

可以使用任何合適的綴合反應，在必要時使用任何合適的接頭。

糖通常將在綴合前活化或官能化?；罨缮婕袄缜杌瘎T如CDAP(例如1-氰基-4-二甲基氨基四氟硼酸吡啶鎓[103、104等])。其它合適的技術使用碳二亞胺、酰肼、活性酯、降冰片烷、對硝基苯甲酸、N-羥基琥珀酰亞胺、S-NHS、EDC、TSTU等。

可使用任何已知程序，例如參考文獻103和104中描述的程序，經(jīng)由接頭基團進行連接。一種類型的連接涉及多糖的還原胺化，將所得氨基與己二酸接頭基團的一個末端綴合，然后將蛋白綴合至己二酸接頭基團的另一末端[105，106]。其它接頭包括B-丙酰胺基[107]、硝基苯基-乙胺[108]、鹵代酰基鹵化物[109]、糖苷鍵[110]、6-氨基己酸[111]、ADH[112]、C₄至C₁₂部分[113]等。作為使用接頭的替代方案，可使用直接連接。與蛋白的直接連接可包括氧化多肽，隨后與蛋白還原胺化，如例如參考文獻114和115中所述。

優(yōu)選涉及以下步驟的方法：將氨基引入糖中(例如用-NH₂替代末端=O基團)，隨后用己二酸二酯(例如己二酸N-羥基琥珀酰亞胺基二酯)衍生化，并且與載體蛋白反應。另一種優(yōu)選的反應使用CDAP活化蛋白D載體，例如MenA或MenC。

外膜囊泡

本發(fā)明的一些組合物不包括抗原的復雜或未定義的混合物，這是OMV的典型特征。然而，本發(fā)明可以與OMV結合使用，因為已發(fā)現(xiàn)fHbp增強其效力[4]，特別是通過在用于OMV制備的菌株中過表達本發(fā)明的多肽。還參見下文。

通常使用該方法來改善腦膜炎奈瑟氏菌血清群B微囊泡[116]、“天然 OMV”[117]、小泡和外膜囊泡[例如參考文獻118-123等]的制備。這些可以從已經(jīng)遺傳操作的細菌制備[124-127]，例如，以增加免疫原性(例如超表達免疫原)、降低毒性、抑制莢膜多糖合成、下調(diào)PorA表達等。它們可以從高發(fā)泡菌株制備[128-131]?？梢园▉碜苑侵虏⌒阅紊暇哪遗輀132]?？梢圆皇褂孟礈靹﹣碇苽銸MV[133，134]。它們可以在其表面表達非奈瑟氏菌蛋白[135]。它們可以是LPS耗竭的。它們可以與重組抗原混合[118，136]?？墒褂脕碜跃哂胁煌琁類外膜蛋白亞型的細菌的囊泡，例如，使用兩種不同的遺傳工程改造的囊泡群體(各自展示三種亞型)的六種不同亞型[137,138]，或使用三種不同的遺傳工程改造的囊泡群體(各自展示三種亞型)的九種不同亞型等。有用的亞型包括：P1.7,16；P1.5-1,2-2；P1.19,15-1；P1.5-2,10；P1.12-1,13；P1.7-2,4；P1.22,14；P1.7-1,1；P1.18-1,3,6。

宿主細胞

本發(fā)明提供了表達本發(fā)明的多肽的細菌。所述細菌可以是腦膜炎球菌或大腸桿菌（E.coli）。所述細菌可以組成型表達所述多肽，但是在一些實施方案中，表達可以在誘導型啟動子的控制下。所述細菌可以超表達所述多肽(參見參考文獻139)。所述多肽的表達理想地不是相可變的。

本發(fā)明還提供了從本發(fā)明的細菌(特別是從腦膜炎球菌)制備的外膜囊泡。其還提供了從本發(fā)明的細菌產(chǎn)生囊泡的方法。從這些菌株制備的囊泡優(yōu)選包含本發(fā)明的多肽，其在囊泡中應當為免疫可及的形式，即可以結合至本發(fā)明的純化多肽的抗體也應當能夠結合存在于囊泡中的多肽。

這些外膜囊泡包括通過破壞腦膜炎球菌外膜或使之發(fā)泡以由其形成包括外膜蛋白組分的囊泡而獲得的任何蛋白脂質(zhì)體囊泡。因此，該術語包括OMV(有時被稱為“小泡”)、微囊泡(MV[116])和“天然OMV”(“NOMV”[117])。

MV和NOMV是天然存在的膜囊泡，其在細菌生長時自發(fā)形成，且釋放至培養(yǎng)基中?？梢酝ㄟ^以下方法獲得MV：在肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)奈瑟氏菌，將全細胞與肉湯培養(yǎng)基中的較小MV分離(例如，通過過濾或通過低速離心以僅沉淀細胞而不沉淀較小囊泡)，然后從細胞耗竭的培養(yǎng)基收集MV(例如，通過過濾，通過差速沉淀或MV的聚集，通過高速離心以沉淀MV)。通?？筛鶕?jù)培養(yǎng)基中產(chǎn)生的MV的量來選擇用于產(chǎn)生MV的菌株，例如，參考文獻130和131描述了具有高MV產(chǎn)量的奈瑟氏菌。

OMV從細菌人工制備，并且可使用洗滌劑處理(例如用脫氧膽酸鹽)或通過非洗滌劑方式(例如參見參考文獻134)制備。用于形成OMV的技術包括：用膽酸鹽洗滌劑(例如，石膽酸、鵝脫氧膽酸、烏索脫氧膽酸、脫氧膽酸、膽酸、烏索膽酸等的鹽，用脫氧膽酸鈉[140和141]優(yōu)選用于處理奈瑟氏菌)在不沉淀洗滌劑的足夠高pH下[142]處理細菌。其它技術基本上可以在洗滌劑不存在的情況下[134]使用技術諸如超聲處理、均質(zhì)化、微流化、空化、滲透壓休克、研磨、French壓制、混合等來進行。不用洗滌劑或使用低濃度洗滌劑的方法可以保留有用的抗原，諸如NspA和fHbp[134]。因此，方法可以使用含有約0.5％或更低、例如約0.2％、約0.1％、＜0.05％或零濃度的脫氧膽酸鹽的OMV提取緩沖液。

用于制備OMV的有用方法描述于參考文獻143中，并且涉及對粗制OMV 超濾，而非替代高速離心。該方法可以涉及在超濾進行之后的超離心的步驟。OMV也可以使用參考文獻154中描述的兩階段大小過濾方法進行純化。

本發(fā)明所用的囊泡可以從任何腦膜炎球菌菌株制備。所述囊泡通常來自血清群B菌株，但也可能從除了B以外的血清群(例如，參考文獻142描述了血清群A的方法)諸如A、C、W135或Y菌株來制備。所述菌株可以是任何血清型(例如，1、2a、2b、4、14、15、16等)、任何血清亞型和任何免疫型(例如，L1；L2；L3；L3,3,7；L10；等)。所述腦膜炎球菌可以來自任何合適的譜系，包括高侵襲性和高毒力譜系，例如以下七種高毒力譜系中的任一種：亞組I；亞組III；亞組IV-1；ET-5復合物；ET-37復合物；A4簇；譜系3。

除了編碼本發(fā)明的多肽以外，本發(fā)明的細菌可以具有一種或多種進一步修飾。例如，它們可以具有修飾的fur基因[144]。同時porA和cps敲除可以上調(diào)nspA表達。用于OMV產(chǎn)生的腦膜炎奈瑟氏菌的進一步敲除突變體公開于例如參考文獻150中。參考文獻145描述了從經(jīng)修飾以表達六種不同的PorA亞型的菌株構建囊泡。也可使用通過敲除參與LPS生物合成的酶而實現(xiàn)的具有低內(nèi)毒素水平的突變體奈瑟氏菌[146，147]。本發(fā)明可以使用經(jīng)工程改造以降低或關閉參與賦予LPS的脂質(zhì)A部分毒性的至少一種基因、具體地lpxl1基因的表達的突變體奈瑟氏菌[148]。類似地，本發(fā)明可以使用經(jīng)工程改造以降低或關閉參與莢膜多糖合成或出口的至少一種基因、具體地synX和/或ctrA基因的表達的突變體奈瑟氏菌。這些或其它突變體都可用于本發(fā)明。

因此，在一些實施方案中，本發(fā)明使用的菌株可以表達多于一種PorA亞型。先前已經(jīng)構建了6價和9價PorA菌株。所述菌株可以表達PorA亞型中的2、3、4、5、6、7、8 或9種：P1.7,16；P1.5-1,2-2；P1.19,15-1；P1.5-2,10；P1.12-1,13；P1.7-2,4；P1.22,14；P1.7-1,1和/或P1.18-1,3,6。在其它實施方案中，可以針對PorA表達下調(diào)菌株，例如，其中PorA 的量已經(jīng)相對于野生型水平(例如相對于菌株H44/76)減少了至少20％(例如，>30%、>40%、>50%、>60%、>70%、>80%、>90%、>95%等)，或者甚至被敲除。

在一些實施方案中，菌株可以超表達(相對于相應的野生型菌株)某些蛋白。例如，菌株可以超表達NspA、蛋白287[118]、fHbp[139](包括本發(fā)明的fHbp)、TbpA 和/或TbpB[136]、Cu,Zn-超氧化物歧化酶、HmbR等。

可將編碼本發(fā)明的多肽的基因整合入細菌染色體中，或以附加體形式存在，例如在質(zhì)粒內(nèi)。

有利地，對于囊泡產(chǎn)生，可以將腦膜炎球菌遺傳工程改造，以確保多肽的表達不發(fā)生相變。用于減少或消除腦膜炎球菌中的基因表達的相變的方法公開于參考文獻149中。例如，可將基因置于組成型或誘導型啟動子的控制下，或通過去除或替代負責該相變的DNA基序。

在一些實施方案中，菌株可以包括參考文獻122、124、128和150中公開的敲除和/或超表達突變中的一種或多種。例如，遵循這四個文件中的指導和命名，用于下調(diào)和/或敲除的有用基因包括：(a)Cps、CtrA、CtrB、CtrC、CtrD、FrpB、GalE、HtrB/MsbB、LbpA、LbpB、LpxK、Opa、Opc、PilC、PorB、SiaA、SiaB、SiaC、SiaD、TbpA和/或TbpB；(b)CtrA、CtrB、CtrC、CtrD、FrpB、GalE、HtrB/MsbB、LbpA、LbpB、LpxK、Opa、Opc、PhoP、PilC、PmrE、PmrF、SiaA、SiaB、SiaC、SiaD、TbpA和/或TbpB；(c)ExbB、ExbD、rmpM、CtrA、CtrB、CtrD、GalE、LbpA、LpbB、Opa、Opc、PilC、PorB、SiaA、SiaB、SiaC、SiaD、TbpA和/或TbpB；或(d)CtrA、CtrB、CtrD、FrpB、OpA、OpC、PilC、PorB、SiaD、SynA、SynB、SynX和/或SynC。

在一些實施方案中，當使用突變體菌株時，其可以具有以下特征中的一種或多種或所有：(i)下調(diào)或敲除的LgtB和/或GalE以截短腦膜炎球菌LOS；(ii)上調(diào)的TbpA；(iii)上調(diào)的NhhA；(iv)上調(diào)的Omp85；(v)上調(diào)的LbpA；(vi)上調(diào)的NspA；(vii)敲除的PorA；(viii)下調(diào)或敲除的FrpB；(ix)下調(diào)或敲除的Opa；(x)下調(diào)或敲除的Opc；(xii)缺失的cps基因復合體。截短的LOS可以是不包括唾液酸-乳糖-N-新四糖表位的截短的LOS，例如，其可以是半乳糖缺陷的LOS。所述LOS可以不具有α鏈。

根據(jù)用于制備囊泡的腦膜炎球菌菌株，它們可包括或不包括菌株的天然fHbp抗原[151]。

在一個優(yōu)選的實施方案中，腦膜炎球菌不表達功能性MltA蛋白。如參考文獻152和153中所討論，腦膜炎球菌中的MltA(膜結合的裂解性糖基轉移酶，也稱為GNA33)的敲除提供了這樣的細菌，其將大量膜囊泡自發(fā)釋放入培養(yǎng)基，它們可以容易地從所述培養(yǎng)基純化。例如，所述囊泡可以使用參考文獻154的兩階段大小過濾方法進行純化，所述方法包括：(i)第一過濾步驟，其中囊泡基于它們不同的大小與細菌分離，其中囊泡通入濾液；和(ii)第二過濾步驟，其中囊泡保留于保留物中。所述MltA突變(下調(diào)或敲除)已經(jīng)用于'GMMA'疫苗中[155]，并且可以方便地與具體地至少一種參與使得LPS的脂質(zhì)A部分有毒的基因(特別是lpxl1)和/或至少一種參與莢膜多糖合成或輸出的基因(特別是synX和/或ctrA基因)的進一步下調(diào)或敲除進行組合。GMMA(膜抗原的廣義模塊)是由腦膜炎球菌菌株產(chǎn)生的遺傳脫毒的OMV，所述菌株已經(jīng)工程改造以釋放具有降低的反應原性和增加的免疫原性的GMMA。當在單核細胞活化測試(MAT)中測試時，GMMA誘導比OMV更少的促炎細胞因子。

使用該方法的‘GMMA’疫苗的優(yōu)選腦膜炎球菌菌株表達本發(fā)明的突變體v2 fHbp和/或突變體v3 fHbp，并且表達可由強啟動子驅動。該菌株釋放的囊泡包括免疫原性形式的突變體v2和/或v3 fHbp蛋白，并且囊泡的施用可以提供殺細菌抗體應答，如參考文獻155中所討論。該菌株也可以表達v1 fHbp，或者可以替代提供v1 fHbp作為可溶形式的單獨重組蛋白(并且v1 fHbp可以是野生型或突變體序列，例如經(jīng)突變，以破壞其結合至fH的能力，如上所討論)。本發(fā)明提供這樣的菌株，并且還提供了這些菌株釋放的囊泡，例如如菌株的生長之后從培養(yǎng)基所純化。用于在這些菌株中表達的優(yōu)選的v2突變體具有如本文所討論的S32和/或L123處的突變，并且用于在這些菌株中表達的優(yōu)選的v3突變體具有如本文所討論的S32和/或L126處的突變。因此，從表達這些v2和v3突變體fHbp序列的腦膜炎球菌制備的囊泡是用于本發(fā)明的疫苗中的特別優(yōu)選的免疫原。用于以該方式誘變的有用的野生型v2序列包含SEQ ID NO:51或SEQ ID NO:54(包含ΔG形式SEQ ID NO:55)，并且以該方式誘變的有用的野生型v3序列包含SEQ ID NO:52。

用于這樣的菌株中的有用的啟動子包括參考文獻156和157中公開的那些。例如，所述啟動子可以是：(a)來自孔蛋白基因，優(yōu)選porA或porB，特別是來自腦膜炎奈瑟氏菌的啟動子；或(b) rRNA基因啟動子(諸如16S rRNA基因)，特別是來自腦膜炎奈瑟氏菌。當使用腦膜炎球菌孔蛋白啟動子時，其優(yōu)選來自porA，并且甚至更特別是來自腦膜炎球菌porA基因啟動子的-10區(qū)域，和/或來自腦膜炎球菌porA基因啟動子的-35區(qū)域(優(yōu)選地，其中-10區(qū)域和-35區(qū)域由12-20個核苷酸的間插序列分開，并且其中所述間插序列不含聚-G序列或包括具有不超過八個連續(xù)G核苷酸的聚-G序列)。當使用rRNA基因啟動子時，其可以包含更具體地(i)來自腦膜炎球菌rRNA基因啟動子的-10區(qū)域和/或(ii)來自腦膜炎球菌rRNA基因啟動子的-35區(qū)域。也可使用(a)和(b)的雜合體，例如以具有來自porA啟動子的-10區(qū)域和來自rRNA基因啟動子的-35區(qū)域(其可以是共有的-35區(qū)域)。因此，有用的啟動子可以是這樣的啟動子，其包括(i)來自(特別是腦膜炎球菌)rRNA基因的-10區(qū)域和來自(特別是腦膜炎球菌)porA基因的-35區(qū)域，或(ii)來自(特別是腦膜炎球菌)porA基因的-10區(qū)域和來自(特別是腦膜炎球菌)rRNA基因的-35區(qū)域。

如果LOS存在于囊泡中，可處理囊泡，以便連接其LOS和蛋白組分(“泡內(nèi)”綴合[150])。

通用

術語“包含”涵蓋“包括”以及“由……組成”，例如，“包含”X的組合物可以僅由X組成或可包括額外物質(zhì)，例如X+Y。提及“包含(comprising)”(或“包含(comprises)”等)可以任選地被提及“由...組成(consisting of)”(或“由…組成(consists of)”等)替代。術語“基本上由...組成”將權利要求的范圍限制至要求保護的發(fā)明的指定材料或步驟，和“不實質(zhì)上影響要求保護的發(fā)明的基本和新穎特征的那些”。

與數(shù)值x相關的術語“約”是任選的，并且意指，例如x±10％。

詞語“基本上”不排除“完全”，例如“基本上不含”Y的組合物可能完全不含Y。必要時，可以從本發(fā)明的定義中省略詞語“基本上”。

“序列同一性”可以通過MPSRCH程序(Oxford Molecular)中執(zhí)行的Smith-Waterman同源性檢索算法使用仿射缺口檢索(參數(shù)為缺口開放罰分＝12和缺口延伸罰分＝1)確定，但優(yōu)選通過Needleman-Wunsch全局比對算法[158]使用默認參數(shù)(例如，缺口開放罰分＝10.0和缺口延伸罰分＝0.5，使用EBLOSUM62評分矩陣)確定。在EMBOSS軟件包中的needle工具方便地進行該算法[159]。當應用是指與具體SEQ ID的序列同一性，應當經(jīng)該SEQ ID的全長來計算同一性。

關于多肽序列的術語“片段”意味著該多肽是全長蛋白的一部分。這樣的片段可以具有與全長蛋白共同的定性生物活性，例如，片段可含有或編碼一個或多個表位，諸如免疫表位，其允許針對該片段產(chǎn)生與全長序列類似的免疫應答。多肽片段與天然蛋白相比通常缺失氨基(N)末端部分和/或羧基(C)末端部分，但其中該片段的剩余氨基酸序列與天然蛋白的氨基酸序列是相同的。多肽片段可以含有，例如：約8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、24、26、28、40、45、50、55、60、70、80、90、100、150、200、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262個連續(xù)氨基酸，包括參考多肽序列的兩者之間的所有整數(shù)，例如參考多肽序列的50和260、50和255、50和250、50和200、50和150之間的所有整數(shù)個連續(xù)氨基酸。術語片段明確排除全長fHbp多肽及其成熟脂蛋白。

血清群之后，腦膜炎球菌分類包括血清型、血清亞型和然后免疫型，并且標準命名法列出血清群、血清型、血清亞型和免疫型，其各自通過冒號隔開，例如B:4:P1.15:L3,7,9。在血清群B內(nèi)，一些譜系經(jīng)常引起疾病(高侵襲性)，一些譜系引起比其它譜系更嚴重形式的疾病(高毒力)，其它很少引起疾病。識別七種高毒力譜系，即亞組I、III和IV-1、ET-5復合物、ET-7復合物、A4簇和譜系3。這些已經(jīng)通過多基因座酶電泳(MLEE)定義，但多基因座序列分型(MLST)也已經(jīng)用于分類腦膜炎球菌。四種主要的高毒力簇是ST32、ST44、ST8和ST11復合物。

通常，本發(fā)明不涵蓋參考文獻2、3、5、6、7、160、161、162、163、164、165、166和167中具體公開的各種fHbp序列。

附圖簡述

圖1顯示fHbp變體對胰凝乳蛋白酶切割的不同靈敏度。箭頭顯示全長fHbp蛋白的位置。

圖2顯示v2突變體的蛋白質(zhì)印跡分析。泳道為：(1和2)重組純化的v2野生型；(4) v2野生型裂解物；(5)突變體#l；(6)突變體#2；(7)突變體#4；(8)突變體#5；(9)突變體#7；(10)突變體#8；(11)突變體#12；(12)突變體#14；(13)突變體#15；(14)fHbp var2 NΔG-trx對照，即v2蛋白，其中N-末端序列GPDSDRLQQRR (SEQ ID NO:37)被GSKDISS (SEQ ID NO:38)替代。泳道2-14包括胰凝乳蛋白酶。M是分子標記物。

圖3顯示v2突變體的進一步蛋白質(zhì)印跡分析。泳道為：(1和2)突變體#3；(3和4)突變體#6；(5和6)突變體#9；(7和8)突變體#10；(9和10)突變體#13；(11和12) Δgono；(13和14) v2野生型；(15和16)突變體#22。奇數(shù)泳道為不與胰凝乳蛋白酶孵育的蛋白，而偶數(shù)泳道為與胰凝乳蛋白酶孵育的蛋白。‘Δgono’蛋白是重組v2，其中已經(jīng)去除N-末端序列(SEQ ID NO:37)。

圖4顯示v2突變體的進一步蛋白質(zhì)印跡分析。泳道為：(1和2)突變體#11；(3和4) N-trx；(5-7)突變體#19；(8和9)突變體#20；(10和11)突變體#21。泳道2、4、7、9和11，與胰凝乳蛋白酶孵育的蛋白，而其它泳道沒有胰凝乳蛋白酶。‘N-trx’蛋白是重組v2，其中N-末端序列(SEQ ID NO:37)被SEQ ID NO:39替代。

圖5顯示野生型和S58V/L149R突變體v2 fHbp的DSC結果。C-末端結構域不受突變影響，但N-末端結構域的Tm增強>20℃(用箭頭標記)。y-軸顯示Cp (kcal/mol/℃)，且x-軸顯示溫度(℃)。

圖6顯示野生型(實線)和突變體(虛線) v2 fHbp的SPR響應。

圖7顯示作為野生型(頂部)或具有各種突變的v3 fHbp的SPR響應。

圖8顯示SEQ ID NO:48的三重融合蛋白的DSC結果。軸如圖5中。

本發(fā)明的具體實施方案

本發(fā)明提供了以下具體編號的實施方案：

1. 突變體v3或v2 fHbp，其相對于野生型fHbp具有增加的穩(wěn)定性且，優(yōu)選地，還對于人因子H比對于野生型fHbp具有更低的親和力；

例如：

(A)包含突變體fHbp v2氨基酸序列的多肽，其中：(a)所述氨基酸序列與SEQ ID NO:5具有至少80％序列同一性和/或包含SEQ ID NO:5的至少7個氨基酸長且含有(b)中列出的殘基中的至少一個的片段；但(b)所述氨基酸序列在以下殘基中的一個或多個處不同于SEQ ID NO:5：32、33、39、41、69、100、113、122、123、124、125、126、127、128、151、239和/或240；條件是：

? 如果突變體fHbp v2氨基酸序列包括僅殘基32處的取代，則該取代不是被丙氨酸取代，或者(b)中列出的至少一個進一步殘基被取代；

? 如果突變體fHbp v2氨基酸序列包括僅殘基113處的取代，則該取代不是被丙氨酸取代，或者(b)中列出的至少一個進一步殘基被取代；

? 如果突變體fHbp v2氨基酸序列包括僅殘基122處的取代，則該取代不是被丙氨酸取代，或者(b)中列出的至少一個進一步殘基被取代；

? 如果突變體fHbp v2氨基酸序列包括殘基123處的取代，則該取代不是被丙氨酸取代，或者(b)中列出的至少一個進一步殘基被取代；

? 如果突變體fHbp v2氨基酸序列包括僅殘基124處的取代，則該取代不是被丙氨酸取代，或者(b)中列出的至少一個進一步殘基被取代；

? 如果突變體fHbp v2氨基酸序列包括僅殘基127處的取代，則該取代不是被丙氨酸取代，或者(b)中列出的至少一個進一步殘基被取代；且

? 如果突變體fHbp v2氨基酸序列包括僅殘基240處的取代，則該取代不是被丙氨酸取代，或者(b)中列出的至少一個進一步殘基被取代；

或者(B)包含突變體fHbp v3氨基酸序列的多肽，其中：(a)所述氨基酸序列與SEQ ID NO:17具有至少80％序列同一性和/或包含SEQ ID NO:17的至少7個氨基酸長且含有(b)中列出的殘基中的至少一個的片段；但(b)所述氨基酸序列在以下殘基中的一個或多個處不同于SEQ ID NO:17：32、33、39、41、72、103、116、125、126、127、128、129、130、131、154、242和/或243；條件是：

? 如果突變體fHbp v3氨基酸序列包括殘基32處的取代，則該取代不是被丙氨酸取代，或者(b)中列出的至少一個進一步殘基被取代；

? 如果突變體fHbp v3氨基酸序列包括殘基113處的取代，則該取代不是被丙氨酸取代，或者(b)中列出的至少一個進一步殘基被取代。

? 如果突變體fHbp v3氨基酸序列包括僅殘基125處的取代，則該取代不是被丙氨酸取代，或者(b)中列出的至少一個進一步殘基被取代；

? 如果突變體fHbp v3氨基酸序列包括殘基126處的取代，則該取代不是被丙氨酸取代，或者(b)中列出的至少一個進一步殘基被取代；

? 如果突變體fHbp v3氨基酸序列包括殘基127處的取代，則該取代不是被丙氨酸取代，或者(b)中列出的至少一個進一步殘基被取代；

? 如果突變體fHbp v3氨基酸序列包括殘基130處的取代，則該取代不是被丙氨酸取代，或者(b)中列出的至少一個進一步殘基被取代；且

? 如果突變體fHbp v3氨基酸序列包括僅殘基243處的取代，則該取代不是被丙氨酸取代，或者(b)中列出的至少一個進一步殘基被取代。

2. 實施方案1(B)的多肽，其中所述氨基酸序列與SEQ ID NO:17的不同在于(b)中列出的殘基中的一個或多個處的取代；例如，其中所述取代選自：S32V；I33C；L39C；L41C；F72C；V103T；T116S；F125C；L126R；V127I；S128G或S128T；G129D；L130I；G131A；S154C；H242R；和E243H。

3. 實施方案1(B)或實施方案2的多肽，其包含(b)中列出的殘基處且選自如上所示的組3A至3O的多于一個取代。

4. 實施方案1(A)的多肽，其中所述氨基酸序列與SEQ ID NO:5的不同在于(b)中列出的殘基中的一個或多個處的取代；例如，其中所述取代選自：S32V；V33C；L39C；L41C；F69C；V100T；I113S；F122C；L123R；V124I；S125G或S125T；G126D；L127I；G128A；S151C；H239R；和E240H。

5. 實施方案1(A)或實施方案4的多肽，其包含(b)中列出的殘基處且選自如上所示的組2A至2O的多于一個取代。

6. 實施方案1-5中任一項的多肽，其還包括破壞所述多肽結合至人因子H的能力的一個或多個進一步突變；例如，在v2中，包括在R73、D203、E210、G228、S121、F122、L123、A192、E194、V199、I200、L201、T213、H215、F219、T231和E240中的一個或多個處的取代，或者在v3中，包括在Q35、I178、L87、A88、L126、V127、V202、E213、T216、T234、V241和E243中的一個或多個處的取代。

7. 多肽，其包含：

? 氨基酸序列SEQ ID NO:44，其任選地具有1、2、3、4或5個單一氨基酸取代、缺失和/或插入，其中所述多肽可以引發(fā)抗體，所述抗體結合至腦膜炎球菌fHbp多肽，所述腦膜炎球菌fHbp多肽由SEQ ID NO:40的氨基酸序列組成(例如，包含氨基酸序列SEQ ID NO:44且具有1、2或3個單一氨基酸取代)，但不在殘基V32或R126處突變；

? 氨基酸序列SEQ ID NO:45，其任選地具有1、2、3、4或5個單一氨基酸取代、缺失和/或插入，其中所述多肽可以引發(fā)抗體，所述抗體結合至腦膜炎球菌fHbp多肽，所述腦膜炎球菌fHbp多肽由SEQ ID NO:2的氨基酸序列組成(例如，包含氨基酸序列SEQ ID NO:45且具有1、2或3個單一氨基酸取代)，但不在殘基V32或R123處突變；

? fHbp v3氨基酸序列，其中所述v3氨基酸序列與v3野生型氨基酸序列是相同的，除了對應于SEQ ID NO:17的Leu-126的氨基酸位置處的突變，條件是所述突變不是取代為丙氨酸(例如，其中所述突變是取代為精氨酸)。

? fHbp v2氨基酸序列，其中所述v2氨基酸序列與v2野生型氨基酸序列是相同的，除了對應于SEQ ID NO:5的Leu-123的氨基酸位置處的突變，條件是所述突變不是取代為丙氨酸(例如，其中所述突變是取代為精氨酸)；或

? 氨基酸序列SEQ ID NO:47，其任選地具有1、2、3、4或5個單一氨基酸取代、缺失和/或插入，其中所述多肽可以引發(fā)結合至以下中每一種的抗體：由SEQ ID NO:46的氨基酸序列組成的腦膜炎球菌fHbp多肽；由SEQ ID NO:4的氨基酸序列組成的腦膜炎球菌fHbp多肽；和由SEQ ID NO:40的氨基酸序列組成(例如，由氨基酸序列SEQ ID NO:48組成)的腦膜炎球菌fHbp多肽。

8. 質(zhì)?；蚱渌怂幔浒幋a實施方案1至7中任一項的多肽的核苷酸序列。

9. 用實施方案8的質(zhì)粒轉化的宿主細胞；例如，其中所述細胞是腦膜炎球菌細菌，諸如具有mltA的下調(diào)或敲除的腦膜炎球菌細菌，并且也任選地具有以下的下調(diào)或敲除：(i)至少一種參與使得LPS的脂質(zhì)A部分有毒的基因，特別是lpxl1；和/或(ii)至少一種參與莢膜多糖合成或輸出的基因，特別是synX和/或ctrA。

10. 從實施方案9的宿主細胞制備的膜囊泡，其中所述囊泡包括實施方案1至7中任一項的多肽。

11. 免疫原性組合物，其包含實施方案1至7中任一項的多肽，或實施方案10的囊泡。

12. 實施方案11的組合物，其進一步包含第二多肽，當施用于哺乳動物時，所述第二多肽引發(fā)針對腦膜炎球菌殺細菌的抗體應答。

13. 實施方案11或12的組合物，其進一步包含(i)綴合的來自腦膜炎奈瑟氏菌血清群A、C、W135和/或Y的莢膜糖和/或(ii)綴合的來自肺炎鏈球菌的莢膜糖。

14. 用于在哺乳動物中產(chǎn)生抗體應答的方法，其包括施用實施方案11至13中任一項的免疫原性組合物。

用于實施本發(fā)明的方式

fHbp突變

v2 fHbp被認為是不穩(wěn)定的。為了分析該不期望特性的根本結構原因，著眼于工程改造序列以改善穩(wěn)定性，本發(fā)明人分析了fHbp多肽的序列比對和3D結構。特別感興趣的一個區(qū)域是N-末端和C-末端結構域之間的結構界面[168]。

本發(fā)明人鑒定了表1中鑒定的突變。鑒定用于突變的位置中的三個與參考文獻24和25重疊，但本發(fā)明不涵蓋現(xiàn)有技術中報道的多肽，即其中所述多肽包括僅在這些位置處被丙氨酸取代。例如，E240可以被組氨酸取代以匹配v1，并且理想地與殘基H239處的取代匹配(突變體#1和#11)。類似地，如果F122被取代，則其優(yōu)選與S151處的取代配對，兩者均被半胱氨酸取代，以允許形成二硫橋(突變體#10)。此外，如果L123被取代，則其可以被精氨酸(而不是丙氨酸)取代，或者其可以與其它殘基處(例如在S32處(參見突變體#3)，在S125處(參見突變體#20和#22))的取代配對、或與在殘基124-128處的取代(參見突變體#12)配對。

穩(wěn)定性研究

不穩(wěn)定蛋白傾向于較少折疊，并且由于該原因，易于被蛋白酶切割和降解。圖1顯示v2 fHbp比v1和v3對胰凝乳蛋白酶更敏感，所以該測試可以用于評價突變體蛋白的穩(wěn)定性。

對于圖1，將野生型fHbp v1、v2和v3以0.5mg/μL制備于50mM Tris-HCl, 150mM NaCl, pH 8中。以1:100 (w/w)比率添加胰凝乳蛋白酶。將樣品在24℃以50mL體積孵育，無振蕩。提取樣品并煮沸0、1、3或6小時；然后在12% bis-Tris凝膠(MES緩沖液)中運行。標記*的左側泳道表明在無蛋白酶的情況下孵育6小時的樣品。

表達重組蛋白的大腸桿菌的細胞裂解物已經(jīng)與1:100 w/w比率胰凝乳蛋白酶在25℃下孵育3小時。在與兔中針對所有三種fHbp變體引發(fā)的免疫多克隆血清孵育之后，已經(jīng)通過蛋白質(zhì)印跡分析了降解模式。在較低表觀分子量處的切割產(chǎn)物的存在(圖2-4)被解釋為不穩(wěn)定性的指示，而對應于~30 kDa的表觀MW的條帶的持久性被解釋為增加穩(wěn)定性的指示。與野生型v2相比，突變體#1-6、#12和#22都顯示對胰凝乳蛋白酶切割的增加耐受性。

DSC已被用作獨立方法來評價突變對純化的重組fHbp v2蛋白的穩(wěn)定性的影響。通過DSC測量的T_m(熔融溫度)對應于分析蛋白50%在折疊狀態(tài)且50％在解折疊狀態(tài)的溫度。穩(wěn)定蛋白的構象的變化將增加Tm，而不穩(wěn)定性變化將降低Tm。如參考文獻24的圖3D中所見，野生型v2 fHbp的DSC概況顯示了兩種Tm值：在~40℃的T_m1，其對應于N-末端結構域的熔融溫度，和在~80℃的T_m2，其對應于C-末端結構域的熔融溫度。分析的突變體的T_m1和T_m2的值顯示于表1中。突變體#2、#4、#5、#12、#19和#21顯示N-末端結構域相對于野生型蛋白增加的T_m，并且該效果對于突變體#2、#4和#12更顯著。

大小排阻層析(SEC)被用來評價單體蛋白的百分比，并且結果也顯示于表1中。

突變體#2、#3和#4

突變體#3(組2B)在v2穩(wěn)定性研究中給出最佳總體結果。該蛋白(SEQ ID NO:20)包括在Ser-58 (SEQ ID NO:5中的S32)和Leu-149 (SEQ ID NO:5中的L123)處的突變，分別被Val和Arg取代。通過DSC分析突變體v2蛋白(SEQ ID NO:20，包含SEQ ID NO:45)，并且與野生型序列相比，其N-末端結構域的T_m高>20℃(圖5)。

在血清殺細菌測定法中，該v2突變體可以競爭與已經(jīng)使用野生型v2序列產(chǎn)生的人抗體的結合。

盡管已經(jīng)引入S58V和L149R突變以改善穩(wěn)定性，并且確實實現(xiàn)該目標，圖6顯示，當通過針對固定的fH的表面等離振子共振測量時，與野生型v2序列(實線)相比時，突變體v2多肽(虛線)令人驚訝地顯示出與fH的低得多的結合。S58V突變自身對fH結合影響較小，并且S58V/L149R雙突變體顯示比僅攜帶L149R突變體的fHbp更高的fH結合。

當突變體#3與v2中的‘E313A’突變進一步組合時，存在fH結合的完全喪失，如通過SPR所評價。

將等效突變引入v3序列(SEQ ID NO:17)，以得到v3突變體SEQ ID NO:44。在v3(即v2突變體#2和#4的v3等效物)中研究個別S58V和L149R突變對fH結合的影響。因此，根據(jù)SEQ ID NO:17編號，將突變S32V或L126R引入v3序列。將這兩種突變體與兩種不同的野生型v3序列進行比較，并且還與已知破壞v3中的fH結合的‘E313A’突變體[23]進行比較。

如圖7中所示，野生型v3結合fH(最上面兩行)。經(jīng)設計以改善穩(wěn)定性的S58V突變使SPR峰值降低約2倍。最令人驚訝地，L149R突變(再次，經(jīng)設計以改善穩(wěn)定性)將fH親和力降低至與已知E313A突變體類似的水平(底部兩行)。

還通過DSC研究v3中的S58V和L149R突變，并且發(fā)現(xiàn)其使N-末端T_m相對于野生型增加5.5℃(S58V)或6.7℃(L149R)。兩種突變體的T_m比v2雙突變體中所見更高(63.5℃ – 參見表1)。L149R v3突變體也顯示對于其C-末端結構域更高的T_m值，而對于S58V v3突變體在此處幾乎沒有移位。SPR顯示突變體#2的fH結合降低約一半，但對于突變體#4，fH親和力降低至與已知E313A突變體類似的水平(同樣如v2所見)。當組合兩種突變(即突變體#3)時，與野生型相比的T_m增加為11.2℃。當將‘E313A’突變添加至突變體#3時，fH結合幾乎完全消除，盡管當與突變體#3相比時，N-末端結構域的T_m也降低2.9℃(同時保持比v3野生型高8.3℃)。單獨的‘E313A’突變的穩(wěn)定性比野生型低得多，顯示T_m降低6.3℃。

因此突變#2和#4可以單獨使用，或組合(即，突變體#3)使用，任選地與進一步突變使用，以穩(wěn)定v2或v3 fHbp，而且破壞fH親和力。

血清殺細菌測定法用于評價v2和v3中的突變體#3和#4的免疫原性效力。此外，單獨或與#3突變組合，還在v2和v3中測試‘E313A’突變體。還測試野生型v2和v3 fHbp用于比較。該蛋白以20μg/劑量與氫氧化鋁佐劑施用，并且測試所得血清針對一組七種菌株(四種v2菌株，三種v3菌株)的殺細菌活性，所述菌株包括表達與起始野生型菌株序列(即v2序列2.16和v3序列3.42)相同的fHbp的菌株。

v2蛋白的結果如下(SEQ ID用于ΔG形式；* = 同源fHbp)：

v3蛋白的結果如下：

突變體#2和#12的組合

突變體#2和#12各自顯示v2穩(wěn)定性的改善，所以將這兩種突變體組合為單一fHbp(SEQ ID NO:58, ΔG形式)。與突變體#12相比，該組合突變體的N-末端T_m再增加4.2℃，得到任何測試的突變體v2蛋白中最高的T_m。此外，其顯示強烈降低的fH結合(SPR峰值降低約8倍)。

突變體融合蛋白

突變體v2和v3序列經(jīng)由GSGGGG接頭(SEQ ID NO:50)、還與突變體v1序列融合，以得到SEQ ID NO:48。該序列對于v2和v3兩者包括S58V和L149R突變，并且對于v1包括R41S突變[21]。SEQ ID NO:47從N-末端至C-末端包括：v2突變體#3 (SEQ ID NO:45)；v3突變體#3 (SEQ ID NO:44)；和v1 ‘R41S’突變體(SEQ ID NO:49)，其通過富含甘氨酸的接頭序列SEQ ID NO:50連接。融合蛋白可以方便地通過添加Met-[SEQ ID NO:37]-的N-末端序列來表達，因此提供成熟蛋白SEQ ID NO:48。

該融合蛋白因此利用這樣的觀察結果：突變體#3為v2和v3兩者提供了穩(wěn)定性(T_m)的大大增加和fH親和力的大大降低。對于v1，R41S突變對熱穩(wěn)定性具有較小影響，但強烈降低fH結合。

三重融合蛋白的DSC研究(圖8)顯示，三種N-末端轉變一起落在以68℃為中心的寬峰中。三種C-末端轉變也落在一起。UPLC顯示，該蛋白為94.9％純，并且HPLC分析顯示<1.5％寡聚物。

‘GMMA’膜囊泡中表達的突變體蛋白

用mltA、lpxL1和synX的敲除制備v1腦膜炎球菌菌株，以提供‘GMMA’疫苗中在‘ST2’啟動子[157]控制下超表達v2和v3 fHbp脂蛋白的遺傳背景。將v2基因整合入缺失的lpxL1基因座處的基因組，而將v3基因整合于synX基因座處。此外，天然v1 fHbp基因缺失，使得可以在無干擾的情況下研究v2和v3。

對于v2測試突變體#3和#4，并且對于v3測試突變體#4。此外，制備具有v2和v3 #4突變體兩者的菌株。對于這些細菌，通過FACS評價fHbp表達和fH結合。

用于僅表達v2 fHbp的菌株，F(xiàn)ACS顯示，各種蛋白以類似水平表達，該水平比背景Δfhbp菌株高2個log。然而，在fH結合方面，突變體#3和#4顯示少得多的結合，其中突變體#4的結合僅略高于背景。這些結果反映用重組v2蛋白獲得的SPR數(shù)據(jù)。

對于表達v3突變體#4的菌株，F(xiàn)ACS顯示fHbp的充分表達，但其fH結合被廢除(匹配用‘H222R’突變所見的fH結合[19,25])。

對于從v2和v3表達突變體#4的菌株，可以通過FACS檢測到兩種fHbp蛋白，但fH結合僅略高于背景Δfhbp菌株中所見。

蛋白質(zhì)印跡分析用于測試當在液體培養(yǎng)物中生長6天時這些細菌中的fHbp表達的穩(wěn)定性。突變體v2蛋白的表達隨著時間保持穩(wěn)定，甚至當共表達v3時。突變體v3蛋白的表達也保持穩(wěn)定，除了在表達v2和v3突變體兩者的菌株中，其中v3表達隨著時間下降。

應該理解的是，本發(fā)明僅借助實例進行描述，并且可以作出修改，而仍在本發(fā)明的范圍和精神內(nèi)。

序列表

>SEQ ID NO:1 [MC58, v1]

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>SEQ ID NO:2 [2996, v2]

MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ

>SEQ ID NO:3 [M1239, v3]

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>SEQ ID NO:4 [2996，成熟]

CSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ

>SEQ ID NO:5 [2996 ΔG]

VAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ

>SEQ ID NO:6 [NHBA]

MFKRSVIAMACIFALSACGGGGGGSPDVKSADTLSKPAAPVVSEKETEAKEDAPQAGSQGQGAPSAQGSQDMAAVSEENTGNGGAVTADNPKNEDEVAQNDMPQNAAGTDSSTPNHTPDPNMLAGNMENQATDAGESSQPANQPDMANAADGMQGDDPSAGGQNAGNTAAQGANQAGNNQAAGSSDPIPASNPAPANGGSNFGRVDLANGVLIDGPSQNITLTHCKGDSCSGNNFLDEEVQLKSEFEKLSDADKISNYKKDGKNDKFVGLVADSVQMKGINQYIIFYKPKPTSFARFRRSARSRRSLPAEMPLIPVNQADTLIVDGEAVSLTGHSGNIFAPEGNYRYLTYGAEKLPGGSYALRVQGEPAKGEMLAGAAVYNGEVLHFHTENGRPYPTRGRFAAKVDFGSKSVDGIIDSGDDLHMGTQKFKAAIDGNGFKGTWTENGSGDVSGKFYGPAGEEVAGKYSYRPTDAEKGGFGVFAGKKEQD

>SEQ ID NO:7 [NadA]

MSMKHFPSKVLTTAILATFCSGALAATSDDDVKKAATVAIVAAYNNGQEINGFKAGETIYDIGEDGTITQKDATAADVEADDFKGLGLKKVVTNLTKTVNENKQNVDAKVKAAESEIEKLTTKLADTDAALADTDAALDETTNALNKLGENITTFAEETKTNIVKIDEKLEAVADTVDKHAEAFNDIADSLDETNTKADEAVKTANEAKQTAEETKQNVDAKVKAAETAAGKAEAAAGTANTAADKAEAVAAKVTDIKADIATNKADIAKNSARIDSLDKNVANLRKETRQGLAEQAALSGLFQPYNVGRFNVTAAVGGYKSESAVAIGTGFRFTENFAAKAGVAVGTSSGSSAAYHVGVNYEW

>SEQ ID NO:8 [NspA]

MKKALATLIALALPAAALAEGASGFYVQADAAHAKASSSLGSAKGFSPRISAGYRINDLRFAVDYTRYKNYKAPSTDFKLYSIGASAIYDFDTQSPVKPYLGARLSLNRASVDLGGSDSFSQTSIGLGVLTGVSYAVTPNVDLDAGYRYNYIGKVNTVKNVRSGELSAGVRVKF

>SEQ ID NO:9 [HmbR]

MKPLQMLPIAALVGSIFGNPVLAADEAATETTPVKAEIKAVRVKGQRNAPAAVERVNLNRIKQEMIRDNKDLVRYSTDVGLSDSGRHQKGFAVRGVEGNRVGVSIDGVNLPDSEENSLYARYGNFNSSRLSIDPELVRNIEIVKGADSFNTGSGALGGGVNYQTLQGRDLLLDDRQFGVMMKNGYSTRNREWTNTLGFGVSNDRVDAALLYSQRRGHETESAGNRGYAVEGEGSGANIRGSARGIPDSSKHKYNHHALGKIAYQINDNHRIGASLNGQQGHNYTVEESYNLTASSWREADDVNRRRNANLFYEWMPDSNWLSSLKADFDYQKTKVAAVNNKGSFPMDYSTWTRNYNQKDLDEIYNRSMDTRFKRFTLRLDSHPLQLGGGRHRLSFKTFVSRRDFENLNRDDYYFSGRVVRTTSSIQHPVKTTNYGFSLSDQIQWNDVFSSRAGIRYDHTKMTPQELNAECHACDKTPPAANTYKGWSGFVGLAAQLNQAWRVGYDITSGYRVPNASEVYFTYNHGSGNWLPNPNLKAERSTTHTLSLQGRSEKGMLDANLYQSNYRNFLSEEQKLTTSGTPGCTEENAYYGICSDPYKEKLDWQMKNIDKARIRGIELTGRLNVDKVASFVPEGWKLFGSLGYAKSKLSGDNSLLSTQPLKVIAGIDYESPSEKWGVFSRLTYLGAKKVKDAQYTVYENKGWGTPLQKKVKDYPWLNKSAYVFDMYGFYKPAKNLTLRAGVYNLFNRKYTTWDSLRGLYSYSTTNAVDRDGKGLDRYRAPGRNYAVSLEWKF

>SEQ ID NO:10 [NhhA]

MNKIYRIIWNSALNAWVVVSELTRNHTKRASATVKTAVLATLLFATVQASANNEEQEEDLYLDPVQRTVAVLIVNSDKEGTGEKEKVEENSDWAVYFNEKGVLTAREITLKAGDNLKIKQNGTNFTYSLKKDLTDLTSVGTEKLSFSANGNKVNITSDTKGLNFAKETAGTNGDTTVHLNGIGSTLTDTLLNTGATTNVTNDNVTDDEKKRAASVKDVLNAGWNIKGVKPGTTASDNVDFVRTYDTVEFLSADTKTTTVNVESKDNGKKTEVKIGAKTSVIKEKDGKLVTGKDKGENGSSTDEGEGLVTAKEVIDAVNKAGWRMKTTTANGQTGQADKFETVTSGTNVTFASGKGTTATVSKDDQGNITVMYDVNVGDALNVNQLQNSGWNLDSKAVAGSSGKVISGNVSPSKGKMDETVNINAGNNIEITRNGKNIDIATSMTPQFSSVSLGAGADAPTLSVDGDALNVGSKKDNKPVRITNVAPGVKEGDVTNVAQLKGVAQNLNNRIDNVDGNARAGIAQAIATAGLVQAYLPGKSMMAIGGGTYRGEAGYAIGYSSISDGGNWIIKGTASGNSRGHFGASASVGYQW

>SEQ ID NO:11 [App]

MKTTDKRTTETHRKAPKTGRIRFSPAYLAICLSFGILPQAWAGHTYFGINYQYYRDFAENKGKFAVGAKDIEVYNKKGELVGKSMTKAPMIDFSVVSRNGVAALVGDQYIVSVAHNGGYNNVDFGAEGRNPDQHRFTYKIVKRNNYKAGTKGHPYGGDYHMPRLHKFVTDAEPVEMTSYMDGRKYIDQNNYPDRVRIGAGRQYWRSDEDEPNNRESSYHIASAYSWLVGGNTFAQNGSGGGTVNLGSEKIKHSPYGFLPTGGSFGDSGSPMFIYDAQKQKWLINGVLQTGNPYIGKSNGFQLVRKDWFYDEIFAGDTHSVFYEPRQNGKYSFNDDNNGTGKINAKHEHNSLPNRLKTRTVQLFNVSLSETAREPVYHAAGGVNSYRPRLNNGENISFIDEGKGELILTSNINQGAGGLYFQGDFTVSPENNETWQGAGVHISEDSTVTWKVNGVANDRLSKIGKGTLHVQAKGENQGSISVGDGTVILDQQADDKGKKQAFSEIGLVSGRGTVQLNADNQFNPDKLYFGFRGGRLDLNGHSLSFHRIQNTDEGAMIVNHNQDKESTVTITGNKDIATTGNNNSLDSKKEIAYNGWFGEKDTTKTNGRLNLVYQPAAEDRTLLLSGGTNLNGNITQTNGKLFFSGRPTPHAYNHLNDHWSQKEGIPRGEIVWDNDWINRTFKAENFQIKGGQAVVSRNVAKVKGDWHLSNHAQAVFGVAPHQSHTICTRSDWTGLTNCVEKTITDDKVIASLTKTDISGNVDLADHAHLNLTGLATLNGNLSANGDTRYTVSHNATQNGNLSLVGNAQATFNQATLNGNTSASGNASFNLSDHAVQNGSLTLSGNAKANVSHSALNGNVSLADKAVFHFESSRFTGQISGGKDTALHLKDSEWTLPSGTELGNLNLDNATITLNSAYRHDAAGAQTGSATDAPRRRSRRSRRSLLSVTPPTSVESRFNTLTVNGKLNGQGTFRFMSELFGYRSDKLKLAESSEGTYTLAVNNTGNEPASLEQLTVVEGKDNKPLSENLNFTLQNEHVDAGAWRYQLIRKDGEFRLHNPVKEQELSDKLGKAEAKKQAEKDNAQSLDALIAAGRDAVEKTESVAEPARQAGGENVGIMQAEEEKKRVQADKDTALAKQREAETRPATTAFPRARRARRDLPQLQPQPQPQPQRDLISRYANSGLSEFSATLNSVFAVQDELDRVFAEDRRNAVWTSGIRDTKHYRSQDFRAYRQQTDLRQIGMQKNLGSGRVGILFSHNRTENTFDDGIGNSARLAHGAVFGQYGIDRFYIGISAGAGFSSGSLSDGIGGKIRRRVLHYGIQARYRAGFGGFGIEPHIGATRYFVQKADYRYENVNIATPGLAFNRYRAGIKADYSFKPAQHISITPYLSLSYTDAASGKVRTRVNTAVLAQDFGKTRSAEWGVNAEIKGFTLSLHAAAAKGPQLEAQHSAGIKLGYRW

>SEQ ID NO:12 [Omp85]

MKLKQIASALMMLGISPLALADFTIQDIRVEGLQRTEPSTVFNYLPVKVGDTYNDTHGSAIIKSLYATGFFDDVRVETADGQLLLTVIERPTIGSLNITGAKMLQNDAIKKNLESFGLAQSQYFNQATLNQAVAGLKEEYLGRGKLNIQITPKVTKLARNRVDIDITIDEGKSAKITDIEFEGNQVYSDRKLMRQMSLTEGGIWTWLTRSNQFNEQKFAQDMEKVTDFYQNNGYFDFRILDTDIQTNEDKTKQTIKITVHEGGRFRWGKVSIEGDTNEVPKAELEKLLTMKPGKWYERQQMTAVLGEIQNRMGSAGYAYSEISVQPLPNAETKTVDFVLHIEPGRKIYVNEIHITGNNKTRDEVVRRELRQMESAPYDTSKLQRSKERVELLGYFDNVQFDAVPLAGTPDKVDLNMSLTERSTGSLDLSAGWVQDTGLVMSAGVSQDNLFGTGKSAALRASRSKTTLNGSLSFTDPYFTADGVSLGYDVYGKAFDPRKASTSIKQYKTTTAGAGIRMSVPVTEYDRVNFGLVAEHLTVNTYNKAPKHYADFIKKYGKTDGTDGSFKGWLYKGTVGWGRNKTDSALWPTRGYLTGVNAEIALPGSKLQYYSATHNQTWFFPLSKTFTLMLGGEVGIAGGYGRTKEIPFFENFYGGGLGSVRGYESGTLGPKVYDEYGEKISYGGNKKANVSAELLFPMPGAKDARTVRLSLFADAGSVWDGKTYDDNSSSATGGRVQNIYGAGNTHKSTFTNELRYSAGGAVTWLSPLGPMKFSYAYPLKKKPEDEIQRFQFQLGTTF

>SEQ ID NO:13 [NMB2091]

MVSAVIGSAAVGAKSAVDRRTTGAQTDDNVMALRIETTARSYLRQNNQTKGYTPQISVVGYDRHLLLLGQVATEGEKQFVGQIARSEQAAEGVYNYITVASLPRTAGDIAGDTWNTSKVRATLLGISPATRARVKIVTYGNVTYVMGILTPEEQAQITQKVSTTVGVQKVITLYQNYVQR

>SEQ ID NO:14 [NHBA融合體]

MASPDVKSADTLSKPAAPVVSEKETEAKEDAPQAGSQGQGAPSAQGGQDMAAVSEENTGNGGAAATDKPKNEDEGAQNDMPQNAADTDSLTPNHTPASNMPAGNMENQAPDAGESEQPANQPDMANTADGMQGDDPSAGGENAGNTAAQGTNQAENNQTAGSQNPASSTNPSATNSGGDFGRTNVGNSVVIDGPSQNITLTHCKGDSCSGNNFLDEEVQLKSEFEKLSDADKISNYKKDGKNDGKNDKFVGLVADSVQMKGINQYIIFYKPKPTSFARFRRSARSRRSLPAEMPLIPVNQADTLIVDGEAVSLTGHSGNIFAPEGNYRYLTYGAEKLPGGSYALRVQGEPSKGEMLAGTAVYNGEVLHFHTENGRPSPSRGRFAAKVDFGSKSVDGIIDSGDGLHMGTQKFKAAIDGNGFKGTWTENGGGDVSGKFYGPAGEEVAGKYSYRPTDAEKGGFGVFAGKKEQDGSGGGGATYKVDEYHANARFAIDHFNTSTNVGGFYGLTGSVEFDQAKRDGKIDITIPVANLQSGSQHFTDHLKSADIFDAAQYPDIRFVSTKFNFNGKKLVSVDGNLTMHGKTAPVKLKAEKFNCYQSPMAKTEVCGGDFSTTIDRTKWGVDYLVNVGMTKSVRIDIQIEAAKQ

>SEQ ID NO:15 [NadA片段]

ATNDDDVKKAATVAIAAAYNNGQEINGFKAGETIYDIDEDGTITKKDATAADVEADDFKGLGLKKVVTNLTKTVNENKQNVDAKVKAAESEIEKLTTKLADTDAALADTDAALDATTNALNKLGENITTFAEETKTNIVKIDEKLEAVADTVDKHAEAFNDIADSLDETNTKADEAVKTANEAKQTAEETKQNVDAKVKAAETAAGKAEAAAGTANTAADKAEAVAAKVTDIKADIATNKDNIAKKANSADVYTREESDSKFVRIDGLNATTEKLDTRLASAEKSIADHDTRLNGLDKTVSDLRKETRQGLAEQAALSGLFQPYNVG

>SEQ ID NO:16 [MC58, ΔG]

VAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEVKTVNGIRHIGLAAKQ

>SEQ ID NO:17 [M1239, ΔG]

VAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDSIPQNGTLTLSAQGAEKTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQNHSAVVALQIEKINNPDKTDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPGGKAEYHGKAFSSDDPNGRLHYSIDFTKKQGYGRIEHLKTLEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ

>SEQ ID NO:18 [突變體#1

MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVRHIGIAGKQ

>SEQ ID NO:19 [突變體#2]

MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQVVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVRHIGIAGKQ

>SEQ ID NO:20 [突變體#3]

MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQVVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFRVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ

>SEQ ID NO:21 [突變體#4]

MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFRVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ

>SEQ ID NO:22 [突變體#5]

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>SEQ ID NO:23 [突變體#6]

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>SEQ ID NO:24 [突變體#7]

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>SEQ ID NO:25 [突變體#8]

MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSCRKNEKCKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ

>SEQ ID NO:26 [突變體#9]

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>SEQ ID NO:27 [突變體#10]

MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSCLVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSCDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ

>SEQ ID NO:28 [突變體#11]

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>SEQ ID NO:29 [突變體#12]

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>SEQ ID NO:30 [突變體#13]

MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVTALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ

>SEQ ID NO:31 [突變體#14]

MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKCAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ

>SEQ ID NO:32 [突變體#15]

MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSCLVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ

>SEQ ID NO:33 [突變體#19]

MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQVVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVTGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ

>SEQ ID NO:34 [突變體#20]

MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQVVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFRVTGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ

>SEQ ID NO:35 [突變體#21]

MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQVVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVGGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ

>SEQ ID NO:36 [突變體#22]

MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQVVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFRVGGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ

>SEQ ID NO:37

GPDSDRLQQRR

>SEQ ID NO:38

GSKDISS

>SEQ ID NO:39

GSKDISSGGGG

>SEQ ID NO:40 [M1239, 成熟]

CSSGGGGSGGGGVAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDSIPQNGTLTLSAQGAEKTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQNHSAVVALQIEKINNPDKTDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPGGKAEYHGKAFSSDDPNGRLHYSIDFTKKQGYGRIEHLKTLEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ

>SEQ ID NO:41 [v3(M1239), E243A, ΔG]

VAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDSIPQNGTLTLSAQGAEKTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQNHSAVVALQIEKINNPDKTDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPGGKAEYHGKAFSSDDPNGRLHYSIDFTKKQGYGRIEHLKTLEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHAIGIAGKQ

>SEQ ID NO:42 [v3(M1239), S32V+E243A, ΔG]

VAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDVIPQNGTLTLSAQGAEKTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQNHSAVVALQIEKINNPDKTDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPGGKAEYHGKAFSSDDPNGRLHYSIDFTKKQGYGRIEHLKTLEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHAIGIAGKQ

>SEQ ID NO:43 [v3(M1239), S32V+L126R+E243A, ΔG]

VAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDVIPQNGTLTLSAQGAEKTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQNHSAVVALQIEKINNPDKTDSLINQRSFRVSGLGGEHTAFNQLPGGKAEYHGKAFSSDDPNGRLHYSIDFTKKQGYGRIEHLKTLEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHAIGIAGKQ

>SEQ ID NO:44 [v3, S32V + L126R, ΔG]

VAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDVIPQNGTLTLSAQGAEKTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQNHSAVVALQIEKINNPDKTDSLINQRSFRVSGLGGEHTAFNQLPGGKAEYHGKAFSSDDPNGRLHYSIDFTKKQGYGRIEHLKTLEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ

>SEQ ID NO:45 [v2 突變體#3 S32V + L123R, ΔG]

VAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQVVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFRVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ

>SEQ ID NO:46 [MC58, v1, 成熟]

CSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEVKTVNGIRHIGLAAKQ

>SEQ ID NO:47 [v2-v3-v-1 突變體融合體]

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>SEQ ID NO:48 [v2-v3-v-1 突變體融合體，具有接頭]

MGPDSDRLQQRRVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQVVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFRVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQGSGGGGVAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDVIPQNGTLTLSAQGAEKTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQNHSAVVALQIEKINNPDKTDSLINQRSFRVSGLGGEHTAFNQLPGGKAEYHGKAFSSDDPNGRLHYSIDFTKKQGYGRIEHLKTLEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQGSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVSKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEVKTVNGIRHIGLAAKQ

>SEQ ID NO:49 [MC58, ΔG, ‘R41S’突變]

VAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVSKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEVKTVNGIRHIGLAAKQ

>SEQ ID NO:50 [接頭]

GSGGGG

>SEQ ID NO:51 [野生型v2序列，例如，用于GMMA方法]

VAADIGARLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ

>SEQ ID NO:52 [野生型v3序列，例如，用于GMMA方法]

VAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGKLITLESGEFQVYKQSHSALTALQTEQVQDSEDSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPKGGSATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKSPELNVELATAELKADEKSHAVILGDTRYGGEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIREKVHEIGIAGKQ

>SEQ ID NO:53 [m1239, L126R突變]

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>SEQ ID NO:54 [v2, 8047菌株，野生型]

MNRTAFCCLSLTTALILTACSSGGGGVAADIGARLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ

>SEQ ID NO:55 [v2, 8047菌株, ΔG]

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>SEQ ID NO:56 [v2, ‘E313A’突變體, ΔG]

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>SEQ ID NO:57 [v2, 突變體#3 + ‘E313A’, ΔG]

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>SEQ ID NO:58 [突變體#2 + #12]

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>SEQ ID NO:59 [v2, 菌株8047菌株, 突變體#4, 成熟]

CSSGGGGVAADIGARLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFRVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ

>SEQ ID NO:60 [v2, 菌株8047菌株, 突變體#3, 成熟]

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>SEQ ID NO:61 [v3, 突變體#2 + #12, ΔG]

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