本公開涉及制備具有調(diào)節(jié)的糖鏈含量的抗體的方法，該方法包括在包含甘油作為調(diào)節(jié)抗體糖鏈含量的添加劑的介質(zhì)中培養(yǎng)可表達(dá)抗體的細(xì)胞的步驟；通過(guò)調(diào)節(jié)抗體含糖量至期望含量制備高質(zhì)量抗體群的方法；以及通過(guò)所述方法制備的抗體群。本發(fā)明還涉及調(diào)節(jié)抗體糖鏈含量的方法，該方法包括在含甘油作為調(diào)節(jié)抗體糖鏈含量添加劑的介質(zhì)中培養(yǎng)可表達(dá)抗體的細(xì)胞的步驟。此外，本公開還涉及可調(diào)節(jié)抗體糖鏈含量的介質(zhì)組合物，所述介質(zhì)組合物包含甘油作為用于調(diào)節(jié)抗體糖鏈含量的添加劑。

背景技術(shù)：

治療抗體例如單克隆抗體(mAb)和Fc融合蛋白占當(dāng)前重組蛋白藥物市場(chǎng)的一大份額。

抗體相關(guān)藥物的治療效果是通過(guò)抑制靶細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，或者誘導(dǎo)間接免疫機(jī)制例如ADCC(抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性)或CDC(補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性)，所述兩種間接免疫機(jī)制稱為抗體的“效應(yīng)子功能”。在生物改良藥或生物仿制藥以及新抗體領(lǐng)域，效應(yīng)子功能是重要方面，因此進(jìn)行了持續(xù)的研究以優(yōu)化所述功能或保證效應(yīng)子功能的體外相似度。

Fc區(qū)的半乳糖基化可影響抗體的CDC。在半乳糖基化機(jī)制中，半乳糖是糖基化鏈反應(yīng)的結(jié)構(gòu)單元并且通過(guò)半乳糖基轉(zhuǎn)移酶緊鄰結(jié)合到N-乙酰葡糖胺糖，并且尿苷通過(guò)尿苷激酶轉(zhuǎn)化為UTP(三磷酸尿苷)，然后UTP結(jié)合到半乳糖-1-磷酸鹽(半乳糖-1-P)產(chǎn)生半乳糖基化結(jié)構(gòu)單元，UDP-半乳糖。錳(Mn²⁺)是半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的輔因子，其可提高酶的性能。

提高抗體ADCC的研究大致可分為Fc區(qū)本身的設(shè)計(jì)和抗體Fc區(qū)的糖鏈修飾。本發(fā)明人集中于后者Fc區(qū)的糖鏈修飾并且旨在調(diào)節(jié)糖含量。跨國(guó)制藥公司和先進(jìn)生物技術(shù)公司通過(guò)利用糖鏈修飾技術(shù)開發(fā)了具有提高的效應(yīng)子功能和持久性的下一代抗體并且不斷努力占領(lǐng)市場(chǎng)，而該領(lǐng)域的后來(lái)者正致力于適應(yīng)生物仿制藥的時(shí)代并致力于生產(chǎn)與原產(chǎn)品的糖鏈及物理化學(xué)性質(zhì)類似的生物仿制藥。原因在于糖鏈的組分和結(jié)構(gòu)很大地影響治療效果、在人體內(nèi)的保留時(shí)間、藥理學(xué)活性、免疫應(yīng)答等。因此，旨在開發(fā)生物仿制藥產(chǎn)品的公司積極地研究具有與原產(chǎn)品盡可能相似糖鏈的生物仿制藥，從而具有等價(jià)的治療效果和穩(wěn)定性以及較少的副作用例如免疫應(yīng)答。

此前，許多文獻(xiàn)報(bào)道了重組抗體Fc區(qū)糖鏈中的核心巖藻糖基化大大地影響ADCC，并且許多研究人員研究了能夠調(diào)節(jié)核心巖藻糖基化的方法。代表性研究結(jié)果如下。

GDP-巖藻糖的生物合成過(guò)程是巖藻糖基化途徑的結(jié)構(gòu)單元，直接參與抗體的核心巖藻糖基化的酶或結(jié)構(gòu)單元如圖1所示(Sawa et al.,“Glycoproteomic probes for fluorescent imaging of fucosylated glycans in vivo”,PNAS,2006,p12372)。通過(guò)抑制與巖藻糖基化直接相關(guān)的酶或結(jié)構(gòu)單元的合成來(lái)調(diào)節(jié)核心巖藻糖基化的方法已被研究。

已知與核心巖藻糖基化相關(guān)的代表性酶基因有GMD(GDP-甘露糖4,6-脫水酶)基因和FUT8(α-1,6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶)基因，通過(guò)抑制所述兩個(gè)基因的表達(dá)或者制備FUT8敲除CHO宿主而在基因水平調(diào)節(jié)核心巖藻糖基化已被揭示(YAMANE-OHNUKI et al.,“Establishment of FUT8knockout Chinese hamster ovary cells:an ideal host cell line for producing completely defucosylated antibodies with enhanced antibody-dependent cellular cytotoxicity.”,BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING,2004,p614～622)。

抑制核心巖藻糖基化的另一種方法是在糖基化途徑中加入糖苷酶抑制劑(圖2，Hossler et al.,“Optimal and consistent protein glycosylation in mammalian cell culture”,Glycobiology,2009,p939)。也就是說(shuō)，當(dāng)細(xì)胞中的糖蛋白從ER轉(zhuǎn)移到高爾基體時(shí)，其通過(guò)葡萄糖苷酶和甘露糖苷酶被高度甘露糖修飾。此時(shí)，加入α-甘露糖苷酶I抑制劑例如幾夫堿以制備寡甘露糖型糖蛋白，以此抑制巖藻糖基化。該方法比例如建立細(xì)胞系等在基因水平的調(diào)節(jié)方法更容易，并且時(shí)間和成本方面也更有利。

其他巖藻糖基化控制方法是調(diào)節(jié)培養(yǎng)過(guò)程中滲透壓的方法，其中去巖藻糖基化水平(deFuc％)隨著YB2/0細(xì)胞系中滲透壓增加而下降(Yoshinobu et al.,Cytotechnology,2012,p249～265)，并且還有報(bào)告顯示增加滲透壓和延長(zhǎng)培養(yǎng)持續(xù)時(shí)間導(dǎo)致了CHO細(xì)胞系中甘露糖5糖型增加(Efren Pacis et al.,BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING,2011,p1078～1088)。高甘露糖5糖型水平表明去巖藻糖基化水平高。

另一方面，Abbott關(guān)于阿達(dá)木單抗的專利(US 2012/0276631和WO2012/149197)公開了通過(guò)使用錳和半乳糖調(diào)節(jié)抗體糖鏈，并且已有關(guān)于尿苷的半乳糖基化文獻(xiàn)報(bào)道。但是，通過(guò)將糖鏈調(diào)節(jié)至期望含量來(lái)制備抗體還有困難。

在需要通過(guò)調(diào)節(jié)抗體的糖鏈來(lái)增加ADCC活性的技術(shù)的背景下，發(fā)明人進(jìn)行了許多努力以開發(fā)在制備生物仿制抗體藥物時(shí)可保持純化產(chǎn)物中的抗體糖鏈含量的方法。結(jié)果，本發(fā)明人開發(fā)了一種可用于培養(yǎng)過(guò)程中的添加劑，并且發(fā)明了通過(guò)以期望比率調(diào)節(jié)抗體糖鏈含量來(lái)一致地制備具有可靠質(zhì)量的抗體群或等價(jià)物的方法，從而完成了本發(fā)明。

具體而言，發(fā)明人意圖通過(guò)控制制備重組抗體的培養(yǎng)過(guò)程中的添加劑和條件來(lái)調(diào)節(jié)抗體糖鏈含量(半乳糖基化，α巖藻糖基化(afucosylation))以提高抗體的ADCC活性。結(jié)果，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，甘油可增加α巖藻糖基化水平，并且在開發(fā)生物仿制藥的情況下甘油也會(huì)將α巖藻糖基化水平增加至與對(duì)照藥物相似的α巖藻糖基化水平。本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，甘油、錳和尿苷可用作添加劑，并且在使用不同介質(zhì)的舊方法和新的優(yōu)化方法中可獲得相似的效應(yīng)，并且所述添加劑和條件可廣泛用于通過(guò)調(diào)節(jié)抗體的糖鏈含量制備抗體的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是提供制備具有調(diào)節(jié)的糖鏈含量的抗體的方法，該方法包括在包含甘油作為調(diào)節(jié)抗體糖鏈含量添加劑的介質(zhì)中培養(yǎng)表達(dá)抗體的細(xì)胞的步驟。

本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是提供具有調(diào)節(jié)的糖鏈含量的抗體群，其是通過(guò)所述方法制備的。

本發(fā)明的又一個(gè)目標(biāo)是提供調(diào)節(jié)抗體糖鏈含量的方法，該方法包括在包含甘油作為調(diào)節(jié)抗體糖鏈含量添加劑的介質(zhì)中培養(yǎng)表達(dá)抗體的細(xì)胞的步驟。

本發(fā)明的又一個(gè)目標(biāo)是提供可用于調(diào)節(jié)抗體糖鏈含量的介質(zhì)組合物，所述介質(zhì)組合物包含甘油作為調(diào)節(jié)抗體糖鏈含量添加劑。

附圖說(shuō)明

圖1：示出了巖藻糖基化途徑結(jié)構(gòu)單元的GDP-巖藻糖生物合成，以及直接參與抗體的核心巖藻糖基化的酶或結(jié)構(gòu)單元；

圖2：示出了糖基化途徑；

圖3：示出了在可誘導(dǎo)α巖藻糖基化添加劑條件下測(cè)定的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線；

圖4：示出了在可誘導(dǎo)α巖藻糖基化添加劑條件下測(cè)定的細(xì)胞存活率；

圖5：示出了在可誘導(dǎo)α巖藻糖基化添加劑條件下測(cè)定的最終表達(dá)水平；

圖6：示出了在可誘導(dǎo)α巖藻糖基化添加劑條件下產(chǎn)生的抗體的半乳糖基化糖型的相對(duì)含量的圖表；

圖7：示出了在可誘導(dǎo)α巖藻糖基化添加劑條件下產(chǎn)生的抗體的α巖藻糖基化糖型的相對(duì)含量的圖表；

圖8：示出了與不含添加劑對(duì)照相比半乳糖基化抗體和α巖藻糖基化抗體增加和減少的測(cè)定結(jié)果的圖表；

圖9：示出了在錳(M)、半乳糖和尿苷(Urd)單因素或者組合處理?xiàng)l件下測(cè)定的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線；

圖10：示出了在錳(M)、半乳糖和尿苷(Urd)單因素或者組合處理?xiàng)l件下測(cè)定的細(xì)胞存活率；

圖11：示出了在錳(M)、半乳糖和尿苷(Urd)單因素或者組合處理?xiàng)l件下測(cè)定的最終表達(dá)水平；

圖12：示出了在錳(M)、半乳糖和尿苷(Urd)單因素或者組合處理?xiàng)l件下的半乳糖基化含量的圖表；

圖13：示出了在錳(M)、半乳糖和尿苷(Urd)單因素或者組合處理?xiàng)l件下測(cè)定的α巖藻糖基化含量的圖表；

圖14：示出了與不含添加劑對(duì)照相比半乳糖基化抗體和α巖藻糖基化抗體增加和減少的測(cè)定結(jié)果的圖表；

圖15：示出了依據(jù)甘油濃度的(A)細(xì)胞生長(zhǎng)和(B)細(xì)胞存活率測(cè)定結(jié)果的圖表；

圖16：示出了依據(jù)甘油濃度的最終抗體表達(dá)水平測(cè)定結(jié)果；

圖17：示出了依據(jù)甘油濃度的糖鏈含量測(cè)定結(jié)果，其中示出了(A)半乳糖基化的糖鏈含量和(B)α巖藻糖基化的糖鏈含量；

圖18：示出了使用添加劑混合物共誘導(dǎo)半乳糖基化和α巖藻糖基化的新方法在玻瓶培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中(A)細(xì)胞生長(zhǎng)和(B)細(xì)胞存活率測(cè)定結(jié)果的圖表；

圖19：示出了使用添加劑混合物共誘導(dǎo)半乳糖基化和α巖藻糖基化的新方法在玻瓶培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中最終抗體表達(dá)水平的測(cè)定結(jié)果；

圖20：示出了使用添加劑混合物共誘導(dǎo)半乳糖基化和α巖藻糖基化的新方法在玻瓶培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中糖鏈含量的測(cè)定結(jié)果，其中示出了(A)半乳糖基化的糖鏈含量和(B)α巖藻糖基化的糖鏈含量；

圖21：示出了使用添加劑混合物共誘導(dǎo)半乳糖基化和α巖藻糖基化的新方法在玻瓶培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中糖鏈含量的測(cè)定結(jié)果，其中示出了測(cè)定的半乳糖基化/α巖藻糖基化差異(百分比變化)；

圖22：示出了在生物反應(yīng)器培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中依據(jù)甘油濃度的(A)細(xì)胞生長(zhǎng)和(B)細(xì)胞存活率測(cè)定結(jié)果的圖表；

圖23：示出了在生物反應(yīng)器培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中依據(jù)甘油濃度的最終抗體表達(dá)水平的測(cè)定結(jié)果的圖表；

圖24：示出了在生物反應(yīng)器培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中依據(jù)甘油濃度的糖鏈含量測(cè)定結(jié)果，其中示出了(A)半乳糖基化的糖鏈含量和(B)α巖藻糖基化的糖鏈含量；

圖25：示出了在生物反應(yīng)器培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中依據(jù)甘油濃度的糖鏈含量測(cè)定結(jié)果，其中示出了測(cè)定的半乳糖基化/α巖藻糖基化差異(百分比變化)；

圖26：示出了新方法添加劑的最終選擇并示出了在3批生物反應(yīng)器實(shí)驗(yàn)中(A)細(xì)胞生長(zhǎng)和(B)細(xì)胞存活率的測(cè)定結(jié)果的圖表；

圖27：示出了新方法添加劑的最終選擇以及在3批生物反應(yīng)器實(shí)驗(yàn)中最終抗體表達(dá)水平的測(cè)定結(jié)果；

圖28：示出了新方法添加劑的最終選擇以及在3批生物反應(yīng)器實(shí)驗(yàn)中糖鏈含量的測(cè)定結(jié)果，其中示出了(A)半乳糖基化的糖鏈含量和(B)α巖藻糖基化的糖鏈含量；

圖29：示出了新方法添加劑的最終選擇以及在3批生物反應(yīng)器實(shí)驗(yàn)中糖鏈含量的測(cè)定結(jié)果，其中示出了測(cè)定的半乳糖基化/α巖藻糖基化差異(百分比變化)；

圖30：示出了在檢測(cè)應(yīng)用于舊方法的添加劑組分效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)(第I階段臨床試驗(yàn)過(guò)程)中(A)細(xì)胞生長(zhǎng)和(B)細(xì)胞存活率的測(cè)定結(jié)果的圖表；

圖31：示出了在檢測(cè)應(yīng)用于舊方法的添加劑組分效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)(第I階段臨床試驗(yàn)過(guò)程)中最終抗體表達(dá)水平的測(cè)定結(jié)果的圖表；

圖32：示出了在檢測(cè)應(yīng)用于舊方法的添加劑組分效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)(第I階段臨床試驗(yàn)過(guò)程)中糖鏈含量測(cè)定結(jié)果，其中示出了(A)半乳糖基化的糖鏈含量和(B)α巖藻糖基化的糖鏈含量；

圖33：示出了在檢測(cè)應(yīng)用于舊方法的添加劑組分效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)(第I階段臨床試驗(yàn)過(guò)程)中糖鏈含量測(cè)定結(jié)果，其中示出了相對(duì)于對(duì)照組的半乳糖基化/α巖藻糖基化差異(百分比變化)；

圖34：示出了與舊方法(第I階段臨床試驗(yàn)過(guò)程)相比在檢測(cè)添加劑組分效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)中糖鏈含量的測(cè)定結(jié)果，其中示出了相對(duì)于舊方法樣本的半乳糖基化/α巖藻糖基化增加(百分比變化)；以及

圖35：示出了在用于選擇可誘導(dǎo)α巖藻糖基化添加劑的玻瓶培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中糖鏈含量測(cè)定結(jié)果，其中示出了(A)半乳糖基化的糖鏈含量和(B)α巖藻糖基化的糖鏈含量。

具體實(shí)施方式

為實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)，本發(fā)明一方面提供了穩(wěn)定地制備具有可靠質(zhì)量的抗體群或等價(jià)物的方法，其中抗體的糖鏈含量是通過(guò)加入添加劑至介質(zhì)中調(diào)節(jié)的，以此制備包含具有期望的糖鏈含量抗體的抗體群。具體地，調(diào)節(jié)抗體糖鏈含量可以是調(diào)節(jié)半乳糖基化或α巖藻糖基化。

具體地，本發(fā)明的方法可以是在產(chǎn)生抗體的過(guò)程中通過(guò)加入選自包含甘油、錳、尿苷的組中的一種或多種添加劑至培養(yǎng)介質(zhì)中以調(diào)節(jié)抗體的半乳糖基化、α巖藻糖基化或者半乳糖基化/α巖藻糖基化含量的方法，具體地可以是制備具有調(diào)節(jié)的糖鏈含量抗體的方法，包括在包含甘油作為調(diào)節(jié)抗體糖鏈含量的添加劑的介質(zhì)中培養(yǎng)表達(dá)抗體的細(xì)胞的步驟。本發(fā)明中，除甘油外，所述介質(zhì)還可包含選自包括錳和尿苷的組中的一種或多種作為調(diào)節(jié)抗體糖鏈含量的添加劑。

本文中，術(shù)語(yǔ)“抗體”，通過(guò)免疫系統(tǒng)中的抗原刺激產(chǎn)生的物質(zhì)，是指淋巴和血液中可與具體抗原特異性結(jié)合以產(chǎn)生抗原-抗體反應(yīng)的物質(zhì)。本發(fā)明的抗體可包括但不限于優(yōu)選地本領(lǐng)域通常使用的所有治療性抗體，更優(yōu)選地是作為靶向HER-2(人表皮生長(zhǎng)因子受體2)的抗體的曲妥珠單抗或帕妥珠單抗，且最優(yōu)選地是曲妥珠單抗。曲妥珠單抗也稱為赫賽汀，是一種針對(duì)HER2的人源化抗體，由Genentech公司(USA)開發(fā)，被認(rèn)為是針對(duì)主要在乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)的HER2/neu的治療性抗體。

本發(fā)明中，表達(dá)抗體的細(xì)胞包括可表達(dá)需要的抗體的天然或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，沒有限制。對(duì)于本發(fā)明的目標(biāo)，表達(dá)抗體的細(xì)胞可以是表達(dá)調(diào)節(jié)糖鏈含量受試者抗體的細(xì)胞。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)抗體的細(xì)胞可以是表達(dá)曲妥珠單抗的HD201細(xì)胞系(登記號(hào):KCTC 12164BP，保藏日期：2012.03.19,保藏機(jī)構(gòu)：韓國(guó)生物科學(xué)與生物技術(shù)研究所/韓國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心)。能夠產(chǎn)生抗體的細(xì)胞優(yōu)選地可以是動(dòng)物細(xì)胞，例如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞系(CHO)或小鼠骨髓瘤細(xì)胞系(NSO)。

本文中，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)染”是通過(guò)將DNA直接導(dǎo)入培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞中而改變細(xì)胞遺傳性狀的方法，并且通常使用通過(guò)載體例如質(zhì)粒等導(dǎo)入靶基因的方法。轉(zhuǎn)染可依據(jù)本領(lǐng)域常用的方法進(jìn)行，優(yōu)選例如磷酸鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖處理、電穿孔、重分配等。

本文中，術(shù)語(yǔ)“抗體群”意指包含具有不同糖鏈含量抗體的抗體組合。對(duì)于本發(fā)明的目標(biāo)，抗體群意指包含期望比例半乳糖基化抗體、α巖藻糖基化抗體和半乳糖基化/α巖藻糖基化抗體的抗體組?？贵w群可包括只一種類型抗體或者半乳糖基化的或非半乳糖基化的所有抗體以及α巖藻糖基化的或非α巖藻糖基化的抗體。對(duì)于本發(fā)明的目標(biāo)，抗體群優(yōu)選地是指通過(guò)本發(fā)明的制備方法調(diào)節(jié)了糖鏈含量的抗體組。

本發(fā)明中，糖鏈含量可以是選自包含半乳糖基化含量和α巖藻糖基化含量的組的一種或多種含量。

本發(fā)明中，半乳糖基化含量意指具有半乳糖結(jié)合糖鏈的抗體的含量，而α巖藻糖基化含量意指具有無(wú)巖藻糖基糖鏈的抗體的含量。半乳糖基化和α巖藻糖基化是公知的可大大地影響抗體的ADCC和CDC的重要修飾。

為了開發(fā)生物仿制藥，與對(duì)照藥物的質(zhì)量(糖鏈含量)高度等效產(chǎn)物的制品是最重要的開發(fā)點(diǎn)之一。

本發(fā)明人持續(xù)研究以改良使用曲妥珠單抗基因表達(dá)并獲得的重組蛋白和對(duì)照藥物(原產(chǎn)品)之間的N-聚糖(半乳糖基化和α巖藻糖基化)相似度。已證實(shí)，當(dāng)依據(jù)培養(yǎng)條件制備曲妥珠單抗時(shí)，N-聚糖含量特別是半乳糖基化含量和α巖藻糖基化含量低于對(duì)照藥物中的含量。具體地，由于α巖藻糖基化含量是非常重要的抗體活性(ADCC)指標(biāo)，已進(jìn)行了對(duì)用于培養(yǎng)過(guò)程的添加劑的研究以通過(guò)提高α巖藻糖基化含量將質(zhì)量提高至相當(dāng)于對(duì)照藥物的質(zhì)量。

具體而言，測(cè)定了開發(fā)新方法過(guò)程中產(chǎn)生的抗體的ADCC(抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性)活性，結(jié)果其活性低至對(duì)照藥物活性的60～80％。該結(jié)果導(dǎo)致了本發(fā)明。如上所述，通過(guò)N-聚糖測(cè)定檢測(cè)了對(duì)ADCC活性起重要作用的α巖藻糖基化水平，結(jié)果顯示對(duì)照藥物的α巖藻糖基化水平在8～10％范圍內(nèi)，HD201抗體的α巖藻糖基化水平僅在5～7％范圍內(nèi)。因此，發(fā)明人進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以提高半乳糖基化含量和α巖藻糖基化含量。

在本發(fā)明以前，在加入糖結(jié)構(gòu)單元條件下進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)以誘導(dǎo)半乳糖基化，結(jié)果沒有顯著的半乳糖基化效應(yīng)，但是在半乳糖+錳(Mn²⁺)的存在下檢測(cè)到高α巖藻糖基化含量?；谠摖顩r，通過(guò)改變其他條件檢測(cè)了糖鏈含量(質(zhì)量)的變化。

本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，在加入錳(Mn²⁺)和半乳糖以及可誘導(dǎo)α巖藻糖基化添加劑的條件下和在加入可誘導(dǎo)α巖藻糖基化添加劑但不加入錳(Mn²⁺)和半乳糖的條件下進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。結(jié)果證實(shí)，為獲得與對(duì)照藥物等價(jià)的半乳糖基化水平，需要加入錳(Mn²⁺)和半乳糖兩種物質(zhì)，并且甘油可影響α巖藻糖基化。此前沒有關(guān)于甘油可影響α巖藻糖基化的技術(shù)報(bào)道，而本發(fā)明人首次開發(fā)了該技術(shù)。

為確定適當(dāng)?shù)母视蜐舛?，?～3.0％(v/v)濃度范圍內(nèi)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，經(jīng)證實(shí)，抗體的α巖藻糖基化含量隨甘油濃度的提高而提高。具體地，當(dāng)相對(duì)α巖藻糖基化含量提高時(shí)，在相似甘油濃度范圍內(nèi)檢測(cè)了相對(duì)于無(wú)添加條件下的培養(yǎng)效能。結(jié)果，當(dāng)甘油濃度為1％到2％時(shí)檢測(cè)到顯著效應(yīng)。

此外，本發(fā)明一個(gè)具體的實(shí)施方案中，開發(fā)錳和半乳糖的替代物作為添加劑用于提高半乳糖含量，將尿苷作為候選并用于進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在3種物質(zhì)中的單獨(dú)添加中，單獨(dú)添加錳與單獨(dú)添加半乳糖或尿苷相比顯示出與對(duì)照藥物的G0F比率和G1F比率相似的G0F比率和G1F比率，因此可以看出錳是新方法中主要的半乳糖基化因子。相反地，單獨(dú)加入尿苷，半乳糖基化含量隨尿苷濃度提高而提高。但是在高濃度條件(8mM)下，檢測(cè)到生長(zhǎng)抑制和表達(dá)水平下降，因此認(rèn)為在培養(yǎng)早期加入高濃度尿苷對(duì)于新方法是不適當(dāng)?shù)摹?duì)于α巖藻糖基化，比較了錳、半乳糖和尿苷3種物質(zhì)。結(jié)果證實(shí)，錳和半乳糖之間相關(guān)度低，但是α巖藻糖基化含量隨尿苷濃度的提高而提高。

新方法中加入錳、半乳糖和尿苷進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，錳是可影響抗體半乳糖基化最重要的因子，并且發(fā)現(xiàn)當(dāng)尿苷取代半乳糖時(shí)，設(shè)計(jì)提高半乳糖基化和α巖藻糖基化的方法是可能的。因此，本發(fā)明人通過(guò)加入錳、尿苷和甘油的組合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以提高與對(duì)照藥物在α巖藻糖基化和半乳糖基化方面的等價(jià)性。

本發(fā)明一個(gè)具體的實(shí)施方案中，通過(guò)使用迄今已進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的添加劑條件的組合，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以控制抗體(曲妥珠單抗)的半乳糖基化模式和巖藻糖基化模式，使得其與對(duì)照藥物的那些模式最相似。作為可調(diào)節(jié)抗體糖鏈含量的添加劑，可以使用作為可提高半乳糖基化的主要添加劑的錳，作為可誘導(dǎo)α巖藻糖基化的添加劑的甘油，以及作為可替代半乳糖并且作為半乳糖基化和α巖藻糖基化的共同添加劑的尿苷來(lái)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。

檢測(cè)到加入高濃度的尿苷可促進(jìn)α巖藻糖基化但是通過(guò)生長(zhǎng)抑制而降低表達(dá)水平。因此，將尿苷在培養(yǎng)的第5天單獨(dú)加入以最小化生長(zhǎng)抑制和高甘露糖形式。

經(jīng)證實(shí)，錳具有最高的促進(jìn)半乳糖基化效應(yīng)，并且在20μM～120μM濃度范圍內(nèi)顯示出相似的效應(yīng)。此外，在1％到3％濃度范圍內(nèi)的甘油顯示出促進(jìn)α巖藻糖基化效應(yīng)與其濃度成比例。

將所述3種因素混合并作為添加劑加入，結(jié)果證實(shí)尿苷具有提高半乳糖基化的效應(yīng)，因此將尿苷視為半乳糖的替代物，還顯示出可提高α巖藻糖基化的效應(yīng)，雖然該效應(yīng)是低的。同時(shí)，在玻瓶培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照藥物(H0717)的條件最相似的條件是在40μM錳+1％甘油組合基礎(chǔ)上加入尿苷(在培養(yǎng)的第5天加入)。

相反地，生物反應(yīng)器培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，向生產(chǎn)介質(zhì)中加入2％甘油而非1％甘油在α巖藻糖基化方面顯示出高等價(jià)于對(duì)照藥物將對(duì)照藥物的α巖藻糖基化比率視為“1”，舊方法的樣本顯示出的α巖藻糖基化比率為0.43，添加2％甘油條件顯示出的α巖藻糖基化比率為0.86，其略低于對(duì)照藥物的α巖藻糖基化比率但是舊方法樣本的α巖藻糖基化比率的2倍高。

在用于提高糖鏈調(diào)節(jié)(半乳糖基化和α巖藻糖基化)添加劑的生物反應(yīng)器實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，加入2％甘油與舊方法的樣本相比顯示出可增加N-聚糖譜(profile)中的α巖藻糖基化比率的效應(yīng)，并且對(duì)于半乳糖基化，加入錳和尿苷顯示出可增加半乳糖基化的效應(yīng)。但是，其未顯示出完全等價(jià)于對(duì)照藥物因此試圖改變甘油和尿苷的濃度以及添加方法。

首先，通過(guò)加入2％甘油至進(jìn)料介質(zhì)進(jìn)行進(jìn)料以提高甘油的添加作用。加入尿苷作為半乳糖的替代物，通過(guò)將其濃度從4mM增加到8mM以提高半乳糖基化效應(yīng)。此外，在通過(guò)加入尿苷進(jìn)行的玻瓶實(shí)驗(yàn)中，在培養(yǎng)的最后一天測(cè)定了pH。結(jié)果，pH值為6.9。因此，加入尿苷后將培養(yǎng)pH從pH 6.8調(diào)節(jié)到了pH 6.9。為保持生物反應(yīng)器中pH 6.8，需進(jìn)料CO₂，但是pCO₂常常從培養(yǎng)的第4天持續(xù)增加，并在培養(yǎng)的第5天快速增加到100mmHg或更高。因此，參考文獻(xiàn)中報(bào)道的高pCO₂可負(fù)調(diào)節(jié)糖基化(Kimura R,1997)，在培養(yǎng)的第5天當(dāng)主培養(yǎng)物的pH升高到pH 6.9時(shí)降低pCO₂。針對(duì)該事實(shí)，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)如下：所有3個(gè)組通過(guò)將調(diào)節(jié)糖鏈含量(質(zhì)量提高)的添加劑，40μM錳(M)和2％(v/v)甘油(Gcr)加入生產(chǎn)介質(zhì)中作為新方法的添加劑選擇，并在第5天的主培養(yǎng)物中加入8mM尿苷(Urd)，繼續(xù)培養(yǎng)。因此，設(shè)計(jì)了包括在培養(yǎng)的第5天加入8mM尿苷，然后加入40μM錳和2％甘油的新方法。此外，檢測(cè)了相同條件下的3組生物反應(yīng)器培養(yǎng)物中產(chǎn)生的抗體的糖基化含量，從第8天相應(yīng)的主培養(yǎng)物組獲得的樣本的N-聚糖譜與舊方法的相比較。結(jié)果，HD201P-1102參照物(內(nèi)標(biāo))的半乳糖基化(所有含半乳糖的低聚糖總和)％是33.9％，新方法的3個(gè)組半乳糖基化％在41.8％～42.2％范圍，比HD201P-1102的半乳糖基化％高約8％。此外，HD201P-1102的α巖藻糖基化(所有不含巖藻糖的低聚糖總和)％是3.8％，新方法的3個(gè)組α巖藻糖基化％在9.1％～9.5％范圍，比HD201P-1102的α巖藻糖基化％高約6％。與對(duì)照藥物相比，對(duì)照藥物(批號(hào)H0717)的半乳糖基化％是43％，因此對(duì)照藥物和新方法的3組之間半乳糖基化％的差異小于2％；而對(duì)照藥物的α巖藻糖基化％是8.9％，因此對(duì)照藥物和新方法之間α巖藻糖基化％的差異小于2％，表明所述條件可有效地等價(jià)于對(duì)照藥物。對(duì)照藥物的低聚甘露糖型(所有含甘露糖的低聚糖總和)是1.7％，并且新方法的低聚甘露糖型(4％)比對(duì)照藥物的低聚甘露糖型高2％。

此外，將新方法中設(shè)計(jì)的可調(diào)節(jié)糖鏈含量(改進(jìn)Fc N-聚糖質(zhì)量)的添加劑(錳、甘油和尿苷)在小規(guī)模生物反應(yīng)器中應(yīng)用于舊方法(不同的介質(zhì)環(huán)境)，以檢測(cè)糖基化譜(半乳糖基化/α巖藻糖基化)是否受到調(diào)節(jié)。將2％甘油加入新方法的生產(chǎn)培養(yǎng)介質(zhì)和進(jìn)料基質(zhì)中，但是該實(shí)驗(yàn)中，將甘油濃度提高到3％。從生物反應(yīng)器中的主培養(yǎng)物收集的樣本中，比較了舊方法中加入添加劑條件和不加入添加劑條件之間的N-聚糖譜。加入添加劑條件的半乳糖基化％為43.8％，而不加入添加劑條件的半乳糖基化％為43％，即加入添加劑條件的半乳糖基化％提高了1％。此外，加入添加劑條件的α巖藻糖基化％為18.7％，而不加入添加劑條件的α巖藻糖基化％為9.1％，即加入添加劑條件的α巖藻糖基化％提高了2倍。此外，在新方法中，比較了加入添加劑條件和不加入添加劑條件。結(jié)果，加入添加劑條件的半乳糖基化％為40.5％，不加入添加劑條件的半乳糖基化％為31.8％，即加入添加劑條件的半乳糖基化％提高了8％。加入添加劑條件的α巖藻糖基化％為14.1％，而不加入添加劑條件的α巖藻糖基化％為6.1％，即加入添加劑條件的α巖藻糖基化％提高了2倍，與舊方法相似。

經(jīng)證實(shí)，加入本發(fā)明開發(fā)的可調(diào)節(jié)糖鏈含量(改進(jìn)Fc N-聚糖質(zhì)量)的添加劑(錳、甘油和尿苷)在新方法和舊方法中產(chǎn)生了相似的效應(yīng)。

依據(jù)抗體依賴性細(xì)胞毒性測(cè)定的SOP進(jìn)行了HD201抗體的ADCC活性測(cè)定[HD201抗體依賴性細(xì)胞毒性測(cè)定]。

此外，在本發(fā)明一個(gè)具體的實(shí)施方案中，加入本發(fā)明可調(diào)節(jié)糖鏈含量的添加劑(錳、甘油和尿苷)制備的抗體的ADCC活性通過(guò)相對(duì)ADCC測(cè)定檢測(cè)，其是一種體外測(cè)定。將目前可獲得的原產(chǎn)品用作ADCC活性的參照物質(zhì)(對(duì)照藥物)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示為由通常使用的EC₅₀值確定的相對(duì)ADCC％(A)和使用通過(guò)PLA s/w計(jì)算的相對(duì)活性比率的相對(duì)ADCC活性％(B)?？梢钥闯?，依據(jù)EC₅₀和PLA所得的結(jié)果之間略有不同，但整體模式一致。

在小規(guī)模的舊方法中，加入添加劑條件的ADCC活性與對(duì)照藥物相比為217.5％，未加入添加劑條件的ADCC活性為78.7％，低于對(duì)照藥物的ADCC活性。因此，將所述可調(diào)節(jié)糖鏈含量(改進(jìn)Fc N-聚糖質(zhì)量)的添加劑(錳、甘油和尿苷)應(yīng)用到舊方法中時(shí)，α巖藻糖基化比率可提高到2倍，導(dǎo)致ADCC活性與未加入添加劑條件相比提高100％或更高。在新方法中，與對(duì)照藥物相比加入添加劑條件的ADCC活性為130％，與對(duì)照藥物相比未加入添加劑條件的ADCC活性為42.7％，是最低的活性。因此，由于舊方法使用不同的介質(zhì)，當(dāng)向新方法中添加可調(diào)節(jié)糖鏈含量(改進(jìn)Fc N-聚糖質(zhì)量)的添加劑(錳、甘油和尿苷)時(shí)，α巖藻糖基化比率可提高到2倍，導(dǎo)致ADCC活性與未加入添加劑條件相比提高80％或更高。

如本發(fā)明的實(shí)施例中所證實(shí)，當(dāng)使用本發(fā)明可調(diào)節(jié)糖鏈含量的添加劑實(shí)施曲妥珠單抗的生產(chǎn)過(guò)程時(shí)，調(diào)節(jié)抗體糖鏈含量是可能的。具體地，在韓國(guó)或其他國(guó)家尚無(wú)關(guān)于甘油對(duì)α巖藻糖基化效應(yīng)的研究或文獻(xiàn)?；谏鲜鰧?shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)明人首次開發(fā)了使用甘油調(diào)節(jié)糖鏈含量來(lái)制備抗體的方法。

本發(fā)明中，可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法在適合表達(dá)抗體的細(xì)胞的溫度、介質(zhì)和氣體條件下進(jìn)行培養(yǎng)?？捎糜诒景l(fā)明抗體制備的方法例如分批培養(yǎng)、進(jìn)料分批培養(yǎng)、持續(xù)培養(yǎng)或其組合等，但不限于此。

本發(fā)明的制備方法可包括步驟(a)在含有甘油和錳的介質(zhì)中培養(yǎng)表達(dá)抗體的細(xì)胞；和(b)在還含有尿苷的介質(zhì)中培養(yǎng)步驟(a)中培養(yǎng)的細(xì)胞。具體地，所述方法還可包括步驟(c)通過(guò)加入含有甘油和錳的進(jìn)料介質(zhì)培養(yǎng)步驟(b)中培養(yǎng)的細(xì)胞。步驟(a)可進(jìn)行3天到8天，并且本發(fā)明的實(shí)施例中尿苷處理在培養(yǎng)的第5天進(jìn)行。

本發(fā)明的制備方法還可包括步驟(a)在含有甘油和錳的介質(zhì)中培養(yǎng)表達(dá)抗體的細(xì)胞；(b)在還含有尿苷的介質(zhì)中培養(yǎng)步驟(a)中培養(yǎng)的細(xì)胞；和(c)使用含有甘油和錳的介質(zhì)進(jìn)行進(jìn)料分批培養(yǎng)。

同時(shí)，步驟(a)和步驟(b)可通過(guò)分批培養(yǎng)進(jìn)行，而步驟(c)可通過(guò)進(jìn)料分批培養(yǎng)進(jìn)行，但不限于此。

此外，本發(fā)明的制備方法還可包括從細(xì)胞培養(yǎng)液中純化抗體的步驟，并且純化抗體的方法可通過(guò)本領(lǐng)域公知的多種方法例如蛋白質(zhì)A/G柱、HPLC等進(jìn)行。

本發(fā)明的介質(zhì)可包含的甘油在從0％到10％的范圍內(nèi)或者在從0.1％到5％(v/v)的范圍內(nèi)，特別是在0.5％到3％(v/v)的濃度范圍內(nèi)。此外，所述介質(zhì)可包含的錳在從0μM到250μM的濃度范圍內(nèi)或者從10μM到200μM的濃度范圍內(nèi)，特別是在從20μM到120μM的濃度范圍內(nèi)。此外，所述介質(zhì)可包含的尿苷在從0mM到20mM的濃度范圍內(nèi)或者從1mM到10mM的濃度范圍內(nèi)，特別是從4mM到8mM的濃度范圍內(nèi)。

具體地，本發(fā)明的介質(zhì)可包含的甘油在從0.5％到3％(v/v)濃度范圍內(nèi)，包含的錳在從20μM到120μM濃度范圍內(nèi)，包含的尿苷在從3mM到10mM濃度范圍內(nèi)。

本發(fā)明錳的類型不受限制，只要對(duì)人體無(wú)毒性即可，例如氯化錳。

對(duì)于本發(fā)明的介質(zhì)中包含的可調(diào)節(jié)糖鏈含量的添加劑，基于介質(zhì)的終濃度，甘油(％,v/v)：錳(μM)的比率可以是0.5:20、1:20、2:20、3:20、0.5:40、1:40、2:40、3:40、0.5:80、1:80、2:80、3:80、0.5:120、1:120、2:120或3:120。此外，本發(fā)明中，基于介質(zhì)的終濃度，可包含在本發(fā)明的介質(zhì)中并組成可調(diào)節(jié)糖鏈含量的添加劑的尿苷可加入的濃度為2到8mM。

本發(fā)明一個(gè)具體的實(shí)施方案中，經(jīng)證實(shí)當(dāng)本發(fā)明的可調(diào)節(jié)糖鏈含量的添加劑基于介質(zhì)的終濃度具有的甘油(％,v/v)：錳(μM)：尿苷(mM)的比率為1.0:40:80或2.0:40:80時(shí)，糖鏈含量類似于已知的對(duì)照藥物可獲得的糖鏈含量。

通過(guò)本發(fā)明的制備方法制備的抗體的糖鏈含量中，半乳糖基化含量可以在從35％到50％的范圍內(nèi)，α巖藻糖基化含量可在從8％到20％的范圍內(nèi)。

本發(fā)明另一方面提供了通過(guò)本發(fā)明的方法制備的具有調(diào)節(jié)的糖鏈含量的抗體群。

所述方法、抗體群和具有調(diào)節(jié)的糖鏈含量的抗體群如上所述。

本發(fā)明另一方面提供了可調(diào)節(jié)糖鏈含量的方法，所述方法包括在含有甘油作為調(diào)節(jié)抗體糖鏈含量添加劑的介質(zhì)中培養(yǎng)可表達(dá)抗體的細(xì)胞的步驟。所述介質(zhì)還可包括選自包含作為調(diào)節(jié)糖鏈含量的添加劑的錳和尿苷的組中的一種或多種。

糖鏈含量、抗體、表達(dá)抗體的細(xì)胞和培養(yǎng)如上所述。

本發(fā)明另一方面提供了可調(diào)節(jié)抗體糖鏈含量的介質(zhì)組合物，所述介質(zhì)組合物包含甘油作為調(diào)節(jié)抗體糖鏈含量的添加劑。

糖鏈含量和抗體如上所述。

本發(fā)明的可調(diào)節(jié)抗體糖鏈含量的介質(zhì)組合物還可包含選自包括作為調(diào)節(jié)抗體糖鏈含量的添加劑的錳和尿苷的組中的一種或多種。

本文中，術(shù)語(yǔ)“介質(zhì)”廣義地是指可為增殖細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)物的含營(yíng)養(yǎng)物溶液，所述溶液可包含通常為細(xì)胞增殖和/或存活所需要的必須氨基酸和非必須氨基酸、維生素、碳源、脂類、微量元素等，但不限于此。依據(jù)要培養(yǎng)的細(xì)胞類型，所述介質(zhì)優(yōu)選地在適于細(xì)胞存活和增殖的pH和鹽濃度下依據(jù)配方制備。所述介質(zhì)還可包括本領(lǐng)域廣泛用作可增強(qiáng)增殖和/或存活的組分，包括激素和生長(zhǎng)因子。

此外，除可調(diào)節(jié)抗體糖鏈含量的添加劑外，本發(fā)明的介質(zhì)中的組分還可包含本領(lǐng)域廣泛用于產(chǎn)生抗體的任意組分以及本領(lǐng)域技術(shù)人員依據(jù)常識(shí)或?qū)嶒?yàn)可容易地構(gòu)成的組分。

本發(fā)明一個(gè)具體的實(shí)施方案中，主培養(yǎng)是基于介質(zhì)A通過(guò)控制添加劑而進(jìn)行的，而進(jìn)料分批培養(yǎng)是基于進(jìn)料C通過(guò)控制添加劑而進(jìn)行的。

下文中，將參考實(shí)施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明。但是，所述實(shí)施例僅用于說(shuō)明目的，而不意圖通過(guò)所述實(shí)施例限定本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1：添加劑調(diào)節(jié)抗體糖鏈的實(shí)驗(yàn)

1-1.用于選擇可誘導(dǎo)α巖藻糖基化添加劑的玻瓶培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

為誘導(dǎo)半乳糖基化，在加入糖結(jié)構(gòu)單元(葡萄糖胺、N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰甘露糖胺、半乳糖、尿苷、錳(Mn²⁺)、甘油)的條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。如圖35實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的測(cè)定結(jié)果所示，檢測(cè)到顯著的半乳糖基化效應(yīng)，但是也檢測(cè)到高α巖藻糖基化含量?；谒鼋Y(jié)果，在隨后的研究中使用已知可產(chǎn)生半乳糖基化相關(guān)效應(yīng)的半乳糖+錳(Mn²⁺)的組合，并檢測(cè)變化。此外，為尋找單獨(dú)使用時(shí)具有效應(yīng)的因子，在排除半乳糖+錳(Mn²⁺)的條件下進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)。

具體而言，在加入錳(Mn²⁺)和半乳糖以及可誘導(dǎo)α巖藻糖基化的添加劑的條件下和在加入可誘導(dǎo)α巖藻糖基化的添加劑但不加入錳(Mn²⁺)和半乳糖的條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

制備并使用200g/L半乳糖儲(chǔ)存液，并制備和使用40mM MnCl₂·4H₂O(Mn²⁺)儲(chǔ)存液。加入生產(chǎn)介質(zhì)中的錳和半乳糖是基于35mL(主要玻瓶培養(yǎng)物的體積)稀釋的，將每種條件的進(jìn)料介質(zhì)分別分為20mL，并且基于20mL體積稀釋儲(chǔ)存液并加入。

對(duì)于可誘導(dǎo)α巖藻糖基化的添加劑葡萄糖胺和N-乙酰葡萄糖胺各制備1M儲(chǔ)存液，且將純甘油視為100％并以體積比(v/v,％)加入，制備50mM丁酸鈉儲(chǔ)存液和50g/L乳糖儲(chǔ)存液，并1/100稀釋。幾夫堿作為α甘露糖苷酶I抑制劑是已知具有α巖藻糖基化效應(yīng)的物質(zhì)，并以100μg/mL(Qun Zhou et al.,2008；US 2007/0092521 A1)的濃度制備。

實(shí)驗(yàn)條件概述見下表1。

表1可誘導(dǎo)α巖藻糖基化添加劑的玻瓶實(shí)驗(yàn)條件

1-2.可誘導(dǎo)α巖藻糖基化的添加劑玻瓶實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果

在選擇可誘導(dǎo)α巖藻糖基化的添加劑的玻瓶實(shí)驗(yàn)中，測(cè)定了細(xì)胞生長(zhǎng)譜、細(xì)胞存活率譜和最終表達(dá)水平譜(效價(jià)譜)。

如圖3所示，細(xì)胞生長(zhǎng)譜結(jié)果顯示，當(dāng)不加入錳和半乳糖(對(duì)照)時(shí)檢測(cè)到最高的細(xì)胞生長(zhǎng)，當(dāng)加入0.5mM丁酸鈉時(shí)檢測(cè)到生長(zhǎng)抑制。

如圖4所示，細(xì)胞存活率譜結(jié)果也顯示，當(dāng)加入丁酸鈉時(shí)在培養(yǎng)終點(diǎn)細(xì)胞存活率減低至80％或更低，當(dāng)同時(shí)加入10ng/mL幾夫堿與錳和半乳糖時(shí)在培養(yǎng)終點(diǎn)細(xì)胞存活率減低至77％。其他添加劑條件顯示出相似的細(xì)胞生長(zhǎng)譜和細(xì)胞存活率譜。

同時(shí)，測(cè)定了在可誘導(dǎo)α巖藻糖基化的添加劑條件下相對(duì)于對(duì)照組的最終表達(dá)水平(效價(jià)譜)，結(jié)果當(dāng)加入葡萄糖胺和N-乙酰葡萄糖胺或甘油時(shí)，與對(duì)照組相比表達(dá)水平提高1.1倍。相反地，當(dāng)加入丁酸鈉時(shí)，表達(dá)水平提高0.8倍，這低于其他條件下的值?？赡芩霰磉_(dá)水平的減低是因?yàn)榧?xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞存活率的下降。

1-3.抗體糖鏈含量測(cè)定

為測(cè)定抗體糖鏈含量，進(jìn)行了抗體N-聚糖測(cè)定。具體而言，依據(jù)HD201N-聚糖測(cè)定的SOP[HD201的N-聚糖NP-UPLC測(cè)定]進(jìn)行N-聚糖測(cè)定，使用肽N-糖苷酶(PNGase)處理抗體以只分離N-聚糖結(jié)構(gòu)。測(cè)定了半乳糖基化糖型和α巖藻糖基化糖型，每種計(jì)算的相對(duì)含量如圖所示(圖6和7)。此外，與未加入添加劑的對(duì)照相比，半乳糖基化和α巖藻糖基化的提高和減低如圖所示(圖8)。

如圖6到8所示，加入錳和半乳糖的條件與未加入添加劑的條件最大的差異是半乳糖基化含量的不同，并且與未加入添加劑的對(duì)照相比加入所述兩種物質(zhì)時(shí)檢測(cè)到高的相對(duì)半乳糖基化含量。相反地，與對(duì)照組相比當(dāng)未加入所述兩種物質(zhì)時(shí)檢測(cè)到相似或者較低的相對(duì)半乳糖基化含量。所述結(jié)果表明，錳和半乳糖都是提高半乳糖基化含量所需要的。

1-4.根據(jù)錳(M)、半乳糖和尿苷(Urd)單獨(dú)或組合處理產(chǎn)生的抗體糖鏈改變的實(shí)驗(yàn)

作為調(diào)節(jié)抗體糖鏈含量的方法，使用錳和半乳糖的方法已被公開(例如Abbott,US 2012/0276631；WO 2012/149197)。本實(shí)驗(yàn)意圖尋找錳和半乳糖的其他替代物。

舊方法是在開發(fā)早期的產(chǎn)生用于第I階段臨床試驗(yàn)的樣本的方法，而新方法是通過(guò)方法改進(jìn)開發(fā)的用于第III階段臨床試驗(yàn)的方法。新方法和舊方法的區(qū)別在于生產(chǎn)介質(zhì)和進(jìn)料介質(zhì)，并且本發(fā)明的添加劑意圖用于通過(guò)制備糖鏈模式提高抗體活性，具體地，在開發(fā)新方法過(guò)程中使α巖藻糖基化含量類似于原產(chǎn)品的α巖藻糖基化含量。

制備并使用200g/L半乳糖儲(chǔ)存液，以及制備并使用40mM MnCl₂·4H₂O(Mn²⁺)儲(chǔ)存液。加入到生產(chǎn)介質(zhì)中的錳和半乳糖是基于35mL(主要玻瓶培養(yǎng)物的體積)稀釋的，將每種條件的進(jìn)料介質(zhì)分為20mL，并且基于20mL體積稀釋儲(chǔ)存液并加入。

實(shí)驗(yàn)條件見下表2

表2錳(Mn²⁺)、半乳糖(Gal)和尿苷(Urd)的加入條件

如圖9所示，玻瓶培養(yǎng)的結(jié)果顯示，當(dāng)加入錳和半乳糖時(shí)大多數(shù)細(xì)胞生長(zhǎng)譜是相似的，當(dāng)不加入添加劑(對(duì)照)并只加入40μM錳時(shí)檢測(cè)到最高峰的細(xì)胞密度。當(dāng)加入尿苷(Urd)的濃度為8mM時(shí)，在培養(yǎng)早期檢測(cè)到生長(zhǎng)抑制，而當(dāng)加入尿苷的濃度為4mM時(shí)，在培養(yǎng)后期細(xì)胞密度減低被大大地提高。

在細(xì)胞存活率譜(圖10)中，當(dāng)加入8mM尿苷時(shí)存活率迅速減低，而其他條件下顯示出相似的模式。

如圖11的抗體表達(dá)水平譜(效價(jià)譜)所示，加入錳的條件與未加入添加劑條件(對(duì)照)相比顯示出約0.9～1.1的相對(duì)含量比率，而加入半乳糖條件顯示出0.9～1.0的相對(duì)含量比率。當(dāng)加入尿苷時(shí)，相對(duì)于未加入添加劑的條件(對(duì)照)的表達(dá)水平減低隨尿苷濃度的升高而升高。與未加入添加劑的條件(對(duì)照)相比，當(dāng)加入8mM尿苷時(shí)相對(duì)含量比率減低至0.36，表明所述減低歸因于由于細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的導(dǎo)致表達(dá)水平減低。因此，證實(shí)了加入錳的濃度在40μM～120μM范圍內(nèi)時(shí)，對(duì)所述方法無(wú)影響。

1-5.抗體糖鏈含量的測(cè)定

如表2的條件，將不同濃度的錳、半乳糖和尿苷加入玻瓶中，檢測(cè)了培養(yǎng)產(chǎn)物的糖鏈含量(糖基化質(zhì)量)。具體而言，測(cè)定了半乳糖基化糖型和α巖藻糖基化糖型，每種計(jì)算的相對(duì)含量如圖表所示(圖12和13)。此外，與未加入添加劑的對(duì)照相比的半乳糖基化和α巖藻糖基化的提高和減低的測(cè)定結(jié)果如圖表所示(圖14)。

如圖12所示，計(jì)算半乳糖基化含量的結(jié)果顯示，當(dāng)同時(shí)加入40μM錳和2g/L半乳糖時(shí)，與對(duì)照(未加入添加劑的條件)相比檢測(cè)到最高含量，所述三種物質(zhì)單獨(dú)加入時(shí)加入錳的實(shí)驗(yàn)組顯示出比加入半乳糖或加入尿苷的實(shí)驗(yàn)組更高的值，表明新方法中錳是半乳糖基化的主要因子。相反地，單獨(dú)加入尿苷時(shí)，半乳糖基化含量隨尿苷濃度的升高而升高。但是，在高濃度條件(8mM)下，檢測(cè)到生長(zhǎng)抑制和表達(dá)水平減低，因此認(rèn)為新方法中在培養(yǎng)早期加入高濃度尿苷是不適當(dāng)?shù)摹?/p>

如圖13中計(jì)算的α巖藻糖基化含量的結(jié)果所示，比較了錳、半乳糖和尿苷三種物質(zhì)。結(jié)果證實(shí)了，錳和半乳糖顯示出無(wú)效果，但是α巖藻糖基化隨尿苷濃度的升高而升高。在顯示與未加入添加劑的組相比的半乳糖基化/α巖藻糖基化差異的圖表(圖14)中，證實(shí)了與未加入添加劑組相比當(dāng)加入錳時(shí)半乳糖基化提高到10％或更高，并且與未加入添加劑組相比α巖藻糖基化隨尿苷濃度的升高而升高。

依據(jù)新方法中所述檢測(cè)錳、半乳糖和尿苷添加作用的結(jié)果，證實(shí)了錳是抗體半乳糖基化中最重要的因子，并且當(dāng)尿苷取代半乳糖時(shí)，可得到半乳糖基化和α巖藻糖基化的提高。

開發(fā)生物仿制藥的后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，將錳、尿苷和甘油組合加入，以提高等價(jià)于商業(yè)對(duì)照藥物的半乳糖基化/α巖藻糖基化。

1-6.依據(jù)甘油加入改變糖鏈的玻瓶培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

該實(shí)驗(yàn)中，除錳和半乳糖外，將通過(guò)選擇可誘導(dǎo)α巖藻糖基化的添加劑得到的甘油(Gcr)以不同濃度加入，并檢測(cè)其效果。

甘油是眾所周知的作為抗凍劑和蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑的物質(zhì)，已有文獻(xiàn)報(bào)道顯示甘油可提高重組蛋白的表達(dá)水平或唾液酸含量(Rodriguez et al.2005,Chi-Hsien Liu 2007)，但是未提及與本發(fā)明相關(guān)的抗體α巖藻糖基化。

因此，為檢測(cè)甘油對(duì)抗體α巖藻糖基化的影響，進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。具體而言，加入甘油的濃度為0、0.5、1或2％(v/v)，并依據(jù)甘油加入檢測(cè)α巖藻糖基化含量。

實(shí)驗(yàn)條件如下表3。

表3可誘導(dǎo)α巖藻糖基化添加劑-甘油的玻瓶培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)條件

測(cè)定了依據(jù)甘油濃度的細(xì)胞生長(zhǎng)譜和細(xì)胞存活率譜。如圖15結(jié)果所示，在加入甘油的條件下和未加入甘油的條件下檢測(cè)到相似的細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞存活率。經(jīng)證實(shí)，在培養(yǎng)的最后一天細(xì)胞存活率與未添加的條件相比略低。

此外，如圖16的測(cè)定最終抗體表達(dá)水平的結(jié)果所示，與未加入甘油的條件相比，抗體表達(dá)水平隨甘油濃度升高而升高。當(dāng)加入2.0％甘油時(shí)，表達(dá)水平提高1.1倍或更高，其被記為最高相對(duì)含量比率。

1-7.抗體糖鏈含量測(cè)定

在表3條件下，測(cè)定了依據(jù)甘油濃度的半乳糖基化糖鏈含量和α巖藻糖基化糖鏈含量。

如圖17所示，隨著甘油濃度增加，半乳糖基化略微減低，但是半乳糖基化抗體含量保持在40％或更高，表明無(wú)大的影響(圖17(A))，對(duì)于α巖藻糖基化，隨著甘油濃度升高α巖藻糖基化抗體含量與對(duì)照(未加入甘油組)相比顯著升高(圖17(B))。

1-8.新方法中可共誘導(dǎo)半乳糖基化和α巖藻糖基化的添加劑混合物玻瓶培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

通過(guò)使用上述實(shí)施例中獲得的添加劑條件實(shí)驗(yàn)結(jié)果的組合，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以檢測(cè)在何種條件下最終制備的抗體群與對(duì)照藥物相比顯示出最相似的糖鏈含量，即的半乳糖基化和α巖藻糖基化含量。

本實(shí)驗(yàn)中，將可提高半乳糖基化的主要因子錳(M)、可誘導(dǎo)α巖藻糖基化的添加劑甘油(Gcr)以及作為半乳糖基化和α巖藻糖基化的輔因子的半乳糖的替代物尿苷(Urd)用作添加劑。

同時(shí)，上述實(shí)驗(yàn)(實(shí)施例1-4)顯示加入4mM或更高濃度的尿苷可促進(jìn)α巖藻糖基化但通過(guò)生長(zhǎng)抑制而減低表達(dá)水平。因此，本實(shí)驗(yàn)中按照下表4的實(shí)驗(yàn)條件在主培養(yǎng)的第5天單獨(dú)加入4mM尿苷以最小化生長(zhǎng)抑制和高甘露糖形式。

上述實(shí)驗(yàn)(實(shí)施例1-4)證實(shí)了錳(M)具有最高的促進(jìn)半乳糖基化效應(yīng)，并且在40到120μM濃度范圍顯示出相似的效應(yīng)。

本實(shí)驗(yàn)中，將40μM或更少的錳加入至生產(chǎn)介質(zhì)或進(jìn)料介質(zhì)中。

最后，將甘油以1％和2％的濃度只加入生產(chǎn)介質(zhì)中，這在上述甘油加入實(shí)驗(yàn)中顯示出效果(實(shí)施例1-6)。

實(shí)驗(yàn)條件概述見下表4。

表4新方法中誘導(dǎo)半乳糖基化和α巖藻糖基化添加劑混合物的玻瓶培養(yǎng)條件

圖18示出了在表4條件下檢測(cè)的通過(guò)玻瓶培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)譜和細(xì)胞存活率譜的結(jié)果，當(dāng)加入錳(M)時(shí)多數(shù)細(xì)胞的生長(zhǎng)譜是相似的，但是加入2％甘油比加入1％甘油顯示出較低的細(xì)胞生長(zhǎng)速率。在未加入甘油的條件(40μM錳+2.0g/L半乳糖)下和加入1％甘油條件下檢測(cè)到相似的峰值細(xì)胞密度，表明在舊方法中加入1％甘油不影響細(xì)胞生長(zhǎng)效率。由于尿苷是在主培養(yǎng)的第5天加入的，在培養(yǎng)早期未發(fā)生生長(zhǎng)抑制，但是與未加入尿苷的條件相比加入尿苷后細(xì)胞存活率減低增強(qiáng)了。

檢測(cè)最終表達(dá)水平的結(jié)果(圖19)顯示，除未加入甘油和尿苷的條件(40μM錳+2.0g/L半乳糖)以外，其他條件顯示出相似或更高的表達(dá)水平。

1-9.抗體糖鏈含量測(cè)定

依據(jù)表4條件下的添加劑組合測(cè)定了半乳糖基化糖鏈含量和α巖藻糖基化糖鏈含量。具體而言，N-聚糖測(cè)定譜的峰面積計(jì)算為半乳糖基化含量和α巖藻糖基化含量。

如圖20所示，與未加入尿苷的條件相比，在基于40μM錳+1％甘油組合在培養(yǎng)的第5天加入尿苷的條件下半乳糖基化含量提高。至于α巖藻糖基化，與未加入尿苷的條件相比，當(dāng)加入4mM尿苷時(shí)α巖藻糖基化含量提高。與未加入尿苷的條件相比，在基于40μM錳+2％甘油組合在培養(yǎng)的第5天加入尿苷的條件下半乳糖基化含量提高。至于α巖藻糖基化，與未加入尿苷的條件相比，當(dāng)加入4mM尿苷時(shí)α巖藻糖基化含量提高。具體地，α巖藻糖基化含量提高與加入的甘油量成比例。

與未加入尿苷的條件相比，在基于20μM錳+1％甘油組合在培養(yǎng)的第5天加入尿苷的條件下半乳糖基化含量提高。至于α巖藻糖基化，與未加入尿苷的條件相比，α巖藻糖基化含量提高。在基于20μM錳+2％甘油組合加入尿苷的條件下檢測(cè)到相似的模式。

總之，經(jīng)證實(shí)，新方法中加入尿苷可提高半乳糖基化，因此尿苷可替代半乳糖。還證實(shí)了尿苷可輕微提高α巖藻糖基化。

作為對(duì)照組，只將2.0g/L半乳糖加入新方法中，并依據(jù)錳、甘油和尿苷的條件檢測(cè)了半乳糖基化/α巖藻糖基化差異(百分比變化)。圖21的結(jié)果顯示，加入錳后半乳糖基化含量提高到6～13％，加入甘油后α巖藻糖基化含量提高到1.5～4％。

實(shí)施例2:在生物反應(yīng)器水平的添加劑調(diào)節(jié)糖鏈實(shí)驗(yàn)

基于實(shí)施例1的玻瓶培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，檢測(cè)了在生物反應(yīng)器中是否可以調(diào)節(jié)抗體糖鏈。

2-1.通過(guò)改變甘油濃度的生物反應(yīng)器實(shí)驗(yàn)

為參照上述實(shí)施例1-6玻瓶培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果通過(guò)加入甘油檢測(cè)α巖藻糖基化，在反應(yīng)器水平實(shí)施本發(fā)明。

如實(shí)施例1-6，只在生產(chǎn)介質(zhì)中加入1％和2％(v/v)濃度的甘油，見下表5。加入生產(chǎn)介質(zhì)中的甘油是通過(guò)基于主要反應(yīng)器培養(yǎng)物的體積3.5L將純?nèi)芤?100％)稀釋制備的，并且在進(jìn)料介質(zhì)中未加入甘油。意圖是將添加劑例如錳和甘油用于在開發(fā)新方法的過(guò)程中獲得類似對(duì)照藥物的半乳糖基化含量和α巖藻糖基化含量。

反應(yīng)器水平的實(shí)驗(yàn)條件概述見下表5。

表5通過(guò)改變甘油濃度的生物反應(yīng)器實(shí)驗(yàn)條件

在生物反應(yīng)器中在表5條件下進(jìn)行培養(yǎng)，并測(cè)定了細(xì)胞生長(zhǎng)譜和細(xì)胞存活率譜。如圖22中的結(jié)果，與加入2％甘油相比加入1％甘油顯示出高細(xì)胞生長(zhǎng)譜(約10％差異，基于峰值細(xì)胞密度)，并且顯示出與未加入添加劑條件相似的高細(xì)胞生長(zhǎng)譜。

最終相對(duì)表達(dá)水平結(jié)果(圖23)顯示，與未加入添加劑的組相比，在培養(yǎng)的最后一天所有加入甘油的組顯示出高最終相對(duì)表達(dá)水平。

2-2.抗體糖鏈含量測(cè)定

依據(jù)表5條件下的添加劑組合測(cè)定半乳糖基化糖鏈含量和α巖藻糖基化糖鏈含量。具體而言，將在2種單位(加入1％或2％甘油)的生物反應(yīng)器中培養(yǎng)了8天的培養(yǎng)液中的N-聚糖測(cè)定結(jié)果計(jì)算為半乳糖基化含量(A)和α巖藻糖基化含量(B)。

如圖24所示，向生產(chǎn)介質(zhì)中加入2％甘油而非加入1％甘油的反應(yīng)器培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示出α巖藻糖基化含量提高。

如圖25所示，測(cè)定相對(duì)于對(duì)照組(無(wú)錳、半乳糖和甘油加入)的半乳糖基化含量/α巖藻糖基化含量結(jié)果顯示，與未加入添加劑的對(duì)照組相比添加劑可提高半乳糖基化至12％或更高，并且可提高α巖藻糖基化至1.5％。如圖34所示，提高α巖藻糖基化含量的效應(yīng)比之前第I階段臨床試驗(yàn)的樣本高約2倍。

2-3.新方法最終的添加劑選擇及3組生物反應(yīng)器實(shí)驗(yàn)

如實(shí)施例2-2所證實(shí)，加入2％甘油與未加入添加劑條件相比顯示出可提高N-聚糖譜的α巖藻糖基化效應(yīng)，并且如實(shí)施例1所證實(shí)，加入錳和尿苷顯示出可提高半乳糖基化效應(yīng)。對(duì)于對(duì)照藥物的等價(jià)物，將甘油加入生產(chǎn)介質(zhì)和進(jìn)料介質(zhì)中，并在培養(yǎng)的第5天加入濃度為8mM的尿苷。進(jìn)行3組重復(fù)的培養(yǎng)。

具體而言，在上述實(shí)驗(yàn)(實(shí)施例2-1)中將甘油只加入生產(chǎn)介質(zhì)中，但是為了提高添加作用，還將2％甘油加入進(jìn)料介質(zhì)中用于進(jìn)料。當(dāng)從培養(yǎng)起始就加入高濃度甘油時(shí)，關(guān)系到生長(zhǎng)抑制。因此，向進(jìn)料介質(zhì)中等量加入2％甘油，意圖消除進(jìn)料產(chǎn)生的稀釋效應(yīng)。

對(duì)于錳和半乳糖，將尿苷取代半乳糖，并且為提高半乳糖基化效應(yīng)將尿苷濃度從4mM提高到8mM。此外，在加入尿苷的玻瓶培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，測(cè)定了培養(yǎng)最后一天的pH。結(jié)果，pH約為pH 6.9。在該實(shí)驗(yàn)中，加入尿苷后，培養(yǎng)物pH從pH 6.8升高到pH 6.9，因?yàn)閜H可引起玻瓶培養(yǎng)和生物反應(yīng)器培養(yǎng)之間添加劑濃度效應(yīng)的差異。

當(dāng)意圖將反應(yīng)器中的pH保持在6.8時(shí)，從培養(yǎng)的第4天開始傾向于持續(xù)增加pCO₂，并在培養(yǎng)的第5天迅速升高到100mmHg或更高。因此，參考高pCO₂可負(fù)調(diào)節(jié)糖基化的文獻(xiàn)報(bào)道(Kimura R,1997)，預(yù)期在培養(yǎng)的第5天當(dāng)主培養(yǎng)物pH升高到pH 6.9時(shí)可減低pCO₂。

基于所述事實(shí)的實(shí)驗(yàn)條件概述見下表6。對(duì)于下述條件，所有3組通過(guò)加入可調(diào)節(jié)糖鏈含量的添加劑而被同樣地執(zhí)行(質(zhì)量提高)，將40μM錳(M)和2％(v/v)甘油(Gcr)加入至生產(chǎn)介質(zhì)(介質(zhì)A)，并且在主培養(yǎng)的第5天加入8mM尿苷(Urd)，繼續(xù)培養(yǎng)。

表6用于新方法添加劑的最終選擇及3組生物反應(yīng)器實(shí)驗(yàn)的條件

如圖26，示出了在表6的條件下在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)譜和細(xì)胞存活率譜的測(cè)定結(jié)果，細(xì)胞生長(zhǎng)譜顯示峰值細(xì)胞密度是約(18-24)×10⁶個(gè)細(xì)胞/mL，與未加入添加劑的對(duì)照組結(jié)果相似。

結(jié)果，主培養(yǎng)的最后一天最終相對(duì)表達(dá)水平(圖27)約為1.05，比未加入添加劑的對(duì)照組結(jié)果略高或與其相似。

2-4.抗體糖鏈含量測(cè)定

測(cè)定了通過(guò)新方法在表6中的基于40μM錳和2％甘油在培養(yǎng)的第5天加入8mM尿苷的條件下由3組生物反應(yīng)器培養(yǎng)產(chǎn)生的HD201抗體的半乳糖基化糖鏈含量和α巖藻糖基化糖鏈含量。具體而言，將每組和未加入添加劑的對(duì)照組的主培養(yǎng)第8天的樣本的N-聚糖譜進(jìn)行比較。結(jié)果，對(duì)照組的半乳糖基化(所有含半乳糖的低聚糖總和)％是31.8％，新方法3個(gè)組的半乳糖基化(所有含半乳糖的低聚糖總和)％是41.8％到42.2％，顯示出約10％提高。此外，未加入添加劑對(duì)照組的α巖藻糖基化(所有不含巖藻糖的低聚糖總和)％是6.1％，新方法3個(gè)組的α巖藻糖基化(所有不含巖藻糖的低聚糖總和)％是9.1～9.5％，顯示出約3％提高。

將所述結(jié)果與對(duì)照藥物的結(jié)果相比較。結(jié)果，對(duì)照藥物批號(hào)H0717)的半乳糖基化％是43％，與新方法3個(gè)組的結(jié)果相比差異為2％或更低，對(duì)照藥物的α巖藻糖基化％是8.9％，與新方法的結(jié)果相比差異為1％或更低，表明在等價(jià)于對(duì)照藥物方面具有非常優(yōu)異的效果。

2-5.添加劑組合物應(yīng)用于舊方法的效果

檢測(cè)了當(dāng)將新方法中開發(fā)的添加劑組合物(錳、甘油和尿苷)通過(guò)上述實(shí)施例在小規(guī)模生物反應(yīng)器中應(yīng)用于舊方法時(shí)是否能夠調(diào)節(jié)需要的糖基化譜(半乳糖基化/α巖藻糖基化)，從而證實(shí)是否添加劑在舊方法中可顯示出與新方法相似的效應(yīng)。

將2％甘油加入新方法中的生產(chǎn)介質(zhì)和進(jìn)料介質(zhì)中，但是在舊方法中將甘油濃度提高到3％，然后檢測(cè)加入甘油濃度的提高產(chǎn)生的α巖藻糖基化含量的提高。同時(shí)，加入與新方法相同濃度的錳和尿苷。

具體而言，在小規(guī)模的第I階段臨床試驗(yàn)中，將40μM錳(M)和3％(v/v)甘油(Gcr)作為用于調(diào)節(jié)糖鏈含量的添加劑(質(zhì)量提高添加劑)加入生產(chǎn)介質(zhì)(介質(zhì)D)中，并且將與在生產(chǎn)介質(zhì)中相同濃度的錳和甘油加入進(jìn)料介質(zhì)(進(jìn)料A)中。在新方法中，將40μM錳(M)和3％(v/v)甘油(Gcr)作為用于調(diào)節(jié)糖鏈含量(Fc N-聚糖質(zhì)量提高)的添加劑分別加入生產(chǎn)介質(zhì)(介質(zhì)A)和進(jìn)料介質(zhì)(進(jìn)料C)中。將在舊方法和新方法中在主培養(yǎng)的第5天等量加入8mM尿苷(Urd)而培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)組與未加入調(diào)節(jié)糖鏈含量(提高Fc N-聚糖質(zhì)量)添加劑的對(duì)照組相比較。

實(shí)驗(yàn)條件概述見下表7。

表7添加劑應(yīng)用于新方法和舊方法的條件

在表7的條件下進(jìn)行生物反應(yīng)器培養(yǎng)以測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)譜和細(xì)胞存活率譜。如圖30所示，未加入添加劑的新方法和加入添加劑的新方法之間峰值細(xì)胞密度的差異是約24％細(xì)胞生長(zhǎng)譜，并且檢測(cè)到加入添加劑產(chǎn)生的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制。舊方法中也檢測(cè)到加入添加劑產(chǎn)生的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制。其解釋為，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制是由在添加劑中加入3％甘油引起的，并且以前的實(shí)驗(yàn)顯示細(xì)胞生長(zhǎng)抑制傾向于隨著甘油濃度的提高而提高。

通過(guò)比較未加入添加劑的舊方法和未加入添加劑的新方法以及比較加入添加劑的舊方法和加入添加劑的新方法，證實(shí)了新方法和舊方法之間細(xì)胞生長(zhǎng)譜的差異。未加入添加劑條件之間的峰值細(xì)胞密度差異是約34％，表明新方法中檢測(cè)到大細(xì)胞量。此外，加入添加劑條件之間的峰值細(xì)胞密度差異是約28％，并且新方法顯示出比舊方法更高的峰值細(xì)胞密度。舊方法中，主培養(yǎng)進(jìn)行7天，因此在小規(guī)模的組中的培養(yǎng)也進(jìn)行7天。

加入添加劑條件和未加入添加劑條件在培養(yǎng)終點(diǎn)時(shí)的細(xì)胞存活率(B)保持在80％或更高。據(jù)認(rèn)為，未加入添加劑的舊方法中培養(yǎng)5天后存活率的高減低比率是由于培養(yǎng)3天后葡萄糖消耗。

最終相對(duì)表達(dá)水平的結(jié)果(圖31)顯示，舊方法無(wú)論是否加入添加劑在培養(yǎng)的第7天都顯示出相似的模式，而新方法中加入添加劑條件比未加入添加劑條件的表達(dá)水平低13％。新方法的表達(dá)水平相對(duì)于舊方法的表達(dá)水平是1.8，表明產(chǎn)率提高80％或更高。

2-6.抗體糖鏈含量測(cè)定

測(cè)定了在表7條件下產(chǎn)生的抗體的半乳糖基化糖鏈含量和α巖藻糖基化糖鏈含量。進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)以比較在新方法和舊方法中加入或者未加入調(diào)節(jié)糖鏈含量(質(zhì)量提高)添加劑(錳、甘油和尿苷)的條件。

具體而言，通過(guò)N-聚糖測(cè)定檢測(cè)了生物反應(yīng)器培養(yǎng)樣本產(chǎn)物的糖基化含量(糖基化質(zhì)量)，并說(shuō)明了半乳糖基化含量和α巖藻糖基化含量的結(jié)果。比較了在舊方法中加入添加劑條件和未加入添加劑條件的從主培養(yǎng)物回收的樣本的N-聚糖譜。結(jié)果，加入添加劑條件的半乳糖基化含量(％)是43.8％，未加入添加劑條件的半乳糖基化含量(％)是43％，顯示出加入添加劑條件下提高約1％。加入添加劑條件的α巖藻糖基化含量(％)是18.7％，未加入添加劑條件的α巖藻糖基化含量(％)是9.1％，顯示出加入添加劑條件下提高約2倍。

在新方法中，將加入添加劑條件與未加入添加劑條件比較。結(jié)果加入添加劑條件的半乳糖基化含量(％)是40.5％，未加入添加劑條件的半乳糖基化含量(％)是31.8％，顯示出加入添加劑條件下提高約8％。加入添加劑條件的α巖藻糖基化含量(％)是14.1％，未加入添加劑條件的α巖藻糖基化含量(％)是6.1％，顯示出加入添加劑條件下提高約2倍，與舊方法類似。

所述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，使用不同介質(zhì)的情況下加入本發(fā)明的包含錳、甘油和尿苷的用于調(diào)節(jié)抗體糖鏈含量的添加劑在舊方法和新方法中可產(chǎn)生相似的效應(yīng)，表明相應(yīng)的添加劑可用于任意方法中而在介質(zhì)方面不受限制。

實(shí)施例3：檢測(cè)ADCC活性

依據(jù)抗體依賴性細(xì)胞毒性測(cè)定的SOP進(jìn)行了HD201抗體的ADCC活性測(cè)定[HD201抗體依賴性細(xì)胞毒性測(cè)定]。

通過(guò)相對(duì)ADCC測(cè)定(體外測(cè)定)檢測(cè)在小規(guī)模的舊方法和新方法中加入可調(diào)節(jié)糖鏈含量(改進(jìn)Fc N-聚糖質(zhì)量)的添加劑(錳、甘油和尿苷)制備的抗體的ADCC活性。將當(dāng)前可獲得的原始產(chǎn)物(H4158B03 150mg)用作ADCC活性的參照物(對(duì)照藥物)。

表8測(cè)定HD201抗體的ADCC活性

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示為由通常使用的EC₅₀值確定的相對(duì)ADCC％(A)和使用通過(guò)PLA s/w計(jì)算的相對(duì)活性比率的相對(duì)ADCC活性％(B)?？梢钥闯觯罁?jù)EC₅₀和PLA所得的結(jié)果之間略有不同，但整體模式一致。

在小規(guī)模的舊方法中，與對(duì)照藥物相比，加入添加劑條件的ADCC活性為217.5％，而未加入添加劑條件的ADCC活性為78.7％，低于對(duì)照藥物的ADCC活性。因此，將所述可調(diào)節(jié)糖鏈含量(Fc N-聚糖質(zhì)量改進(jìn))的添加劑(錳、甘油和尿苷)添加到舊方法中時(shí)，α巖藻糖基化比率可提高到2倍，致使ADCC活性與未加入添加劑條件相比提高100％或更高。新方法中，與對(duì)照藥物相比，加入添加劑條件的ADCC活性為130％；與對(duì)照藥物相比，未加入添加劑條件的ADCC活性為42.7％，是最低的活性。因此，由于舊方法使用不同的介質(zhì)，當(dāng)將可調(diào)節(jié)糖鏈含量(改進(jìn)Fc N-聚糖質(zhì)量)的添加劑(錳、甘油和尿苷)用于新方法時(shí)，α巖藻糖基化比率可提高到2倍，致使ADCC活性與未加入添加劑條件相比提高80％或更高。

總之，上述結(jié)果顯示，本發(fā)明首次闡明了通過(guò)使用甘油可提高抗體的α巖藻糖基化含量，并且開發(fā)了通過(guò)使用錳和尿苷以及甘油調(diào)節(jié)糖鏈含量的方法。

基于以上說(shuō)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，本發(fā)明可應(yīng)用于不同的具體形式而不改變其技術(shù)精神或?qū)嵸|(zhì)特征。因此，應(yīng)理解，上述實(shí)施方案是非限制性的，而是所有方面都是說(shuō)明性的。本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求書限定，而非由說(shuō)明書限定，因此落入權(quán)利要求書邊界和界限范圍內(nèi)的所有改變及修改或所述邊界和界限的等價(jià)方案都意圖包含在權(quán)利要求書內(nèi)。

發(fā)明效果

根據(jù)本發(fā)明的抗體的制備方法可用于通過(guò)調(diào)節(jié)抗體的糖鏈含量制備高質(zhì)量的抗體群。此外，對(duì)于開發(fā)生物仿制藥，本發(fā)明的方法可用于調(diào)節(jié)抗體的糖鏈含量，以此制備高等價(jià)于對(duì)照藥物的抗體。由于糖鏈含量可通過(guò)介質(zhì)組合物調(diào)節(jié)，所述調(diào)節(jié)方法在時(shí)間和成本方面是簡(jiǎn)單、有效的，因此廣泛應(yīng)用于抗體制備領(lǐng)域。