微管溶素是一類從粘細(xì)菌中分離的細(xì)胞抑制性四肽(賽斯F(Sasse F)等人抗體學(xué)雜志(J.Antibiotics)，2000，879)。微管溶素的共同特征是它們的四肽結(jié)構(gòu)，其中僅Ile是天然存在的氨基酸，并且另外三種是復(fù)雜的非天然氨基酸：Mep(R-N-Mepipecolic酸)，Tuv(管式纈氨酸(tubuvaline))和Tut(管式賴氨酸(tubulyrosine)或Tup(管式苯丙氨酸(tubuphenylalanine))。稍后描述了該家族的另外的成員(斯特尹默茲(Steinmettz)等人，應(yīng)用化學(xué)國(guó)際版(Angew.Chem.Int.Ed.)2004，4888)。大多數(shù)天然存在的微管溶素示出對(duì)抗與微管蛋白聚合抑制相關(guān)的癌細(xì)胞系的pM細(xì)胞毒活性。賽斯(Sasse)(何麗爾MW(Khalil MW)等人，化學(xué)生物學(xué)和生物化學(xué)(ChemBioChem)，2006，678)描述了微管溶素的作用機(jī)制，其示出，微管溶素A比β-微管蛋白結(jié)合劑(擬莖點(diǎn)霉毒素A(phomopsin)，尾海兔素和hemiasterlin)的其他長(zhǎng)春花結(jié)構(gòu)域更有效地抑制微管蛋白聚合。天然存在的微管溶素示出比尾海兔素更高的毒性。此外，報(bào)道了微管溶素A(卡爾G(Kaur G)等人，生物化學(xué)雜志(Biochem.J)，2006，235)在癌細(xì)胞系中誘導(dǎo)凋亡，并且在動(dòng)物模型中示出除了有效的抗腫瘤活性之外的抗血管生成活性。在這些發(fā)現(xiàn)之后，投入了大量的努力來尋找具有與天然存在的微管溶素可比較的效力的合成類似物。包含N,O-縮醛的Tuv的存在已經(jīng)對(duì)合成微管溶素提出了挑戰(zhàn)，并導(dǎo)致了對(duì)其穩(wěn)定性的關(guān)注。若干團(tuán)隊(duì)鑒定了用普通甲基替代N,O-縮醛而沒有顯著損失細(xì)胞毒性活性的合成類似物(帕特森，A(Patterson，A)等人，歐洲化學(xué)雜志(Chem.Eur.J.)2007，9534；維皮傅P(Wipf P)等人，有機(jī)化學(xué)通訊(Org.Lett.)2007，1605)。
若干報(bào)道披露了微管溶素與葉酸的綴合物(勒蒙CP(Leamon CP)等人，癌癥研究(Cancer Res.)2008，9839)，環(huán)糊精納米綴合物(蘇勒普TS(Schluep TS)等人，臨床癌癥研究(Clin.Cancer Res.)2009，15:181)連同樹枝狀大分子綴合物(福樂迪WC(Floyd WC)，化學(xué)醫(yī)學(xué)和醫(yī)學(xué)化學(xué)(ChemMedChem)2011，49)。一個(gè)報(bào)道披露了微管溶素與單克隆抗體的綴合(US 2011/0027274)。
新穎的微管溶素衍生物可以用作細(xì)胞毒性劑，以單獨(dú)地、作為藥物綴合物或與其他化學(xué)治療組合，在治療不同類型的癌癥中提供治療益處。
發(fā)明概述
本披露提供了具有化學(xué)式I的結(jié)構(gòu)的化合物：
其中：
R1是CH3，或CH2CH3；
R2是H或CH3；
R3是H或NH2；并且
n是1或2；
或其藥學(xué)上可接受的鹽。
在一些方面，n是1并且R1是甲基。
在一些方面，R2是甲基。
在一些方面，R3是NH2。
在一些方面，n是1，R1是甲基，R2是甲基并且R3是NH2。
具有化學(xué)式I的化合物是細(xì)胞毒性的并且可用于治療癌癥。
本披露還提供了具有化學(xué)式II的結(jié)構(gòu)的化合物：
其中：
R1是CH3，或CH2CH3；
R2是H或CH3；
R4是CH3，(CH2)4NH2，或(CH2)3NHC(＝O)NH2；
R5是H；C(CH3)(CH3)；
R6是NHC(＝O)，或CH2；
n是1或2；并且
m是0，1，2或3。
在一些方面，n是1并且R1是甲基。
在一些方面，R2是甲基。
在一些方面，R3是NH2。
在一些方面，n是1，R1是甲基，R2是甲基并且R3是NH2。
在一些方面，R4是(CH2)4NH2。
在一些方面，R5是H。
在一些方面，R6是CH2。
在一些方面，m是1。
在一些方面，n是1，m是1，R1是甲基，R2是甲基并且R3是NH2，R4是(CH2)4NH2，R5是H并且R6是CH2。
具有化學(xué)式I的化合物和具有化學(xué)式II的化合物可以通過常手段與抗體綴合以提供抗體藥物綴合物(ADC)。在本披露的一些方面，具有化學(xué)式I和II的化合物通過抗體賴氨酸或半胱氨酸與抗體綴合以提供抗體藥物綴合物(ADC)。提供了本披露的一些抗體藥物綴合物，其中該抗體是單克隆抗體。提供本披露的其他抗體藥物綴合物，其中該抗體對(duì)癌抗原是特異性的。提供了本披露的其他抗體藥物綴合物，其中該抗體是阿侖單抗，貝伐單抗，色瑞替尼(brentuximab)，西妥昔單抗，吉妥單抗，伊匹單抗(ipilimumab)，奧法木單抗(ofatumumab)，帕尼單抗，利妥昔單抗，托西莫單抗，或曲妥珠單抗。
本披露還提供了包括具有化學(xué)式I的化合物、或其藥學(xué)上可接受的鹽和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。提供了包括本披露的ADC和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。
本披露還提供了治療癌癥的方法，這些方法包括向患有癌癥的受試者給予有效量的具有化學(xué)式I的化合物或具有化學(xué)式II的化合物。本披露還提供了治療癌癥的方法，這些方法包括向患有癌癥的受試者給予有效量的與抗體綴合的具有化學(xué)式I的化合物或具有化學(xué)式II的化合物的抗體-藥物綴合物。在本披露的一些方面，受試者患有鱗狀細(xì)胞癌、小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、胃腸癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、骨髓瘤、唾液腺癌、腎癌、基底細(xì)胞癌、黑色素瘤、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、睪丸癌、食管癌、頭頸癌、粘液性卵巢癌、膽管癌或腎乳頭狀癌。
還提供了治療癌癥的方法，這些方法包括向?qū)ζ溆行枰氖茉囌呓o予包括具有化學(xué)式I的化合物的藥物組合物。本披露還提供了治療癌癥的方法，該方法包括向?qū)ζ溆行枰氖茉囌呓o予包括本披露的ADC的藥物組合物。
在一些方面，該方法進(jìn)一步包括給予至少一種另外的治療劑。在一些方面，該至少一種另外的治療劑是放射性核素或化療劑。
詳細(xì)說明
本披露提供了具有化學(xué)式I的結(jié)構(gòu)的化合物：
其中：
R1是CH3，或CH2CH3；
R2是H或CH3；
R3是H或NH2；并且
n是1或2；或其藥學(xué)上可接受的鹽。
在一些方面，n是1并且R1是甲基。
在一些方面，R2是甲基。
在一些方面，R3是NH2。
在一些方面，n是1，R1是甲基，R2是甲基并且R3是NH2。
根據(jù)化學(xué)式I的本公開化合物的具體實(shí)例包括化合物(Ii)至(Ivi)。
本披露提供了具有化學(xué)式II的結(jié)構(gòu)的化合物：
其中：
R1是CH3，或CH2CH3；
R2是H或CH3；
R4是CH3，(CH2)4NH2，或(CH2)3NHC(＝O)NH2；
R5是H；C(CH3)(CH3)；
R6是NHC(＝O)，或CH2；
n是1或2；并且
m是0，1，2或3。
在一些方面，n是1并且R1是甲基。
在一些方面，R2是甲基。
在一些方面，R3是NH2。
在一些方面，n是1，R1是甲基，R2是甲基并且R3是NH2。
在一些方面，R4是(CH2)4NH2。
在一些方面，R5是H。
在一些方面，R6是CH2。
在一些方面，m是1。
根據(jù)化學(xué)式II的本披露的化合物的具體實(shí)例包括化合物(IIi)至(IIiv)。
在本披露的一些方面，n是1。在本披露的其他方面，n是2。當(dāng)n是2時(shí)，哌啶環(huán)上R1取代可以在環(huán)中的單個(gè)碳原子上發(fā)生，或者可以在環(huán)中的不同碳原子上發(fā)生。在本披露的一些方面，當(dāng)n是1時(shí)，環(huán)的R1取代是氮的對(duì)位。在本披露的其他方面，當(dāng)n是1時(shí)，R1取代是哌啶環(huán)中的氮的間位。
化學(xué)式I和II的化合物可以與抗體綴合以形成抗體藥物綴合物。(ADC)。在ADC復(fù)合物中，具有化學(xué)式I的化合物和具有化學(xué)式II的化合物用作治療部分，其通過與其綴合的抗體遞送至感興趣的治療靶標(biāo)。還提供了包括通過具有化學(xué)式I和化學(xué)式II的化合物和抗體的綴合形成的ADC的藥物組合物。還提供了使用具有化學(xué)式I的化合物和具有化學(xué)式II的化合物制備ADC的方法。還提供了通過給予本披露的ADC治療對(duì)其有需要的受試者的癌癥的方法。治療癌癥的方法進(jìn)一步提供了與化療劑組合，給予本發(fā)明的ADC。
為了使本發(fā)明可以更容易理解，首先定義了某些術(shù)語(yǔ)。另外的定義貫穿詳細(xì)說明列出。
前述書面說明書被認(rèn)為是足以使得本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠?qū)嵺`這些實(shí)施例。前述描述和實(shí)例詳述了某些實(shí)施例并且描述了諸位發(fā)明人所期望的最佳模式。然而，將會(huì)了解的是無(wú)論前述內(nèi)容可以如何詳述出現(xiàn)在本文中，能以許多方式實(shí)踐這些實(shí)施例并且權(quán)利要求書包括其任何等效物。
在詳細(xì)描述本發(fā)明之前，應(yīng)理解的是本發(fā)明不限于特定的組合物或方法步驟，因?yàn)檫@些組合物或方法步驟可以變化。如在本說明書和所附權(quán)利要求書中使用的，單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”和“該”包括復(fù)數(shù)指代物，除非上下文明確地指示其他的情況。術(shù)語(yǔ)“一個(gè)”(或“一種”)、連同術(shù)語(yǔ)“一個(gè)或多個(gè)/一種或多種”和“至少一個(gè)/一種”在此可以互換地使用。
此外，當(dāng)在此使用時(shí)“和/或”被理解為這兩個(gè)指定的特征或組分每一者與或不與另一者的特定披露。因此，術(shù)語(yǔ)“和/或”如在此在詞組如“A和/或B”中使用時(shí)，旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(單獨(dú))、以及“B”(單獨(dú))。同樣，術(shù)語(yǔ)“和/或”如在詞組如“A、B和/或C”中使用時(shí)是旨在涵蓋以下方面中的每一者：A，B和C；A，B或C；A或者C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(單獨(dú))；B(單獨(dú))；和C(單獨(dú))。
除非另外定義，否則在此使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有如本披露所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。例如，生物醫(yī)學(xué)和分子生物學(xué)簡(jiǎn)明詞典(The Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology)，喬(Juo)，貝秀(Pei-Show)，第2版，2002，CRC出版社；細(xì)胞與分子生物學(xué)詞典(The Dictionary of Cell and Molecular Biology)，第3版，1999，學(xué)術(shù)出版社(Academic Press)；和牛津大學(xué)生物化學(xué)和分子生物學(xué)詞典(Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology)，2000年，牛津大學(xué)出版社，為技術(shù)人員提供了本披露中使用的許多術(shù)語(yǔ)的一般字典。
單位、前綴和符號(hào)是以它們的國(guó)際單位系統(tǒng)(Système International de Unites)(SI)接受形式表示。數(shù)值范圍包括限定該范圍的數(shù)字。除非另外說明，氨基酸序列以氨基至羧基取向從左向右書寫。本文提供的標(biāo)題不是對(duì)不同方面的限制，其可以通過參考作為整體的說明書而得到。因此，下面直接定義的術(shù)語(yǔ)通過以其全文參考說明書更完整地定義。
應(yīng)當(dāng)理解，無(wú)論在什么情況下在此用語(yǔ)言“包含”描述方面時(shí)，也提供了用“由……組成”和/或“主要由……組成”描述的其他類似方面。
氨基酸在本文中通過其通常已知的三字母符號(hào)抑或由IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員會(huì)推薦的單字母符號(hào)來表示。
術(shù)語(yǔ)“抑制”、“阻止”、以及“阻遏”在此可互換地使用，并且指生物活性的任何統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的降低，包括活性的完全阻止。例如，“抑制”可以指生物活性的約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的降低。
細(xì)胞增生可以使用本領(lǐng)域公認(rèn)的技術(shù)測(cè)定，其測(cè)量的細(xì)胞分裂速率，和/或經(jīng)歷細(xì)胞分裂的細(xì)胞群中細(xì)胞的分?jǐn)?shù)、和/或由于終末分化或細(xì)胞死亡(例如，胸苷摻入)自細(xì)胞群的細(xì)胞損失的速率。
本文可互換素使用的術(shù)語(yǔ)“抗體”或“免疫球蛋白”，包括完整抗體及其任何抗原結(jié)合片段或單鏈及其組合(例如雙特異性抗體)。
典型的抗體包括通過二硫鍵互連的至少兩條重(H)鏈和兩條輕(L)鏈。每個(gè)重鏈由重鏈可變區(qū)(本文縮寫為VH)和重鏈恒定區(qū)(本文縮寫為CH)構(gòu)成。重鏈恒定區(qū)由三個(gè)結(jié)構(gòu)域CH1，CH2和CH3構(gòu)成。每個(gè)輕鏈由輕鏈可變區(qū)(本文縮寫為VL)和輕鏈恒定區(qū)構(gòu)成。輕鏈恒定區(qū)由一個(gè)結(jié)構(gòu)域CL構(gòu)成。VH和VL區(qū)可以進(jìn)一步細(xì)分為稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的高變區(qū)，其間插入更保守的稱為框架區(qū)(FW)的區(qū)域。每個(gè)VH和VL由三個(gè)CDR和四個(gè)FW構(gòu)成，從氨基末端到羧基末端按照以下順序排列：FW1、CDR1、FW2、CDR2、FW3、CDR3、FW4。重鏈和輕鏈的可變區(qū)包含與抗原相互作用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域?？贵w的恒定區(qū)可以介導(dǎo)免疫球蛋白與宿主組織或因子(包括免疫系統(tǒng)的不同細(xì)胞(例如效應(yīng)細(xì)胞)和經(jīng)典補(bǔ)體系統(tǒng)的第一組分(C1q))的結(jié)合。本披露的示例性抗體包括典型的抗體，scFv及其組合，其中例如scFv與典型抗體的重鏈和/或輕鏈或聚合物的n-末端共價(jià)連接(例如，經(jīng)由肽鍵或經(jīng)由化學(xué)連接子)，或插入典型抗體的重鏈和/或輕鏈中。
術(shù)語(yǔ)“抗體”是指通過免疫球蛋白分子的可變區(qū)中的至少一個(gè)抗原識(shí)別位點(diǎn)識(shí)別并特異性結(jié)合靶標(biāo)(例如蛋白質(zhì)，多肽，肽，碳水化合物，多核苷酸，脂質(zhì)或前述的組合)的免疫球蛋白分子。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“抗體”包括完整的多克隆抗體，完整的單克隆抗體，抗體片段(例如Fab，F(xiàn)ab'，F(xiàn)(ab')2和Fv片段)，單鏈可變片段(scFv)，二硫鍵穩(wěn)定化的scFv，多特異性抗體(例如從至少兩種完整抗體和/或其抗原結(jié)合片段產(chǎn)生的雙特異性抗體)，嵌合抗體，人源化抗體，人抗體，包括抗體的抗原決定部分的融合蛋白，以及包括抗原識(shí)別位點(diǎn)的任何其他經(jīng)修飾的免疫球蛋白分子，只要這些抗體表現(xiàn)出希望的生物學(xué)活性。
抗體可以是基于其分別稱為α，δ，ε，γ和μ的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域的一致性的以下免疫球蛋白的五個(gè)主要類別中的任何一個(gè)：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，或其亞類(同種型)(例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2)。不同類別的免疫球蛋白具有不同的和熟知的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型?？贵w可以是裸露的或與其他分子例如毒素，放射性同位素等綴合以形成ADC。
術(shù)語(yǔ)“抗原結(jié)合片段”是指完整抗體的一部分并且是指完整抗體的抗原決定可變區(qū)。本領(lǐng)域已知，抗體的抗原結(jié)合功能可以由全長(zhǎng)抗體的片段進(jìn)行?？贵w片段的實(shí)例包括但不限于Fab，F(xiàn)ab'，F(xiàn)(ab')2和Fv片段，線性抗體，單鏈抗體、和由抗體片段形成的多特異性抗體。
“單克隆抗體”是指參與單一抗原決定簇或表位的高度特異性識(shí)別和結(jié)合的同源抗體群。這與典型地包括針對(duì)不同抗原決定簇的不同抗體的多克隆抗體相反。
術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”涵蓋完整和全長(zhǎng)單克隆抗體連同抗體片段(例如Fab，F(xiàn)ab'，F(xiàn)(ab')2，F(xiàn)v)，單鏈可變片段(scFv)，包括抗體部分的融合蛋白、以及包括抗原識(shí)別位點(diǎn)的任何其他經(jīng)修飾的免疫球蛋白分子。此外，“單克隆抗體”是指以任何數(shù)目的方式制備的此類抗體，這些方式包括但不限于通過雜交瘤，噬菌體選擇，重組表達(dá)和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(例如，在轉(zhuǎn)基因小鼠中表達(dá)人抗體)。
術(shù)語(yǔ)“人源化抗體”是指源自非人(例如鼠)免疫球蛋白的抗體，其被工程改造成包含最小的非人(例如鼠)序列。典型地，人源化抗體是人免疫球蛋白，其中來自CDR的殘基被來自具有希望的特異性、親和力和能力的非人物種(例如小鼠，大鼠，兔、或倉(cāng)鼠)的CDR的殘基替換(瓊斯(Jones)等人1986，自然(Nature)，321:522-525；瑞赫曼(Riechmann)等人，1988，自然(Nature)，332:323-327；維霍彥(Verhoeyen)等人，1988，科學(xué)(Science)，239:1534-1536)。在一些情況下，人免疫球蛋白的FW殘基被來自具有希望的特異性、和/或親和力、和/或能力的非人物種的抗體中的相應(yīng)殘基替換。
術(shù)語(yǔ)“抗體-藥物綴合物”(ADC)是指綴合物，該綴合物包括與至少一種具有化學(xué)式I的化合物或具有化學(xué)式II的化合物綴合的、與感興趣的表位結(jié)合的至少一種抗體。具有化學(xué)式I的化合物和具有化學(xué)式II的化合物可以與抗體綴合以形成抗體藥物綴合物。憑借具有化學(xué)式I的化合物和具有化學(xué)式II的化合物的(ADC)可以用作治療部分，這些治療部分通過與其綴合的抗體遞送至感興趣的治療靶標(biāo)。
在一些方面，ADC包括兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)、七個(gè)、八個(gè)、九個(gè)或十個(gè)治療部分。在一些具體方面，ADC包括兩個(gè)、三個(gè)或四個(gè)治療部分。在一些方面，所有治療部分是相同的。在一些方面，至少一個(gè)治療部分不同于其余部分。
治療部分是指具有化學(xué)式I的化合物的單分子或具有化學(xué)式II的化合物的單分子。
術(shù)語(yǔ)“受試者”是指應(yīng)該接受具體治療的任何動(dòng)物(例如，哺乳動(dòng)物)，包括但不限于人類、非人類靈長(zhǎng)動(dòng)物、嚙齒類、以及類似物。典型地，術(shù)語(yǔ)“受試者”和“患者”在此關(guān)于人類受試者可互換地使用。
術(shù)語(yǔ)“藥物組合物”是指一種制劑，該制劑處于允許該活性成分具有生物活性的形式，并且不包含另外的、對(duì)其將要給予的受試者具有不可接受的毒性的組分。這樣的組合物可以是經(jīng)消毒的。
術(shù)語(yǔ)如“治療(treating)”或“治療(treatment)”或“治療(to treat)”或“減輕(alleviating)”或“減輕(alleviate)”是指(1)使得診斷的病理性病癥或障礙的治愈、減緩、減輕癥狀、和/或停止進(jìn)展的治療措施以及(2)防止和/或減緩所靶向的病理學(xué)病癥或障礙的發(fā)展的預(yù)防性或防止性措施。因此，需要治療的那些包括已經(jīng)患有障礙的那些；那些傾向于患上障礙的人；和其中要預(yù)防障礙的那些。在某些方面，如果患者顯示例如，總的、部分的、或瞬時(shí)的某一類型的癌癥的緩解，則根據(jù)本披露的這些方法針對(duì)癌癥成功地“治療”了該受試者。
術(shù)語(yǔ)“癌癥”、“腫瘤”、“癌性”、和“惡性”指或描述在哺乳動(dòng)物中典型地是特征為不受控制的細(xì)胞生長(zhǎng)的生理病癥。癌癥的實(shí)例包括但不限于上皮癌，包括腺癌，淋巴瘤，胚細(xì)胞瘤，黑素瘤，肉瘤、和白血病。這樣的癌癥的更具體的實(shí)例包括鱗狀細(xì)胞癌，小細(xì)胞肺癌，非小細(xì)胞肺癌，胃腸癌，霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，胰腺癌，成膠質(zhì)細(xì)胞瘤，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，子宮頸癌，卵巢癌，肝臟癌癥比如肝細(xì)胞癌和肝癌，膀胱癌，乳腺癌(包括激素介導(dǎo)的乳腺癌，參見例如伊納斯(Innes)等人(2006)英國(guó)癌癥雜志(Br.J.Cancer)94:1057-1065)，結(jié)腸癌，結(jié)腸直腸癌，子宮內(nèi)膜癌，骨髓瘤(例如多發(fā)性骨髓瘤)，唾液腺癌，腎癌如腎細(xì)胞癌和維爾姆斯氏瘤，基底細(xì)胞癌，黑素瘤，前列腺癌，外陰癌，甲狀腺癌，睪丸癌，食管癌，各種類型的頭頸癌和粘液起源的癌癥，例如粘液性卵巢癌，膽管癌(肝)和腎乳頭狀癌。
術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞毒劑”如在此使用的是廣泛定義的并且是指抑制或阻止細(xì)胞的功能和/或造成細(xì)胞破壞(細(xì)胞死亡)、和/或施加抗腫瘤/抗增生作用的一種物質(zhì)。例如，細(xì)胞毒性試劑直接或間接防止贅生性腫瘤細(xì)胞的發(fā)育、成熟、或擴(kuò)散。該術(shù)語(yǔ)還包括僅引起抑制細(xì)胞生長(zhǎng)效應(yīng)并且不僅僅是細(xì)胞毒性效應(yīng)的此類試劑。該術(shù)語(yǔ)包括如下指出的化療劑，連同其他HER2拮抗劑、抗血管生成劑、酪氨酸激酶抑制劑、蛋白激酶A抑制劑，細(xì)胞因子家族的成員、放射性同位素、以及毒素如細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物來源的酶促活性毒素。
術(shù)語(yǔ)“化療劑”是包括天然或合成的化學(xué)化合物的術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞毒劑”的子集。化療劑的實(shí)例包括烷化劑，例如氮芥，乙烯亞胺化合物，烷基磺酸鹽和具有烷基化作用的其他化合物，例如亞硝基脲，順鉑和達(dá)卡巴嗪；抗代謝物，例如葉酸，嘌呤或嘧啶拮抗劑；有絲分裂抑制劑，例如長(zhǎng)春花生物堿、和鬼臼毒素衍生物；細(xì)胞毒性抗生素和喜樹堿衍生物。其他化療劑是氨磷汀順鉑，達(dá)卡巴嗪(DTIC)，更生霉素，二氯甲基二乙胺(氮芥)，鏈霉素，環(huán)磷酰胺，卡氮芥(BCNU)，洛莫司汀(CCNU)，多柔比星多柔比星立波(doxorubicin lipo)吉西他濱柔紅霉素，柔紅霉素立波(daunorubicin lipo)丙卡巴肼，絲裂霉素，阿糖胞苷，依托泊苷，甲氨蝶呤，5-氟尿嘧啶(5-FU)，長(zhǎng)春堿，長(zhǎng)春新堿，博來霉素，紫杉醇多西他賽阿地白介素，門冬酰胺酶，白消安，卡鉑，克拉屈濱，喜樹堿，CPT-11，10-羥基-7-乙基-喜樹堿(SN38)，吉非替尼達(dá)卡巴嗪，氟尿苷，氟達(dá)拉濱，羥基脲，異環(huán)磷酰胺，伊達(dá)比星，美司鈉，干擾素α，干擾素β，伊立替康，米托蒽醌，托泊替康，亮丙瑞林，甲地孕酮，美法侖，巰基嘌呤，普卡霉素，米托坦，培門冬酶，噴司他丁，哌泊溴烷，普卡霉素，鏈佐星，他莫昔芬，替尼泊苷，睪丸酯，硫鳥嘌呤，塞替派，尿嘧啶氮芥，長(zhǎng)春瑞濱，苯丁酸氮芥芳香酶抑制劑，及其組合。
根據(jù)本披露的這些方法，本披露的化合物和ADC可以給予患者，以便促進(jìn)對(duì)于癌癥的積極治療響應(yīng)。術(shù)語(yǔ)對(duì)于癌癥治療的“積極治療響應(yīng)”是指與該疾病相關(guān)的癥狀的改進(jìn)。
例如，疾病的改進(jìn)可以表征為完全響應(yīng)。術(shù)語(yǔ)“完全響應(yīng)”是指通過任何先前測(cè)試結(jié)果的歸一化，不存在臨床上可檢測(cè)的疾病?？商娲兀膊〉母倪M(jìn)可以被歸類為部分響應(yīng)?！胺e極治療響應(yīng)”涵蓋從本披露的化合物的給予得到的癌癥的進(jìn)展和/或持續(xù)時(shí)間的減少或抑制，癌癥的嚴(yán)重性的減少或改進(jìn)、和/或其一種或多種癥狀的改進(jìn)。
在具體方面中，此類術(shù)語(yǔ)是指給予本披露的化合物之后以下一種、兩種或三種或更多種結(jié)果：
(1)癌細(xì)胞群的穩(wěn)定、減少或消除；
(2)癌癥生長(zhǎng)的穩(wěn)定化或減少；
(3)癌癥形成方面的受損；
(4)原發(fā)性、區(qū)域性和/或轉(zhuǎn)移性癌癥的根除、除去，或控制；
(5)死亡率的減少；
(6)無(wú)疾病、無(wú)復(fù)發(fā)、無(wú)進(jìn)展、和/或總存活期、持續(xù)時(shí)間、或速率的增加；
(7)響應(yīng)或處于緩解期的患者的響應(yīng)速率、響應(yīng)耐久性或數(shù)目的增加；
(8)住院率的降低，
(9)住院時(shí)間的降低，
(10)癌癥的尺寸維持并且不增加或增加少于10％、優(yōu)選小于5％、優(yōu)選小于4％、優(yōu)選小于2％，以及
(11)處于緩解期患者的數(shù)目的增加。
(12)否則治療癌癥要求的輔助治療(如，化療或激素治療)的數(shù)目的減少。
臨床響應(yīng)可以使用篩選技術(shù)評(píng)定，如PET、磁共振成像(MRI)掃描、x-射線照相成像、計(jì)算機(jī)斷層成像(CT)掃描、流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)或熒光活化細(xì)胞分選儀(FACS)分析、組織學(xué)、宏觀病理學(xué)、和血液化學(xué)，包括但不限于可通過ELISA、RIA、層析、以及類似物檢測(cè)的變化。除了這些積極治療響應(yīng)之外，正經(jīng)受治療的受試者可以經(jīng)歷與該疾病相關(guān)的癥狀的改進(jìn)的有益效果。
本披露的化合物可以與用于癌癥的任何已知治療組合使用，這些已知治療包括已知有用的或已經(jīng)使用或目前正在使用的用于治療癌癥的任何試劑或試劑組合，這些癌癥例如結(jié)腸癌，肺癌，胃癌，頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、和乳腺癌。抗癌劑包括用于治療惡性腫瘤例如癌性生長(zhǎng)的藥物。藥物治療可以單獨(dú)使用，或與其他治療例如手術(shù)或放射治療組合使用。取決于所涉及器官的性質(zhì)，若干類型的藥物可用于癌癥治療。例如，乳腺癌通常由雌激素刺激，并且可以用滅活性激素的藥物治療。類似地，前列腺癌可以用滅活雄激素、男性性激素的藥物治療。
用于本披露的某些方法中的抗癌劑除其他之外包括抗體，抗代謝物，烷化劑，拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑，微管靶向劑，激酶抑制劑，蛋白質(zhì)合成抑制劑，免疫治療劑，激素治療劑，糖皮質(zhì)激素，芳香酶抑制劑，mTOR抑制劑，化療劑，蛋白激酶B抑制劑，磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抑制劑，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)抑制劑，RLr9，CD289，酶抑制劑，抗TRAIL，MEK抑制劑、等。
在聯(lián)合治療包括與另一治療劑的給予組合給予本披露的化合物的情況下，本披露的方法涵蓋使用單獨(dú)的配制品或單一藥物配制品的共同給予，以及以任一順序連續(xù)給予。在一些方面，本文所述的具有化學(xué)式I的化合物，具有化學(xué)式II的化合物和/或ADC與其他藥物組合給予，其中抗體或其抗原結(jié)合片段、變體、或衍生物和該一種或多種治療劑可以按任何順序或同時(shí)(即，同時(shí)或在相同的時(shí)間框架內(nèi))依次給予。
該聯(lián)合治療可以提供“協(xié)同作用”并且證明是“協(xié)同的”，即，當(dāng)這些活性成分一起使用時(shí)所實(shí)現(xiàn)的效果大于分開使用這些化合物產(chǎn)生的效果的總和。在以下情況下可以得到協(xié)同作用，當(dāng)該活性成分是：(1)同時(shí)以組合的單位劑量配制品共配制和給予或遞送的；(2)作為分開的配制品通過交替或平行遞送的；或(3)通過一些其他方案。當(dāng)以交替治療遞送時(shí)，當(dāng)這些化合物是例如，通過分開的注射器的不同注射順序地給予或遞送時(shí)，可以達(dá)到一種協(xié)同作用?？傮w上，在交替治療過程中，順序地，即連續(xù)地給予每種活性成分的有效的劑量，而在聯(lián)合治療中，一起給予兩種或更多種活性成分的有效劑量。
本披露的化合物和ADC(治療劑)可以通過口服、胃腸外、通過吸入或局部途徑給予患者。如本文使用的術(shù)語(yǔ)腸胃外包括例如靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、直腸或陰道給予。然而，在與本文教導(dǎo)相容的其他方法中，ADC可用于選擇性地靶向本發(fā)明的化合物以將治療劑直接遞送至不利細(xì)胞群的位置，從而增加患病組織暴露于治療劑。
如本文所討論的，本披露的治療劑可以在用于癌癥的體內(nèi)治療的藥學(xué)上可接受的組合物中給予。典型地，本披露的化合物將配制為用于靜脈內(nèi)給予的溶液或作為用于重構(gòu)以制備靜脈內(nèi)溶液(例如用鹽水，5％右旋糖、或類似的等滲溶液)的凍干濃縮物。藥物組合物可以包括藥學(xué)上可接受的載體，包括例如水、離子交換劑、蛋白質(zhì)、緩沖物質(zhì)、和鹽。也可以存在防腐劑和其他添加劑。載體可以是溶劑或分散介質(zhì)。用于本文披露的治療方法的合適配制品描述于雷明頓氏藥物科學(xué)(Remington's Pharmaceutical Sciences)(麥克出版公司(Mack Publishing Co.))第16版(1980)。
在任何情況下，可以通過將按所需量的本披露的治療劑摻入適當(dāng)?shù)娜軇┲?、然后過濾滅菌來制備無(wú)菌可注射溶液。此外，這些制劑可以按試劑盒的形式包裝和出售。這樣的制品可以具有標(biāo)簽或包裝說明書，表明相關(guān)組合物可用于治療患有或傾向于患有疾病或障礙的受試者。
胃腸外配制品可以是單次推注劑量，輸注或加載推注劑量，隨后是維持劑量。這些組合物可以按特定的固定的或可變的間隔給予，例如每天一次，或在“根據(jù)需要”的基礎(chǔ)上給予。
組合物可以作為單劑量，多劑量或經(jīng)在輸注中的確定時(shí)間段給予。還可以調(diào)節(jié)劑量方案以提供最佳的希望的響應(yīng)(例如治療的或預(yù)防的響應(yīng))。
用于治療癌癥(包括例如結(jié)腸癌、肺癌、胃癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、黑素瘤、胰腺癌、前列腺癌和乳腺癌)的本披露組合物的治療有效劑量取決于許多不同的因素而變化，這些因素包括給予的方式、靶位點(diǎn)、患者的生理狀態(tài)、患者是人還是動(dòng)物、給予的其他藥物、以及治療是預(yù)防性還是治療性的。通常，患者是人，但是也可以治療非人哺乳動(dòng)物，包括轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物。可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法滴定治療劑量，以優(yōu)化安全性和功效。
待給予的本披露的治療劑的量可以容易地由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員確定而無(wú)需過度的實(shí)驗(yàn)。影響給予模式和藥劑的相應(yīng)量的因素包括但不限于疾病的嚴(yán)重性，疾病的病史，以及經(jīng)歷治療的個(gè)體的年齡，身高，體重，健康、和身體狀況。類似地，待給予的抗HER2結(jié)合分子(例如抗體或其片段，變體或衍生物)的量將取決于給予模式以及受試者是否將經(jīng)歷單劑量或多劑量的這一藥劑。
本披露還提供了本披露的治療劑在制備用于治療一個(gè)類型的癌癥的藥物中的用途，該類型的癌癥包括例如乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、胃癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、黑素瘤、胰腺癌、和前列腺癌。
本披露還提供了本披露的治療劑在制備用于治療受試者以治療一個(gè)類型的癌癥的藥物中的用途。在某些方面，該藥物用于已經(jīng)用至少一種其他治療預(yù)處理的受試者。
“預(yù)處理的”或“預(yù)處理”意指受試者在接受包括本披露化合物的藥物之前已經(jīng)接受一種或多種其他治療(例如，已經(jīng)用至少一種其他抗癌治療進(jìn)行治療)。受試者不必是對(duì)用在先的一種或多種治療的預(yù)預(yù)處理的響應(yīng)者。因此，接受該藥物的受試者可能已經(jīng)響應(yīng)或可能未響應(yīng)用在先治療劑的預(yù)處理，或在其中預(yù)處理包括多種治療的情況下可能已經(jīng)響應(yīng)或可能未響應(yīng)這些在先治療中的一種或多種。
本披露還提供了將治療劑和至少一種其他治療一起在單一組合物中共同給予，或一起在單獨(dú)組合物中同時(shí)或重疊時(shí)間共同給予。
本披露還提供了治療劑在制備用于治療受試者以治療癌癥的藥物中的用途，其中將該試劑在受試者已經(jīng)用至少一種其他治療進(jìn)行治療之前給予。
實(shí)例
本披露的多個(gè)方面可以通過參考以下非限制性實(shí)例進(jìn)一步定義，這些實(shí)例詳細(xì)描述了本披露的某些化合物和中間體的制備以及用于使用本披露的化合物的方法。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)清楚的是可以實(shí)踐對(duì)于材料和方法兩者的許多修改而不偏離本披露的范圍。
除非另行說明：
(i)溫度以攝氏度(℃)給出；當(dāng)在室溫或環(huán)境溫度下進(jìn)行操作時(shí)，即在18℃-25℃的范圍內(nèi)進(jìn)行操作，除非另行說明；
(ii)溶液用無(wú)水硫酸鈉或硫酸鎂干燥；使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在減壓(4.5-30mmHg)下使用上至30℃浴溫度進(jìn)行有機(jī)溶劑的蒸發(fā)；
(iii)色譜法是指硅膠快速色譜法；在硅膠板上進(jìn)行薄層色譜(TLC)；
(iv)通常，通過TLC或液相色譜/質(zhì)譜(LC/MS)跟蹤反應(yīng)過程，并且給出反應(yīng)時(shí)間僅用于說明；
(v)最終產(chǎn)物具有令人滿意的質(zhì)子核磁共振(NMR)譜和/或質(zhì)譜數(shù)據(jù)；
(vi)給出產(chǎn)率僅用于說明，并且不一定是可以通過勤奮工藝開發(fā)而獲得的那些；如果需要更多材料，則重復(fù)制備；
(vii)當(dāng)給出時(shí)，核磁共振(NMR)數(shù)據(jù)為δ(主要診斷性質(zhì)子的值，以相對(duì)于作為內(nèi)標(biāo)的四甲基硅烷(TMS)的每百萬(wàn)分之一(ppm)給出，在300MHz或400MHz在d6-DMSO中確定，除非另行說明；
(viii)化學(xué)符號(hào)具有其通常的含義；
(ix)溶劑比率以體積:體積(v/v)方式給出；
(x)使用一種或多種下列方法進(jìn)行化合物的純化：
a)常規(guī)硅膠快速色譜；
b)使用Isco分離系統(tǒng)(RediSep正相快速柱，流速，30-40ml/min(ISCO MPLC)的硅膠快速色譜
c)吉爾森(Gilson)半制備型HPLC分離系統(tǒng)：YMC pack ODS-AQ柱，100×20mm，S 5μm 12nm，水(0.1％三氟乙酸)和乙腈(0.1％三氟乙酸)作為溶劑，20min；和
(xi)已使用以下縮寫：
Boc 叔丁氧基羰基；
DCM 二氯甲烷；
DIAD 偶氮二甲酸二異丙酯；
DIC N,N'-二異丙基碳二亞胺；
DCC N,N'-二環(huán)己基碳二亞胺；
DIEA 二乙基異丙胺；
DMA N,N'-二甲基乙酰胺；
DMF N,N'-二甲基甲酰胺；
EDCI 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺
EtOAc 乙酸乙酯；
Et2O 乙醚；
Fmoc-OSu 9-芴基甲基n-琥珀酰亞胺基碳酸酯
MeOH 甲醇；
Na2CO3 碳酸鈉；
NaHCO3 碳酸氫鈉；
RT 室溫；
TEA 三乙胺
TFA 三氟乙酸；
THF 四氫呋喃.
HATU 1-[雙(二甲基氨基)亞甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸酯
DAST 二乙基氨基三氟化硫
ACN 乙腈
Boc2O 二-叔-丁基二碳酸酯
米氏酸(Meldrum’s acid) 2,2-二甲基-1,3-二噁烷-4,6-二酮
用于合成化合物1-5的通用方案
中間體1
向(2R,4R)-4-甲基哌啶-2-甲酸(2g，13.97mmol)在MeOH(40mL)和水(40.0mL)中的溶液中添加多聚甲醛(2.52g，27.94mmol)和Pd/C(10％)(0.8g，7.52mmol)。將反應(yīng)混合物在氫氣氛下在室溫下攪拌過夜。根據(jù)TLC，反應(yīng)沒有完成。添加另外一個(gè)當(dāng)量的多聚甲醛(2.52g，27.94mmol)，將反應(yīng)混合物再攪拌24小時(shí)。TLC表明反應(yīng)完成，將反應(yīng)混合物過濾，用MeOH(2×30mL)洗滌催化劑。將濾液真空濃縮，以給出粗產(chǎn)物，為白色固體，將其用醚(3×30mL)洗滌，在高真空中干燥過夜，以產(chǎn)生(2R,4R)-1,4-二甲基哌啶-2-甲酸(1)(1.870g，85％)，為白色固體。LC-MS：158(M+1)；1H NMR(400MHz,D2O)δppm 0.97(d,J＝5.52Hz,3H),1.54(br.s,1H),1.71-1.87(m,3H),1.91-2.07(m,1H),2.84(s,3H),3.13(td,J＝8.41,3.76Hz,1H),3.35(m,1H),3.65(m,1H)。
中間體2
在室溫下，在攪拌下將Boc2O(243.0g，1.1mol)滴加到(R)-3-氨基-4-甲基戊酸(可商購(gòu)的)(133.0g，1.0mol)和Na2CO3(212g，2.0mol)在丙酮(1L)和水(1L)中的懸浮液中。將反應(yīng)混合物攪拌過夜，并且減壓除去有機(jī)溶劑。將殘余物用水(1L)稀釋并用EtOAc(500mL×3)洗滌。將水相用2N HCl溶液酸化至pH＝3，并且將所得混合物用EtOAc(800mL×3)萃取。將合并的萃取物用鹽水(800mL×1)洗滌，干燥(Na2SO4)并濃縮，以給出化合物(2)(224.0g，97％產(chǎn)率)，為一種油，將其不經(jīng)進(jìn)一步純化即用于下一步驟。
中間體3
在0℃下，在攪拌下，將三乙胺(67g，0.61mol)添加至中間體2(140.0g，0.61mol)和N,O-二甲基羥胺鹽酸鹽(74.1g，0.76mol)在CH2Cl2(1.4L)中的懸浮液中。將懸浮液攪拌0.5小時(shí)，并且在0℃下分批添加EDCI(74g，0.61mol)。將反應(yīng)混合物在0℃下攪拌2小時(shí)并且添加水(800mL)。分離有機(jī)相，用5％KHSO4溶液(800mL×3)、飽和NaHCO3溶液(800mL×3)和鹽水(800mL×1)洗滌，干燥(Na2SO4)并且濃縮至干燥。將殘余物通過硅膠快速柱色譜法純化(EtOAc/己烷＝1:5)，以給出化合物(3)(141.0g，84％產(chǎn)率)，為一種油。1H NMR(300MHz,CDCl3):δ5.26(m,1H),3.75(m,1H),3.70(s,3H),3.15(s,3H),2.60～2.80(m,2H),1.85(m,1H),1.41(s,9H),0.90(d,J＝6.6Hz,3H),0.88(d,J＝6.6Hz,3H)。
中間體4
在0℃下，在攪拌下，將碘乙烷(250.0g，1.6mol)添加至中間體3(55.0g，0.2mol)在DMF(1.1L)中的溶液中。然后在0℃下分批添加NaH(60％懸浮液，24.0g，0.60mol)，并且允許將反應(yīng)混合物加溫至室溫并攪拌12小時(shí)。小心地用水(2L)淬滅反應(yīng)，并且添加EtOAc(2L)。分離有機(jī)相，用5％KHSO4溶液(800mL×3)，飽和NaHCO3溶液(800mL×3)和鹽水(800mL×1)洗滌，干燥(Na2SO4)并且濃縮至干燥。將殘余物通過硅膠快速柱色譜法純化(EtOAc/己烷＝1:10)，以給出(R)-乙基(1-(甲氧基(甲基)氨基)-4-甲基-1-氧代戊-3-基)氨基甲酸叔丁酯(35.1g，58％產(chǎn)率)，為一種油。1H NMR(300MHz,CDCl3):δ3.70(s,3H),3.65(m,1H),3.10～3.30(m,5H),2.50～2.95(m,2H),1.90～2.20(m,1H),1.40～1.55(m,9H),1.10(t,J＝7.2Hz,3H),0.90(d,J＝6.6Hz,3H),0.88(d,J＝6.6Hz,3H)。
中間體5
在N2和攪拌下經(jīng)1小時(shí)，在-78℃下，將n-BuLi(106ml，2.5N在己烷中，0.17mol)的溶液滴加到中間體50(74g，0.24mol)在干THF(500mL)中的溶液中。將懸浮液再攪拌30min，并且然后在-78℃下經(jīng)30min滴加中間體4(51.0g，0.17mol)在無(wú)水THF(300mL)中的溶液。將反應(yīng)混合物在-78℃下攪拌1小時(shí)并且然后允許加溫至室溫并且攪拌12小時(shí)。用20％氯化銨水溶液(1L)淬滅反應(yīng)并且減壓除去有機(jī)溶劑。將所得混合物用EtOAc(800mL×3)萃取。合并的有機(jī)相用5％KHSO4溶液(800mL×3)，飽和NaHCO3溶液(800mL×3)和鹽水(800mL×1)洗滌，干燥(Na2SO4)并且濃縮至干燥。將粗材料通過硅膠快速柱色譜法純化(EtOAc/己烷＝1:10)，以給出叔丁基(R)-(1-(4-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)噻唑-2-基)-4-甲基-1-氧代戊-3-基)(乙基)氨基甲酸酯(58.1g，73％產(chǎn)率)，為一種油。1H NMR(300MHz,CDCl3):δ7.53(m,1H),4.90(s,2H),4.04(m,1H),3.35(m,2H),3.15(m,2H),2.00(m,1H),1.40(s,9H),0.80～1.20(m,18H),0.14(s,6H)。
中間體6
在室溫下，在攪拌下，經(jīng)0.5小時(shí)的時(shí)段，將LiBH4(4.8g，0.22mol)分批添加至中間體5(47.1g，0.1mol)在甲醇(500mL)中的溶液中。將懸浮液攪拌2小時(shí)，并且減壓除去溶劑。將殘余物溶于EtOAc(800mL)中并且將所得溶液用飽和NaHCO3溶液(500mL×3)和鹽水(500mL×1)洗滌，干燥(Na2SO4)并且濃縮至干燥。將粗材料通過快速柱色譜法(EtOAc/己烷＝1:6)純化，以給出叔丁基((1R,3R)-1-(4-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)噻唑-2-基)-1-羥基-4-甲基戊-3-基)(乙基)氨基甲酸酯(13.5g，28％產(chǎn)率)及其異構(gòu)體(6’)(21.0g，45％產(chǎn)率)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δppm-0.06-0.05(m,6H)0.76-0.89(m,15H)1.12(t,J＝6.97Hz,3H)1.39(s,9H)1.55-2.05(m,3H)2.86-3.21(m,2H)3.76-3.96(m,1H)4.73(d,J＝1.13Hz,4H)7.01(s,1H)。
中間體7
在0℃下，在攪拌下，經(jīng)10min，將乙酰氯(45.2g，0.58mol)滴加到中間體6(34.0g，72mmol)在吡啶(500mL)中的溶液中。允許將反應(yīng)混合物加溫至室溫并攪拌12小時(shí)。將反應(yīng)用水(200mL)淬滅并且減壓除去溶劑。殘余物用CH2Cl2(800mL)處理，所得混合物用5％KHSO4溶液(800mL×3)，飽和NaHCO3溶液(800mL×3)和鹽水(800mL×1)洗滌，干燥(Na2SO4)并且濃縮至干燥。將粗材料通過硅膠快速柱色譜法純化(EtOAc/己烷＝1:10)，以給出(1R,3R)-3-((叔丁氧基羰基)(乙基)氨基)-1-(4-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)噻唑-2-基)-4-甲基戊基乙酸酯(25.7g，69％產(chǎn)率)，為一種油。1H NMR(300MHz,CDCl3):δ7.15(m,1H),5.95(m,1H),4.84(s,2H),4.04(m,1H),3.10(m,2H),2.35(m,1H),2.15(s,3H),2.00(m,1H),1.70(m,1H),1.45(s,9H),1.25(t,J＝7.2Hz,3H),0.80～1.10(m,15H),0.08(s,6H)。
中間體8
在0℃下，在攪拌下，將四丁基氟化銨(65.3g，0.25mol)在THF(200mL)中的溶液滴加到中間體7(25.7g，50mmol)在THF(300mL)中的溶液中。允許將反應(yīng)混合物加溫至室溫并攪拌4小時(shí)。添加水(800mL)并且減壓除去有機(jī)溶劑。將殘余物用CH2Cl2(800mL)處理，所得混合物用5％KHSO4溶液(800mL×3)，飽和NaHCO3溶液(800mL×3)和鹽水(800mL×1)洗滌，干燥(Na2SO4)并且濃縮至干燥。將粗材料通過硅膠快速柱色譜法純化(EtOAc/己烷＝1:4)，以給出(1R,3R)-3-((叔丁氧基羰基)(乙基)氨基)-1-(4-(羥基甲基)噻唑-2-基)-4-甲基戊基乙酸酯(19.5g，98％產(chǎn)率)，為一種油。1H NMR(300MHz,CDCl3):δ8.26(m,1H),5.95(m,1H),4.83(m,2H),4.10(m,1H),3.17(m,2H),2.40(m,1H),2.20(s,3H),2.18(m,1H),1.75(m,1H),1.56(s,9H),1.10～1.30(m,3H),0.80～1.05(m,6H)。
中間體9
將戴斯-馬丁試劑(32.7g，75mmol)添加到中間體8(20.0g，50mmol)在二氯甲烷(300mL)中的溶液中，并且將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌12小時(shí)。將混合物分別用氫氧化鈉溶液(1N，300m L×3)，硫代硫酸鈉溶液(1N，300mL×3)，飽和NaHCO3(300mL×3)溶液和鹽水(300mL×1)洗滌。將有機(jī)層干燥(Na2SO4)并且濃縮至干燥，以給出相應(yīng)的醛。將該粗醛溶解在叔丁醇(500mL)中，并且在室溫下經(jīng)1小時(shí)滴加亞氯酸鈉(80％，36.4g，320mmol)和磷酸二氫鈉一水合物(105g，0.77mol)在水(300mL)中的溶液。將反應(yīng)混合物攪拌3小時(shí)，并且用鹽酸溶液(0.1N，500mL)稀釋。將所得混合物用EtOAc(500mL×1)萃取并且將合并的有機(jī)層用5％KHSO4溶液(500mL×3)和鹽水(500mL×1)洗滌，用Na2SO4干燥并且濃縮至干燥。將殘余物通過硅膠快速柱色譜法純化(CH2Cl2/MeOH＝100:5)，以給出2-((1R,3R)-1-乙酰氧基-3-((叔丁氧基羰基)(乙基)氨基)-4-甲基戊基)噻唑-4-甲酸(15.4g，58％產(chǎn)率)。1H NMR(300MHz,CDCl3):δ9.90(br s,1H),8.27(s,1H),5.96(m,1H),4.07(m,1H),3.15(m,1H),2.35(m,1H),2.20(s,3H),2.18(m,1H),1.75(m,1H),1.45(s,9H),1.20(t,J＝7.2Hz,3H),0.98(d,J＝6.6Hz,3H),0.88(d,J＝6.6Hz,3H)。
中間體10
在0℃下向中間體9(6.5g，15.68mmol)在DCM(60mL)中的溶液中滴加TFA(30mL)。將混合物在0℃下攪拌1小時(shí)。真空蒸發(fā)溶劑，以給出粗2-((1R,3R)-1-乙酰氧基-3-(乙基氨基)-4-甲基戊基)噻唑-4-甲酸。將粗產(chǎn)物不經(jīng)進(jìn)一步純化即用于下一步反應(yīng)(7.2克)。LC-MS：315(M+1)，
中間體11
向中間體10(5g，11.67mmol)和碳酸氫鈉(9.80g，116.71mmol)在丙酮(300mL)和水(150mL)的混合物中的溶液中添加(9H-芴-9-基)甲基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯(3.94g，11.67mmol)。將混合物在室溫下攪拌過夜。LCMS表明反應(yīng)完成。將混合物用鹽酸酸化至(pH 2)，并且真空蒸發(fā)丙酮。將產(chǎn)物用DCM(3×300mL)萃取。將合并的有機(jī)萃取物用0.1％Hcl溶液(200mL)，鹽水(200mL)洗滌，用Na2SO4干燥，并且真空蒸發(fā)。通過快速色譜法(硅膠，MeOH/DCM，0％至5％的MeOH)純化殘余物，以給出2-((1R,3R)-3-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)(乙基)氨基)-1-乙酰氧基-4-甲基戊基)噻唑-4-甲酸(3.53g，54.6％)，為白色固體。LC-MS：537.2(M+1)；1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm 0.84(d,J＝6.78Hz,3H),0.92-1.05(m,5H),1.14(d,J＝3.01Hz,1H),1.73(dt,J＝10.23,6.43Hz,1H),1.92-2.05(m,1H),2.12-2.27(m,4H),2.28-2.44(m,1H),2.90-3.33(m,2H),3.98(t,J＝9.29Hz,1H),4.12-4.32(m,1H),4.47-4.82(m,2H),5.95(dd,J＝10.92,2.89Hz,1H),7.29-7.45(m,4H),7.55-7.69(m,2H),7.72-7.81(m,2H),8.22-8.29(m,1H)。
中間體12
將DMAP(106g，0.86mol)添加到Boc-L-4-硝基-苯基丙氨酸(1800g，0.58mol)和米氏酸(92g，0.64mol)在二氯甲烷(1.5L)中的溶液中。將所得溶液在-5℃下在N2氣氛下冷卻，隨后經(jīng)1h添加在二氯甲烷(1L)中的DCC(240g，1.16mol)。將混合物在0-5℃下攪拌過夜。然后通過過濾除去沉淀的N,N’-二環(huán)己基脲并且將濾液用5％Hcl水溶液(1L×3)，和鹽水(1L×1)洗滌，并且用MgSO4干燥。通過過濾除去MgSO4后，將有機(jī)相濃縮至干燥。將殘余物用EtOAc/己烷(1:1，500mL)，磨碎，并且干燥，以給出叔丁基(S)-(1-(2,2-二甲基-4,6-二氧代-1,3-二噁烷-5-基)-3-(4-硝基苯基)-1-氧代丙-2-基)氨基甲酸酯(130.0g，51％產(chǎn)率)，為黃色固體。
中間體13
在-5℃下，在N2下，將AcOH(400mL)添加到中間體12(130.0g，0.298mol)在二氯甲烷(1.5L)中的溶液中。經(jīng)2小時(shí)分小份添加固體NaBH4(22.7g，0.597mol)(放出氣體并且放熱)。在-5℃下再攪拌3h后，TLC表明反應(yīng)完成。將混合物用鹽水(1L)淬滅。分離有機(jī)層，并且依次用水(1L×2)，飽和NaHCO3水溶液(1L×3)和鹽水(1L×3)洗滌，并且用MgSO4干燥。將濾液濃縮至干燥，并且給出叔丁基(R)-(1-(2,2-二甲基-4,6-二氧代-1,3-二噁烷-5-基)-3-(4-硝基苯基)丙-2-基)氨基甲酸酯(70.3g，55％產(chǎn)率)，為黃色固體。1H NMR(300MHz,CDCl3):δ8.18(d,J＝8.7Hz,2H),7.41(d,J＝8.7Hz,2H),4.58(m,1H),4.29(m,1H),3.85(m,1H),2.97(d,J＝6.6Hz,2H),2.27(m,2H),1.80(s,3H),1.76(s,3H),1.35(s,9H)。
中間體14
將K2CO3(35g，0.25mol)和MeI(36g，0.25mol)添加到中間體13(70.3g，0.167mol)在丙酮(400mL)和DMF(400mL)中的溶液中。將混合物在室溫下攪拌過夜。TLC示出起始材料被消耗。添加水(2L)并且將混合物再攪拌一小時(shí)。通過過濾收集沉淀的固體，用水洗滌，干燥，以給出叔丁基(S)-(1-(4-硝基苯基)-3-(2,2,5-三甲基-4,6-二氧代-1,3-二噁烷-5-基)丙烷-2-基)氨基甲酸酯(34.5g，47％產(chǎn)率)，為淡黃色固體。1H NMR(300MHz,CDCl3):δ8.17(d,J＝8.7Hz,2H),7.34(d,J＝8.7Hz,2H),4.22(m,1H),3.85(m,1H),2.85(m,2H),2.22(m,2H),1.73(s,3H),1.73(s,3H),1.52(s,3H),1.31(s,9H)。
中間體15
將中間體14(34.5g，79.1mmol)溶解在甲苯(500mL)中。將溶液加熱回流40小時(shí)。TLC表明反應(yīng)完成。除去溶劑，以給出叔丁基(5R)-3-甲基-5-(4-硝基芐基)-2-氧代吡咯烷-1-甲酸酯(30g)，將其不經(jīng)進(jìn)一步純化即用于下一步驟。
中間體16
將K2CO3(22g，0.16mol)添加到中間體15(30g，79mmol)在MeOH(300mL)中的溶液中在室溫下攪拌混合物3小時(shí)。TLC示出完全轉(zhuǎn)化。除去溶劑，將殘余物溶于二氯甲烷(500mL)中，用鹽水(500mL×3)洗滌，并且用MgSO4干燥。通過過濾除去MgSO4后，將有機(jī)相濃縮至干燥。殘余物通過硅膠色譜法(EtOAc/己烷＝1:10)進(jìn)一步純化，并且給出甲基(4R)-4-((叔丁氧基羰基)氨基)-2-甲基-5-(4-硝基苯基)戊酸酯(23.5g，兩步產(chǎn)率81％)，為1:1的非對(duì)映異構(gòu)體混合物。1H NMR(300MHz,CDCl3):δ8.13(d,J＝8.7Hz,2H),7.34(d,J＝8.7Hz,2H),4.43(m,1H),3.85(m,1H),3.65(s,3H),2.85(m,2H),2.65(m,1H),1.85(m,1H),1.50(m,1H),1.30(s,9H),1.15(t,J＝6.6Hz,3H)。
中間體17
使用SFC(超臨界流體色譜)，在Chiralpak ID 21×250mm，5μ柱上對(duì)50g化合物(16)進(jìn)行手性色譜，使用流動(dòng)相A為90％二氧化碳，并且B相為10％異丙醇，按60ml/min流速。在40℃進(jìn)行分離并在270nM進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)現(xiàn)基線分離并且分離兩個(gè)級(jí)分。峰B是希望的(2S,4R)-4-((叔丁氧基羰基)氨基)-2-甲基-5-(4-硝基苯基)戊酸甲酯，并且獲得為固體27.4g(55％)。>99:1非對(duì)映體過量，在Chiralpak IA柱4.6×250mm，5μ，具有0.1％二乙胺改性劑的己烷中的10％1:1甲醇:異丙醇。LC/MS(2分鐘，酸_CV10.olp方法367(M+1)，1.16分鐘。
1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δppm 8.16(d,J＝8.53Hz,2H)7.46(d,J＝8.53Hz,2H)3.79-3.93(m,1H)3.68(s,3H)2.90-2.99(m,1H)2.71-2.81(m,1H)2.47-2.59(m,1H)1.81-1.95(m,1H)1.55-1.66(m,1H)1.32(s,9H)1.21-1.25(m,2H)1.16(d,J＝7.03Hz,3H)
中間體18
將中間體17在6N HCl水溶液(8.0mL，263.30mmol)中的溶液在130℃下在微波爐中加熱30min。將反應(yīng)混合物凍干，以給出(2S,4R)-4-氨基-2-甲基-5-(4-硝基苯基)戊酸，為一種固體。將該產(chǎn)物不經(jīng)進(jìn)一步純化即用于下一步反應(yīng)(3.2g)。LC-MS：253(M+1)；1H NMR(400MHz,D2O)δppm 1.12(d,J＝7.28Hz,3H),1.62-1.76(m,1H),1.90-2.02(m,1H),2.56-2.68(m,1H),3.02-3.11(m,2H),3.58-3.69(m,1H),7.47(d,J＝8.53Hz,2H),8.18(d,J＝8.78Hz,2H)。
中間體19
向中間體18(0.43g，1.49mmol)和NaHCO 3(1.251g，14.89mmol)在丙酮(30mL)和水(15mL)的混合物中的溶液中添加(9H-芴-9-基)甲基2,5-二氧代吡咯烷-1-基碳酸酯(0.502g，1.49mmol)。將混合物在室溫下攪拌過夜。LC/MS表明反應(yīng)完成?；旌衔镉名}酸酸化至pH 2，并且真空蒸發(fā)丙酮。將產(chǎn)物用DCM(3×60mL)萃取。將合并的有機(jī)萃取物用1N HCl溶液(40mL)，鹽水(40mL)洗滌，用Na2SO4干燥，并且真空蒸發(fā)。通過快速硅膠色譜法(EtOAc從0％至100％在DCM中)純化殘余物，以給出(2S,4R)-4-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-2-甲基-(4-硝基苯基)戊酸(0.630g，89％)，為白色固體。LC-MS：475.5(M+H)；1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm 0.81-1.06(m,1H),1.08-1.28(m,2H),1.33-1.75(m,1H),1.77-2.11(m,1H),2.36-2.69(m,2H),2.76-3.18(m,1H),3.43-4.08(m,1H),4.09-4.19(m,1H),4.21-4.53(m,2H),4.54-4.80(m,1H),7.18-7.58(m,8H),7.66-7.82(m,2H),7.95-8.17(m,2H),8.67(br.s.,1H。
中間體20
將DIEA(0.419mL，2.40mmol)添加到中間體19(0.380g，0.80mmol)在DCM(4.5mL)中的溶液中，并且將混合物在室溫下攪拌5min，然后將2-氯三苯甲基氯樹脂(0.4mmol/g負(fù)載量，0.5g，0.80mmol)添加到混合物中。將混合物在室溫下振蕩過夜，所得樹脂用DMF(3×6mL)，MeOH(3×6mL)，和DCM(3×6mL)洗滌，然后用DIEA(0.419mL，2.40mmol)和MeOH/DCM(1:1，5mL)在室溫下處理30min。將所得樹脂過濾，用DMF(3×6mL)，MeOH(3×6mL)，和DCM(3×6mL)洗滌，在高真空中干燥過夜。從樹脂上切下少量的化合物，并且通過LC/MS分析。將所得樹脂用于下一步反應(yīng)。LC/MS：475(M+1)。
中間體21
向樹脂中間體20(0.5g，0.80mmol)中添加DMF中的20％哌啶(5mL)。將混合物在室溫下振蕩6min，過濾所得樹脂，用DMF(3×6mL)，MeOH(3×6mL)，DCM(3×6mL)洗滌，并且在真空中干燥。少量的化合物從樹脂上切下，通過LC/MS分析，這表明反應(yīng)完成。將所得樹脂用于下一步反應(yīng)。LC/MS：253(M+H)。
中間體22
在室溫下，向中間體21樹脂(0.5g，1.88mmol)中添加中間體11(1.108g，2.07mmol)，HATU(1.428g，3.76mmol)，2,4,6-三甲基吡啶(0.500mL，3.76mmol)，和DIEA(0.656mL，3.76mmol)在DMF(5mL)中的溶液。將混合物在室溫下振蕩兩小時(shí)，并且過濾所得樹脂，用DMF(3×6mL)，MeOH(3×6mL)，和DCM(3×6mL)洗滌，并且在真空中干燥。少量的化合物從樹脂上切下，通過LC/MS分析，這表明反應(yīng)完成。將所得樹脂用于下一步驟。LC/MS：771(M+H)。
中間體23
向中間體22樹脂(0.5g，0.80mmol)中添加DMF(5mL)中的20％哌啶。將混合物在室溫下振蕩6min，過濾所得樹脂，用DMF(3×6mL)，MeOH(3×6mL)，DCM(3×6mL)洗滌，并且在真空中干燥。少量的化合物從樹脂上切下，通過LC/MS分析，這表明反應(yīng)完成。將所得樹脂用于下一步反應(yīng)。LC-MS：549(M+1)。
中間體24
向(2S,3S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-3-甲基戊酸(Fmoc-異亮氨酸)(7g，19.81mmol)和吡啶(1.602mL，19.81mmol)在DCM(120mL)中的溶液中經(jīng)由套管經(jīng)10min添加DAST(3.11mL，23.77mmol)在DCM(20mL)中的溶液。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌1小時(shí)，用DCM(80mL)稀釋，用冰冷的水(2×200mL)洗滌，將有機(jī)層用MgSO4干燥，過濾，并且真空蒸發(fā)，以給出(2S,3S)-1-氟-3-甲基-1-氧代戊-2-基氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲酯(6.65g，94％)，為白色固體。進(jìn)行酯化試驗(yàn)，以通過將Fmoc-Ile-F(5mg)溶解在無(wú)水MeOH(0.3mL)和DIEA(0.030mL)中，并且允許其在室溫下反應(yīng)15min來確保定量的?；纬伞Ｈ缓笳婵照舭l(fā)混合物發(fā)并且通過LCMS分析，示出存在小于1％的Fmoc-Ile-OH。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δppm 0.83-1.12(m,6H)1.18-1.37(m,1H)1.42-1.59(m,1H)2.01(br.s.,1H)4.26(t,J＝6.78Hz,1H)4.44-4.63(m,3H)5.20(d,J＝8.53Hz,1H)7.31-7.39(m,2H)7.40-7.47(m,2H)7.61(d,J＝7.28Hz,2H)7.80(d,J＝7.53Hz,2H)
中間體25
在室溫下，向中間體23樹脂(0.5g，0.80mmol)中添加中間體24(0.569g，1.60mmol)，DMAP(4.89mg，0.04mmol)，和DIEA(0.419mL，2.40mmol)在DCM(5mL)中的溶液。將混合物在室溫下振蕩過夜，過濾所得樹脂，用DMF(3×6mL)，MeOH(3×6mL)，DCM(3×6mL)洗滌，在高真空中干燥。從樹脂上切下少量的化合物，并且通過LC/MS分析。LC/MS表明反應(yīng)完成。將所得樹脂用于下一步反應(yīng)。LC-MS：884(M+H)。
中間體26
向中間體25樹脂(0.5g，0.80mmol)中添加DMF(5mL)中的20％哌啶。將混合物在室溫下振蕩6min，過濾所得樹脂，用DMF(3×6mL)，MeOH(3×6mL)，DCM(3×6mL)洗滌，并且在真空中干燥。少量的化合物從樹脂上切下，通過LC/MS分析，這表明反應(yīng)完成。將所得樹脂用于下一步反應(yīng)。LC/MS：662(M+1)。
中間體27
向樹脂中間體26(0.5g，0.80mmol)中添加中間體1(0.252g，1.60mmol)，HATU(0.608g，1.60mmol)，2,4,6-三甲基吡啶(0.320mL，2.40mmol)，和DIEA(0.419mL，2.40mmol)在DMF(5mL)中的溶液。將混合物在室溫下振蕩2小時(shí)，過濾所得樹脂，用DMF(3×6mL)，MeOH(3×6mL)，和DCM(3×6mL)洗滌，并且在真空中干燥。少量的化合物從樹脂上切下，通過LC/MS分析，這表明反應(yīng)完成。將所得樹脂用于下一步反應(yīng)。LC-MS：801(M+1)。
中間體28
向樹脂中間體27中添加氯化錫(II)脫水物(1.805g，8.00mmol)，和乙酸鈉(0.197g，2.40mmol)在DMF(5mL)中的溶液。將混合物在室溫下振蕩4小時(shí)。將所得樹脂過濾，用DMF(3×6mL)，MeOH(3×6mL)，和DCM(3×6mL)洗滌，并且在真空中干燥。少量的化合物從樹脂上切下，通過LCMS分析，這表明反應(yīng)完成。將所得樹脂用于下一步驟。LC-MS：771(M+H)。
化合物1
在室溫下向樹脂中間體28(0.1g，0.16mmol)中添加DCM(1mL)，水(0.200mL)和TFA(1mL)。將混合物在室溫下振蕩20min，然后過濾，并且用水/TFA(1:1，3×2mL)洗滌樹脂，并且真空蒸發(fā)濾液。殘余物通過反相HPLC(ACN/H2O 0.1％TFA，ACN從5％至50％，在14min內(nèi))純化。將純的級(jí)分凍干，以給出(2S,4R)-4-(2-((1R,3R)-1-乙酰氧基-3-((2S,3S)-2-((2R,4R)-1,4-二甲基哌啶-2-甲酰胺基)-N-乙基-3-甲基戊酰胺基)-4-甲基戊基)噻唑-4-甲酰胺基)-5-(4-氨基苯基)-2-甲基戊酸(0.050g，35.3％)，為一種固體。LC/MS：771.8[M+1]；1H NMR(400MHz,甲醇-d4)d ppm 7.8(s,1H),7.30(d,J＝8.53Hz,2H),7.08-7.18(m,2H),5.66(d,J＝13.05Hz,1H),4.57(d,J＝8.53Hz,1H),4.29(ddd,J＝9.98,6.71,2.89Hz,1H),3.90(br.s.,1H),3.73(d,J＝6.27Hz,1H),3.24-3.33(m,1H),2.84(d,J＝7.28Hz,2H),2.68(br.s.,3H),2.40-2.53(m,2H),2.20-2.36(m,1H),2.03-2.12(m,4H),1.75-2.00(m,7H),1.64(ddd,J＝14.12,10.23,4.02Hz,2H),1.42-1.57(m,2H),1.30(t,J＝7.15Hz,3H),1.01-1.17(m,7H),0.88-0.98(m,7H),0.84(t,J＝7.40Hz,3H),0.77d,J＝6.53Hz,3H)。
中間體29
向2-乙基哌啶-2-甲酸(320mg，1.65mmol)在MeOH(4.0mL)和水(4.0mL)中的溶液中添加多聚甲醛(372mg，4.13mmol)和Pd/C(10％mg，0.83mmol)。添加一當(dāng)量的碳酸鈉(175mg，1.65mmol)，并且將反應(yīng)混合物在氫氣氛下在室溫下攪拌過夜。LC/MS表明起始材料的完全轉(zhuǎn)化。將該反應(yīng)混合物通過硅藻土過濾。將濾餅用MeOH(2×30mL)洗滌。將濾液真空濃縮，以給出粗產(chǎn)物。將粗固體懸浮于甲醇(50mL)中，并且過濾所得懸浮液，并且濃縮濾液，以給出2-乙基-1-甲基哌啶-2-甲酸(202mg，71.4％)，為一種固體。LC/MS：172(M+1)；1H NMR(400MHz,CD3OD)δppm 3.58(td,J＝12.80,3.51Hz,1H),3.09-3.20(m,1H),2.81(s,3H),2.17-2.29(m,1H),1.54-1.84(m,7H),0.98(t,J＝7.40Hz,3H)。
中間體30
向樹脂中間體26(0.2g，0.32mmol)中添加中間體29(0.082g，0.48mmol)，HATU(0.243g，0.64mmol)，2,4,6-三甲基吡啶(0.127mL，0.96mmol)和DIPEA(0.168mL，0.96mmol)在DMF(5mL)中的溶液。將混合物在室溫下振蕩2小時(shí)，過濾所得樹脂，用DMF(3×4mL)，MeOH(3×4mL)，和DCM(3×4mL)洗滌，并且在真空中干燥。少量的化合物從樹脂上切下，通過LCMS分析，這表明反應(yīng)完成。將所得樹脂用于下一步反應(yīng)。LC/MS：815(M+H)。
中間體31
向樹脂中間體30中添加氯化錫(II)二水合物(0.544g，2.41mmol)和乙酸鈉(0.059g，0.72mmol)在DMF(5mL)中的溶液。將混合物在室溫下振蕩4小時(shí)，過濾所得樹脂，用DMF(3×6mL)，MeOH(3×6mL)，和DCM(3×6mL)洗滌，并且在真空中干燥。少量的化合物從樹脂上切下，通過LCMS分析，這表明反應(yīng)完成。將所得樹脂用于下一步反應(yīng)。LC-MS：785(M+H)。
化合物2
在室溫下，向樹脂中間體31中添加DCM(2mL)和TFA(0.493mL，6.40mmol)。將混合物在室溫下振蕩20min。將樹脂用DCM/TFA(1:1，3×2mL)洗滌，并且真空蒸發(fā)濾液。將殘余物通過反相HPLC(ACN/H2O 0.1％甲酸，ACN從10％至50％，在14min內(nèi))純化。將純級(jí)分凍干，以給出(2S,4R)-4-(2-((1R,3R)-1-乙酰氧基-3-((2S,3S)-N-乙基-2-(2-乙基-1-甲基哌啶-2-甲酰胺基)-3-甲基戊酰胺基)-4-甲基戊基)噻唑-4-甲酰胺基)-5-(4-氨基苯基)-2-甲基戊酸(0.057g，20.31％)，為白色固體。LC-MS：785(M+H).；1H NMR(400MHz,CD3OD)δppm 7.98(s,1H),6.87(m,J＝8.28Hz,2H),6.54(m,J＝8.03Hz,2H),5.63-5.73(m,1H),4.60-4.71(m,3H),4.17(br.s.,2H),3.76(dd,J＝14.93,7.15Hz,1H),2.69(d,J＝6.53Hz,2H),2.42(br.s.,1H),2.36(s,3H),2.29(br.s.,2H),2.03-2.12(m,3H),1.88(d,J＝9.79Hz,3H),1.79(br.s.,2H),1.49-1.64(m,5H),1.43(br.s.,2H),1.23-1.35(m,4H),1.11(d,J＝7.78Hz,1H),1.06(d,J＝7.03Hz,4H),0.93(d,J＝15.81Hz,3H),0.94(d,J＝15.56Hz,3H),0.70-0.87(m,9H)。
中間體32
向在ACN(20mL)中的1-(叔丁氧基羰基)-2-甲基哌啶-2-甲酸(1g，4.11mmol)和碳酸鉀(0.852g，6.17mmol)的懸浮液中滴加芐基溴(0.733mL，6.17mmol)。將所得反應(yīng)混合物在RT下攪拌過夜。LC/MS指示形成希望的產(chǎn)物。將反應(yīng)混合物用水(2mL)稀釋，并且用乙酸乙酯(2×30mL)萃取。將合并的萃取液用硫酸鈉干燥，過濾并且濃縮。通過快速色譜(硅膠，己烷/乙酸乙酯，80/20洗脫液)純化粗材料，以產(chǎn)生1-(叔丁基)2-甲基哌啶-1,2-二甲酸2-芐酯(1.27g，92％)，為一種油。LC-MS：356(M+Na)；1H NMR(400MHz,CD2Cl2)δppm 7.33-7.45(m,5H),5.13-5.27(m,2H),3.91-4.09(m,1H),2.83-3.09(m,1H),2.10-2.32(m,1H),1.56-1.72(m,1H),1.30-1.51(m,12H),1.09(qd,J＝12.42,4.64Hz,1H),0.90-0.98(m,3H)。
中間體33
向中間體32(1.2g，3.60mmol)在DCM(10mL)中的溶液中滴加TFA(4.16mL，53.99mmol)。將所得反應(yīng)混合物在室溫下攪拌2小時(shí)。LC/MS表明Boc的完全去保護(hù)。減壓除去溶劑。將粗材料用飽和碳酸氫鈉水溶液堿化，并且水層用乙酸乙酯(2×50mL)萃取。將合并的萃取物用硫酸鈉干燥，過濾并且濃縮，以給出2-甲基哌啶-2-甲酸芐酯(810mg)，為一種油。將粗產(chǎn)物不經(jīng)純化即用于下一步驟。LC/MS：234(M+1)。
中間體34
在0℃下，向中間體33(1.45g，6.22mmol)和DIEA(2.388mL，13.67mmol)在DCM(25mL)中的溶液中滴加氯甲酸芐酯(0.875mL，6.22mmol)。將所得溶液在室溫下攪拌2小時(shí)。將反應(yīng)混合物用30mL的DCM和4mL的飽和碳酸氫鈉水溶液稀釋，攪拌5分鐘。分離有機(jī)層，并且用DCM萃取水層(2×30mL)。將合并的有機(jī)萃取物用硫酸鈉干燥，過濾并且濃縮。粗產(chǎn)物通過快速色譜法(硅膠，己烷/乙酸乙酯，90/10)純化，以給出2-甲基哌啶-1,2-二甲酸二芐酯(1.32g，58％)，為一種油。LC-MS：268(M+1)；1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δppm 7.21-7.42(m,10H),5.04-5.18(m,2H),5.00(br.s.,2H),4.91(br.s.,1H),3.88(d,J＝12.80Hz,1H),3.17(t,J＝9.54Hz,1H),1.83-1.97(m,1H),1.55-1.78(m,4H),1.51(s,3H)。
中間體35
使中間體34經(jīng)歷兩種對(duì)映異構(gòu)體的SFC手性柱拆分(Chiralpak AD，二氧化碳/甲醇90％-10％)，分離希望的產(chǎn)物(R)-2-甲基哌啶-1,2-二甲酸二芐酯，LC-MS：368(M+1)；1H NMR(400MHz,CD3OD)δppm 7.19-7.44(m,10H),5.04-5.15(m,2H),5.00(br.s.,2H),3.88(d,J＝13.05Hz,1H),3.17(t,J＝9.54Hz,1H),1.84-1.97(m,1H),1.55-1.78(m,5H),1.51(s,3H)；％ee:>98:旋光度：[α]D：+2°(甲醇)
中間體36
向中間體35(600mg，1.63mmol)在甲醇(10mL)中的溶液中添加多聚甲醛(49.0mg，1.63mmol)和碳載鈀(174mg，1.63mmol)。將反應(yīng)混合物在氫氣氛下在室溫下攪拌過夜。LC/MS指示起始材料的完成。將反應(yīng)混合物過濾，用MeOH(2×30mL)洗滌催化劑。將濾液真空濃縮，以給出粗產(chǎn)物，為白色固體，將其用乙醚(3×30mL)洗滌，在高真空中干燥過夜，以產(chǎn)生1,2-二甲基哌啶-2-甲酸(230mg，90％)，為白色固體。LC-MS：158(M+1)；1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δppm 3.03-3.18(m,1H),2.76(br.s.,3H),2.01(br.s.,1H),1.83(br.s.,2H),1.72-1.81(m,1H),1.62-1.71(m,2H),1.48(s,3H).；旋光度：αD+24°(甲醇)。
中間體37
向中間體樹脂26(0.5g，0.80mmol)中添加中間體36(0.189g，1.20mmol)，HATU(0.608g，1.60mmol)，2,4,6-三甲基吡啶(0.318mL，2.40mmol)和DIEA(0.419mL，2.40mmol)在DMF(5mL)中的溶液。將混合物在室溫下振蕩2小時(shí)，過濾所得樹脂，用DMF(3×6mL)，MeOH(3×6mL)，和DCM(3×6mL)洗滌，并且干燥。少量的化合物從樹脂上切下，通過LC/MS分析，這表明反應(yīng)完成。將所得樹脂用于下一步反應(yīng)。LC-MS：801(M+1)。
中間體38
向樹脂中間體37(0.5g，0.80mmol)中添加氯化錫(II)二水合物(1.384g，6.13mmol)和乙酸鈉(0.151g，1.84mmol)在DMF(5mL)中的溶液。將混合物在室溫下振蕩4小時(shí)，并且過濾所得樹脂，用DMF(3×6mL)，MeOH(3×6mL)，和DCM(3×6mL)洗滌，并且在真空中干燥。少量的化合物從樹脂上切下，通過LC/MS分析，這表明反應(yīng)完成。將所得樹脂用于下一步反應(yīng)。LC-MS：771(M+H)。
化合物3
在室溫下向樹脂中間體38(0.15g，0.24mmol)中添加DCM(5mL)和TFA(0.370mL，4.80mmol)。將混合物在室溫下振蕩10min，然后過濾，并且用DCM(2×50mL)洗滌。真空蒸發(fā)濾液。將殘余物通過反相HPLC(ACN/H2O 0.1％甲酸，ACN從10％至50％，在14min內(nèi))純化。將純級(jí)分凍干，以給出(2S,4R)-4-(2-((1R,3R)-1-乙酰氧基-3-((2S,3S)-2-((R)-2-甲酰胺基)-N-乙基-3-甲基戊酰胺基)-4-甲基戊基)噻唑-4-甲酰胺基)-5-(4-氨基苯基)-2-甲基戊酸(0.037g，17.86％)，為一種固體。LC/MS：771(M+1)；1H NMR(400MHz,CD3OD)δppm 7.97(s,1H),6.87(d,J＝8.03Hz,2H),6.53(d J＝8.03Hz,2H),5.67(d,J＝12.80Hz,1H),4.59(d,J＝8.28Hz,1H),4.17(br.s.,2H),3.72(d,J＝7.28Hz,1H),2.69(d,J＝6.27Hz,3H),2.42(br.s.,2H),2.28(br.s.,2H),2.17(s,3H),2.07(s,3H),1.74-1.94(m,3H),1.45-1.62(m,4H),1.36(br.s.,3H),1.27(t,J＝7.03Hz,3H),1.10(s,3H),1.06(d,J＝7.03Hz,4H),0.95(d,J＝6.53Hz,3H),0.90(d,J＝6.78Hz,4H),0.83(t,J＝7.40Hz,4H),0.74(d,J＝6.27Hz,3H)。
中間體39
在0℃下，在攪拌下，將三乙胺(40g，0.4mol)添加到Boc-L-苯丙氨酸(90g，0.34mol)和N,O-二甲基羥胺鹽酸鹽(36.5g，0.37mol)在DCM(500mL)中的懸浮液中。將懸浮液攪拌10min，并且添加EDCI(HCl鹽，72g，0.37mol)。將懸浮液在0℃下再攪拌3小時(shí)。將混合物用飽和NaHCO3水溶液(1L)淬滅。分離這些層，并且水相用DCM(500mL×3)再萃取。將合并的有機(jī)相用水(1L×3)，5％KHSO4水溶液(1L×3)，飽和NaHCO3水溶液(1L×3)，和鹽水(1L×1)洗滌，干燥(Na2SO4)，并且濃縮至干燥。將粗材料通過快速色譜法(硅膠，EtOAc/己烷＝1:1)進(jìn)一步純化，并且給出(S)-叔丁基1-(甲氧基(甲基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基氨基甲酸酯(85.1g，81％產(chǎn)率)，為白色固體。1H NMR(300MHz,CDCl3):δ7.15～7.26(m,5H),5.25(bs,1H),4.95(m,1H),3.63(s,3H),3.14(s,3H),2.83～3.07(m,2H),1.37(s,9H)。
中間體40
在-10℃下，在攪拌下，經(jīng)1小時(shí)，將中間體39(97.1g，0.315mol)在干THF(500mL)中的溶液滴加到LiAlH4(12.0g，0.316mol)在干THF(200mL)中的懸浮液中。將懸浮液在0℃下再攪拌3小時(shí)，然后在-10℃下用水(12mL)，15％NaOH水溶液(12mL)和水(12mL×3)猝滅。攪拌0.5小時(shí)后，過濾混合物，將濾液濃縮至干燥，以給出(S)-叔丁基1-氧代-3-苯基丙-2-基氨基甲酸酯(45.2g，粗品)，將其不經(jīng)進(jìn)一步純化即用于下一步驟。1H NMR(300MHz,CDCl3):δ9.65(s,1H),7.17～7.33(m,5H),4.80(m,1H),2.80～3.15(m,2H),1.45(s,9H)。
中間體41
將三苯基膦(173.7g，0.66mol)和2-溴-丙酸乙酯(100g，0.55mol)在乙酸乙酯(400mL)中的溶液在回流下加熱過夜。冷卻后，過濾混合物。將濾餅用乙酸乙酯洗滌并且干燥，以給出鏻鹽。將鏻鹽溶于DCM(400mL)中。添加分子篩(4A，50g)，隨后在室溫下，在攪拌下，滴加三乙胺(111g，1.1mol)。將混合物再攪拌1小時(shí)，然后過濾。將濾液用水(300mL×3)，5％KHSO4水溶液(300mL×3)，和鹽水(300mL×1)洗滌，干燥(Na2SO4)，并且濃縮至干燥。將粗材料通過快速色譜法(硅膠，EtOAc/己烷＝1:10)進(jìn)一步純化，并且給出(三苯基亞正膦基)丙酸乙酯(105g，52％產(chǎn)率)，為一種固體。1H NMR(300MHz,CDCl3):δ7.34～8.10(m,15H),4.02(q,J＝7.2Hz,2H),1.68(m,3H),1.01(t,J＝7.2Hz,3H)。
中間體42
將中間體40(52g，0.21mol)和中間體41(76g，0.21mol)在DCM(500mL)中的溶液在室溫下攪拌14小時(shí)。減壓除去溶劑。通過快速色譜法(硅膠，EtOAc/己烷＝1:10)進(jìn)一步純化殘余物，并且給出(S)-乙基4-(叔丁氧基羰基氨基)-2-甲基-5-苯基戊-2-烯酸酯(45.3g，64％產(chǎn)率)，為一種油。1H NMR(300MHz,CDCl3):δ7.17～7.32(m,5H),6.53(dd,J＝1.2和9Hz,1H),4.63(m,2H),4.18(q,J＝7.2Hz,2H),2.76～2.95(m,2H),1.72(s,3H),1.42(s,9H),1.28(t,J＝7.2Hz,3H)。
中間體43
將中間體42(45g，0.135mol)溶于包含10％Pd/C(10g)的MeOH(600mL)中。將反應(yīng)混合物在氫氣氛下在室溫下攪拌16h。將反應(yīng)混合物通過硅藻土過濾，并且將濾液在減壓下濃縮。將殘余物溶于丙酮(200mL)中，并且在0℃下添加NaOH水溶液(2M，135mL)。將混合物在室溫下攪拌10小時(shí)。將反應(yīng)混合物倒入HCl水溶液(2M，135mL)中，并且用DCM(300mL×3)萃取。將合并的有機(jī)萃取物干燥(MgSO4)，過濾，并且在減壓下濃縮，以給出(R)-4-(叔丁氧基羰基氨基)-2-甲基-5-苯基戊酸(41.0g，大約100％產(chǎn)率)，將其不經(jīng)進(jìn)一步純化即用于下一步驟。LC-MS證實(shí)其結(jié)構(gòu)。
中間體44
將中間體43(28g，0.091mol)溶于無(wú)水THF(200mL)中并且冷卻至-40℃。向這一溶液中添加三乙胺(10.1g，0.099mol)，隨后經(jīng)15min滴加氯甲酸乙酯(11g，0.10mol)。將反應(yīng)混合物在-40℃下再攪拌1小時(shí)，并且然后過濾以除去沉淀的材料。將濾液冷卻至0℃，經(jīng)30min用在水(20mL)中包含硼氫化鈉(7.5g，0.197mol)的水性懸浮液處理。將反應(yīng)混合物在0℃下攪拌30min，并且在室溫下再攪拌30min。將混合物用EtOAc(500mL)稀釋，并且用鹽水(500mL)洗滌。將水層用EtOAc(200mL×3)萃取。將合并的有機(jī)萃取物用飽和NaHCO3水溶液(500mL×2)，和鹽水(500mL)洗滌，干燥(MgSO4)，過濾，并且在減壓下濃縮，一提供油狀殘余物。通過快速色譜法(硅膠，EtOAc/己烷＝10:1)純化殘余物，并且給出叔丁基(2R,4S)-5-羥基-4-甲基-1-苯基戊-2-基氨基甲酸酯(17.5g，65％產(chǎn)率)，為一種油。1H NMR(300MHz,CDCl3):δ7.15～7.29(m,5H),4.60(m,1H),4.00(m,1H),3.45(d,J＝5.7Hz,2H),2.71～2.11(m,4H),1.78(m,1H),1.55(m,1H),1.38(s,9H),1.25(m,1H)。
中間體45
將戴斯-馬丁高碘烷(39g，89.4mmol)添加到中間體44(17.5g，59.7mmol)在DCM(300mL)中的溶液中，并且將懸浮液在室溫下攪拌15小時(shí)。將混合物用NaOH水溶液(1N，300mL×3)，和鹽水(300mL×3)洗滌，干燥(MgSO4)，過濾，并且減壓濃縮。通過快速色譜法(硅膠，EtOAc/己烷＝1:6)純化殘余物，并且給出叔丁基(3S,5R)-5-芐基-3-甲基-2-氧代吡咯烷-1-甲酸酯(9.1g，53％產(chǎn)率)，為一種油。1H NMR(300MHz,CDCl3):δ7.16～7.35(m,5H),4.30(m,1H),3.15(dd,J＝3.3和13.2Hz,1H),2.73(dd,J＝9.6和13.2Hz),2.42(m,1H),2.00～2.10(m,2H),1.58(s,9H),1.15(d,J＝6.9Hz,3H)。
中間體46
將中間體45(9.0g，31.1mmol)和HCl水溶液(4N，150mL)加熱回流4小時(shí)。冷卻后，減壓除去溶劑。將殘余物溶于丙酮(100mL)和水(100mL)中。用2M NaOH水溶液將溶液的pH調(diào)節(jié)至8.5，并逐滴添加Fmoc-OSu(12g，35mmol)在丙酮(20mL)中的溶液，在這一過程期間，將這一溶液的pH值用2M NaOH水溶液維持在8-9。將懸浮液攪拌4小時(shí)，然后用2M HCl水溶液酸化至pH 3，用EtOAc(200mL×3)萃取。將合并的有機(jī)相用水(100mL×3)，5％KHSO4水溶液(100mL×3)，和鹽水(100mL×1)洗滌，干燥(Na2SO4)，并且濃縮至干燥。通過快速色譜法(硅膠，EtOAc/己烷＝1:1)純化粗材料，并且給出(2S,4R)-4-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-甲基-5-苯基戊酸(5.3g，40％產(chǎn)率)。LC-MS：430[M+1]；1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δppm 7.78-7.83(m,2H),7.59-7.65(m,2H),7.37-7.43(m,2H),7.28-7.35(m,2H),7.14-7.26(m,5H),6.94-7.01(m,1H),4.28-4.36(m,1H),4.21-4.27(m,1H),4.10-4.16(m,1H),3.84-3.93(m,1H),2.68-2.82(m,2H),2.48-2.60(m,1H),1.86-1.95(m,1H),1.42-1.51(m,1H),1.17(d,J＝7.03Hz,3H),1.09-1.14(m,1H)。
方案
中間體47
在-20℃下經(jīng)15min向I-Me-Boc-L-Val-OH(27.3g，0.12mol)和三乙胺(14.7mL，0.13mol)在無(wú)水THF(200mL)中的溶液中滴加氯甲酸乙酯(12.6mL，0.13mol)，將所得白色懸浮液再攪拌30min。然后經(jīng)由套管將重氮甲烷溶液(0.36mol，由60g n-亞硝基-N-甲基脲制備并在氫氧化鉀上干燥)在乙醚(500mL)中的溶液引入反應(yīng)混合物中。允許將混合物加溫至室溫，再攪拌5小時(shí)，然后用乙酸水溶液(10％，250mL)小心淬滅。分離這些層，將有機(jī)層用飽和碳酸氫鈉(300mL×3)和鹽水(300mL×3)洗滌，干燥(Na2SO4)，濃縮至約200mL。將殘余物溶于THF(900mL)和水(100mL)中。將溶液加熱至40℃，并且添加乙酸銀(500mg)。將懸浮液攪拌5小時(shí)，然后濃縮至約300mL。將殘余物用EtOAc(500mL×3)萃取。將有機(jī)層用飽和碳酸氫鈉(300mL×3)和鹽水(300mL)洗滌，干燥(Na2SO4)，濃縮，以給出(R)-3-(叔丁氧羰基(甲基)氨基)-4-甲基戊酸(23.8g，81％產(chǎn)率)，將其不經(jīng)進(jìn)一步純化即用于下一步驟。1H NMR(300MHz,CDCl3):δ10.08(bs,1H),4.00(m,1H),2.75(m,3H),2.55(m,2H),1.43(s,9h),0.85～0.84(m,6H)。
中間體48
在0℃下，在攪拌下，將三乙胺(34.3mL，0.244mol)添加到中間體47(60g，0.244mol)和N,O-二甲基氫胺鹽酸鹽(23.9g，0.244mol)在CH2Cl2(300mL)中的懸浮液中。將懸浮液在這一溫度下攪拌0.5小時(shí)，然后在0℃下分批添加EDCI(46.9g，0.244mol)。將反應(yīng)混合物在0℃下再攪拌2小時(shí)，然后用水(300mL)淬滅。分離有機(jī)相，并且用5％KHSO4水溶液(300mL×3)，飽和NaHCO3水溶液(300mL×3)，和鹽水(300mL×1)洗滌，干燥(Na2SO4)，并且濃縮至干燥。通過硅膠色譜法(EtOAc/己烷＝1:3)進(jìn)一步純化殘余物，并且給出叔丁基(R)-(1-(甲氧基(甲基)氨基)-4-甲基-1-氧代戊烷-3-基)(甲基)氨基甲酸酯(52g，74％產(chǎn)率)，為一種油。
中間體49
在0℃下，經(jīng)1小時(shí)的時(shí)段，將亞硝酸叔丁酯(由0.61mol的NaNO2和110mL的叔丁醇制備)滴加到CuBr2(260g，1.16mol)和2-氨基噻唑-4-甲酸乙酯(100g，0.58mol)在ACN(500mL)中的懸浮液中。將混合物在室溫下攪拌12小時(shí)，然后用EtOAc(800mL)和水(800mL)淬滅。將混合物過濾，并且將濾液分離成水相和有機(jī)相。將水相用EtOAc(800mL×2)萃取。將合并的有機(jī)萃取物用5％KHSO4水溶液(300mL×3)，飽和NaHCO3水溶液(300mL×3)，和鹽水(300mL×1)洗滌，干燥(Na2SO4)，并且濃縮至干燥，以給出2-溴噻唑-4-甲酸乙酯(79.4g，58％產(chǎn)率)，將其不經(jīng)進(jìn)一步純化即用于下一步驟。1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ7.45(s,1H),4.20(q,J＝7.2Hz,2H),1.25(t,J＝7.2Hz,3H)。
中間體50
在50℃下，在攪拌下，經(jīng)0.5小時(shí)的時(shí)段，將NaBH4(16.5g，0.43mol)分批添加到中間體49(68g，0.288mol)在乙醇(500mL)中的溶液中。將懸浮液加熱回流5小時(shí)，分批添加另一批NaBH4(8.25g，0.22mol)。將混合物在回流下再加熱12小時(shí)。冷卻至室溫后，減壓除去溶劑，并且將殘余物溶于DCM(500mL)中，并且用飽和NaHCO3水溶液(300mL×3)，和鹽水(300mL×1)洗滌，干燥(Na2SO4)，并且濃縮至干燥，以給出一種醇。將該醇溶于DMF(300mL)中，并且添加咪唑(28.3g，0.416mol)。在室溫下，將TBS-Cl(62.4g，0.416mol)在THF(100mL)中的溶液滴加到這一溶液中。將混合物攪拌12小時(shí)，然后用水(800mL)淬滅，并且用EtOAc(800mL×2)萃取。將合并的有機(jī)萃取物用5％KHSO4水溶液(300mL×3)，飽和NaHCO3水溶液(300mL×3)，和鹽水(300mL×1)洗滌，干燥(Na2SO4)，并且濃縮至干燥。通過快速色譜法(硅膠，EtOAc/己烷＝1:30)純化殘余物，并且給出2-溴-4-((叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)甲基)噻唑(42.0g，兩步產(chǎn)率47％)，為一種油。1H NMR(300MHz,CDCl3):δ7.15(t,J＝1.5Hz,1H),4.84(d,J＝1.5Hz,2H),0.94 9s,9H),0.12(s,6H)。
中間體51
在N2下在攪拌下，在-78℃下，在攪拌下，經(jīng)1小時(shí)將n-BuLi(77ml，2.5N，在己烷中，0.19mol)的溶液滴加到中間體50(53.9g，0.175mol)在干THF中的溶液中。將懸浮液在這一溫度下攪拌30min。然后在-78℃下經(jīng)30min滴加中間體48(50.4g，0.175mol)在干THF(200mL)中的溶液。將反應(yīng)混合物在這一溫度下攪拌1小時(shí)，然后允許加溫至室溫并攪拌12小時(shí)。將混合物用20％氯化銨水溶液(1L)淬滅，并且減壓除去有機(jī)溶劑。將所得混合物用EtOAc(500mL×3)萃取。將合并的有機(jī)相用5％KHSO4水溶液(500mL×3)，飽和NaHCO3水溶液(500mL×3)，和鹽水(500mL×1)洗滌，干燥(Na2SO4)，并且濃縮至干燥。粗材料通過快速色譜法(硅膠，EtOAc/己烷＝1:10)進(jìn)一步純化，并且給出(R)-叔丁基1-(4-((叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)甲基)噻唑-2-基)4-甲基-1-氧代戊-3-基(甲基)氨基甲酸酯(38.1g，48％產(chǎn)率)，為一種油。1H NMR(300MHz,CDCl3):δ7.55(m,1H),4.91(s,2H),4.27(m,1H),3.20～3.60(m,2H),1.90(m,1H),1.03(d,J＝6.6Hz,3H),0.97(s,9H),0.88(d,J＝6.6Hz,3H),0.15(s,6H)。
中間體52
在室溫下，在攪拌下，經(jīng)0.5小時(shí)的時(shí)段將NaBH4(4.7g，125mmol)分批添加到中間體51(38.0g，83.3mmol)在甲醇(200mL)中的溶液中。將懸浮液攪拌2小時(shí)，并且添加另一批NaBH4(1.5g，40mmol)，并且將混合物再攪拌2小時(shí)。減壓除去溶劑，并且將殘余物溶于EtOAc(200mL)中，用飽和NaHCO3水溶液(200mL×3)，和鹽水(200mL×1)洗滌，干燥(Na2SO4)，并且濃縮至干燥。將粗材料通過硅膠色譜法(EtOAc/己烷＝1:6)進(jìn)一步純化，并且給出叔丁基(1R,3R)-1-(4-((叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)甲基)噻唑-2-基)-1-羥基-4-甲基戊-3-基(甲基)氨基甲酸酯(16.2g，42％產(chǎn)率)和叔丁基((1S,3R)-1-(4-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)噻唑-2-基)-1-羥基-4-甲基戊-3-基(甲基)氨基甲酸酯(異構(gòu)體，17.3g，45％產(chǎn)率)。
叔丁基(1R,3R)-1-(4-((叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)甲基)噻唑-2-基)-1-羥基-4-甲基戊-3-基(甲基)氨基甲酸酯(1R,3R-異構(gòu)體)：1H NMR(300MHz,CDCl3):δ7.11(s,1H),4.98(bs,1H),4.80(s,2H),4.68(dt,J＝11.7Hz,1H),3.95(dt,J＝3.3和12Hz,1H),2.75(s,3H),1.70～1.95(m,2H),1.49(s,9H),0.95(s,9H),0.85～0.95(m,6H),0.15(s,6H)。
叔丁基((1S,3R)-1-(4-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)噻唑-2-基)-1-羥基-4-甲基戊-3-基(甲基)氨基甲酸酯(1S,3R-異構(gòu)體)：1H NMR(300MHz,CDCl3):δ7.07(s,1H),5.01(m,1H),4.81(s,2H),4.81(bs,1H),3.86(dt,J＝3.3和10.5Hz,1H),2.35(s,3H),2.25(m,1H),1.74(m,1H),1.43(s,9H),1.00(d,J＝6.6Hz,3H),0.96(s,9H),0.84(d,J＝6.6Hz,3H),0.15(s,6H)。
中間體53
在0°C下，在攪拌下，經(jīng)1小時(shí)，將乙酰氯(22.5mL，0.316mol)滴加到中間體52(19.7g，43mmol)在吡啶(140mL)中的溶液中。允許將反應(yīng)混合物加溫至室溫并且攪拌12小時(shí)。將混合物用水(200mL)淬滅并且減壓除去有機(jī)溶劑。將殘余物溶于DCM(500mL)中并且用5％KHSO4水溶液(200mL×3)，飽和NaHCO3水溶液(200mL×3)，和鹽水(200mL×1)洗滌，干燥(Na2SO4)，并且濃縮至干燥。通過快速色譜(硅膠，EtOAc/己烷＝1:10)純化粗材料，并且給出(1R,3R)-3-(叔丁氧基羰基(甲基)氨基)-1-(4-((叔丁基二甲基甲硅烷基氧基)甲基)噻唑-2-基)-4-甲基戊基乙酸酯(18.5g，86％產(chǎn)率)，為一種油。LC-MS證實(shí)其結(jié)構(gòu)。
中間體54
在0℃下，在攪拌下，將四丁基氟化銨(45.7g，175mmol)在THF(100mL)中的溶液滴加到中間體53(17.5g，35mmol)在THF(100mL)中的溶液中。允許將反應(yīng)混合物加溫至室溫并且攪拌12小時(shí)。將混合物用水(100mL)淬滅并且減壓除去有機(jī)溶劑。將殘余物溶于CH2Cl2(500mL)中并且用5％KHSO4水溶液(200mL×3)，飽和NaHCO3水溶液(200mL×3)，和鹽水(200mL×1)洗滌，干燥(Na2SO4)，并且濃縮至干燥。通過快速色譜(硅膠，EtOAc/己烷＝1:4)純化粗材料，并且給出(1R,3R)-3-(叔丁氧基羰基(甲基)氨基)-1-(4-(羥甲基)吡啶-2-基)-4-甲基戊基乙酸酯(9.3g，69％產(chǎn)率)，為一種油。1H NMR(300MHz,CDCl3):δ7.15(d,J＝3Hz,1H),5.81～5.86(m,1H),4.74(d,J＝3Hz,2H),4.11(m,1H),2.70和2.63(s,3H),2.31(m,1H),2.15(s,3H),2.05(m,1H),1.70(m,1H),1.47(s,9H),0.98(d,J＝6.6Hz,3H),0.86(d,J＝6.6Hz,3H)。
中間體55
將戴斯-馬丁高碘烷(14.9g，34.2mmol)添加到中間體54(8.8g，22.8mmol)在二氯甲烷(250mL)中的溶液中。將反應(yīng)混合物在室溫下攪拌12小時(shí)，然后用氫氧化鈉水溶液(1N，200mL×3)，硫代硫酸鈉水溶液(1N，200mL×3)，飽和NaHCO3水溶液(200mL×3)，和鹽水(200mL×1)洗滌，干燥(Na2SO4)，并且濃縮至干燥，以給出醛。
將該粗醛溶于叔丁醇(250mL)中，并且在室溫下經(jīng)1小時(shí)滴加亞氯酸鈉(80％，11.6g，102mmol)和磷酸二氫鈉一水合物(33.6g，244mmol)在水(150mL)中的溶液。將反應(yīng)混合物再攪拌16h，然后用鹽酸(0.1N，100mL)稀釋，并且用EtOAc(200mL×3)萃取。將合并的有機(jī)層用5％KHSO4水溶液(200mL×3)和鹽水(200mL×1)洗滌，干燥(Na2SO4)，并且濃縮至干燥，以給出2-((1R,3R)-1-乙酰氧基-3-(叔丁氧基羰基(甲基)氨基)-4-甲基戊基)噻唑-4-甲酸(7.5g，82％產(chǎn)率)，將其不經(jīng)進(jìn)一步純化即用于下一步驟。1H NMR(300MHz,CDCl3):δ8.26(s,1H),5.87～6.01(m,1H),4.15(m,1H),2.72和2.65(s,3H),2.35(m,1H),2.20(s,3H),2.18(m,1H),1.75(m,1H),1.49(s,9H),1.00(d,J＝6.6Hz,3H),0.88(d,J＝6.6Hz,3H)。
中間體56
將TFA(30mL)添加到中間體55(7.4g，18.5mmol)在二氯甲烷(80mL)中的溶液中。將混合物攪拌12小時(shí)，并且減壓除去溶劑。將殘余物溶于丙酮(100mL)和水(100mL)中。用2M NaOH水溶液將溶液pH調(diào)節(jié)至8.5，并且滴加Fmoc-OSu(6.2g，18.5mmol)在丙酮(50mL)中的溶液，在這一過程期間，將這一溶液的pH用2M NaOH水溶液維持在8-9。將懸浮液攪拌4小時(shí)，用2M HCl水溶液酸化至pH3，用EtOAc(200mL×3)萃取。將合并的有機(jī)相用水(100mL×3)，5％KHSO4水溶液(100mL×3)，和鹽水(100mL×1)洗滌，干燥(Na2SO4)，并且濃縮至干燥。通過快速色譜法(硅膠，MeOH/CH2Cl2＝1:40)純化粗材料，并且給出2-((1R,3R)-3-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)甲基)氨基)-1-乙酰氧基-4-甲基戊基)噻唑-4-甲酸(5.1g，53％產(chǎn)率)。LC-MS：523[M+1]；1H NMR(400MHz,CDCl3)δppm 0.56(br.s.,1H)0.67-0.82(m,2H)0.83-0.96(m,2H)1.64(dt,J＝10.36,6.57Hz,1H)1.88(s,1H)2.07(s,2H)2.09-2.17(m,1H)2.19-2.33(m,1H)2.52-2.67(m,3H)3.86-4.01(m,1H)4.08(s,1H)4.12-4.21(m,1H)4.29-4.40(m,1H)4.68(dd,J＝10.61,5.56Hz,1H)5.85(dd,J＝10.86,3.28Hz,1H)7.19-7.27(m,2H)7.27-7.35(m,2H)7.42-7.58(m,2H)7.61-7.71(m,2H)8.11-8.19(m,1H)
中間體57
將DIEA(0.419mL，2.40mmol)添加到中間體46(0.344g，0.80mmol)在DCM(1.5mL)中的溶液中，并且將混合物在室溫下攪拌5min，然后添加2-氯三苯甲基氯樹脂(0.5g，0.80mmol)到混合物中。將混合物在室溫下振蕩4小時(shí)，所得樹脂用DMF(3×6mL)，MeOH(3×6mL)，和DCM(3×6mL)洗滌，然后用DIEA(0.419mL，2.40mmol)MeOH/DCM(1:1，5mL)在室溫下處理30min。過濾所得樹脂，用DMF(3×6mL)，MeOH(3×6mL)，和DCM(3×6mL)洗滌，在高真空中干燥過夜。從樹脂上切下少量的化合物，并且通過LCMS分析。將干燥的樹脂用于下一步驟。LC-MS：430(M+1)。
中間體58
向樹脂中間體57(0.5g，0.80mmol)中添加DMF(5mL)中的20％哌啶。將混合物在室溫下振蕩6min，將所得樹脂過濾，用DMF(3×6mL)，MeOH(3×6mL)，DCM(3×6mL)洗滌，在真空中干燥。少量的化合物從樹脂上切下，通過LC/MS分析，這表明反應(yīng)完成。將所得樹脂用于下一步反應(yīng)。LC-MS：208(M+1)。
中間體59
向中間體58(0.4g，0.64mmol)中添加中間體56(0.351g，0.67mmol)，HATU(0.487g，1.28mmol)，2,4,6-三甲基吡啶(0.256mL，1.92mmol)，和DIEA(0.335mL，1.92mmol)在DMF(4mL)中的溶液。將混合物在室溫下振蕩2小時(shí)。將所得樹脂過濾，用DMF(3×6mL)，MeOH(3×6mL)，DCM(3×6mL)洗滌，在真空中干燥。從樹脂上切下少量的化合物，并且通過LCMS分析。反應(yīng)完成。將所得樹脂用于下一步反應(yīng)。LC-MS：712(M+1)。
中間體60
向樹脂中間體59(0.4g，0.64mmol)中添加DMF(4mL)中的20％哌啶。將混合物在室溫下振蕩6min，將所得樹脂過濾，用DMF(3×6mL)，MeOH(3×6mL)，DCM(3×6mL)洗滌，在真空中干燥。少量的化合物從樹脂上切下，通過LCMS分析，這表明反應(yīng)完成。將所得樹脂用于下一步反應(yīng)。LC/MS：491(M+H)。
中間體61
在室溫下，向樹脂中間體60(0.4g，0.64mmol)中添加中間體24(0.341g，0.96mmol)，DMAP(3.91mg，0.03mmol)，和DIEA(0.335mL，1.92mmol)在DCM(4mL)中的溶液。將混合物在室溫下振蕩1小時(shí)，過濾所得樹脂，用DMF(3×6mL)，MeOH(3×6mL)，DCM(3×6mL)洗滌，在高真空中干燥。從樹脂上切下少量的化合物，并且通過LCMS分析。將所得樹脂用于下一步驟。LC-MS：825(M+1)。
中間體62
向樹脂中間體61(0.4g，0.64mmol)中添加DMF(4mL)中的20％哌啶。將混合物在室溫下振蕩6min，將所得樹脂過濾，用DMF(3×6mL)，MeOH(3×6mL)，DCM(3×6mL)洗滌，在真空中干燥。少量的化合物從樹脂上切下，通過LCMS分析，這表明反應(yīng)完成。將所得樹脂用于下一步反應(yīng)。LC-MS：603(M+1)。
中間體63
將4,4-二甲基環(huán)己酮(30g，0.238mol)，鹽酸羥胺(32.8g，0.476mol)和乙酸鈉(39.0g，0.476mol)在H2O/EtOH(720mL，5/1)中的溶液回流加熱。通過TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)并且在完成后冷卻至室溫。將其用二氯甲烷(500mL)稀釋。分離有機(jī)層，用鹽水(100mL)洗滌，并且用Na2SO4干燥。減壓除去溶劑，并且獲得4,4-二甲基環(huán)己酮肟，為無(wú)色固體，將其不經(jīng)進(jìn)一步純化即用于下一步驟。
中間體64
經(jīng)20分鐘向攪拌的五氯化磷(120g，0.576mol)在二甲苯(1000mL)中的漿液中添加中間體63(27.2g，0.192mol)在二甲苯(400mL)中的溶液。在添加期間，使用水浴將反應(yīng)混合物維持在30℃-36℃。然后將其加熱至80℃并且攪拌1.5小時(shí)。將均勻反應(yīng)混合物冷卻至室溫，并且倒入飽和碳酸鈉水溶液(2000mL)中。將混合物靜置過夜，并且收集沉淀。獲得3,3-二氯-5,5-二甲基氮雜環(huán)庚烷-2-酮(28.4g)，為棕色固體，并且將其不經(jīng)進(jìn)一步純化即用于下一步驟。1H NMR(300MHz,CDCl3):δ6.51(bs,1H),3.39-3.44(m,1H),3.16-3.21(m,1H),1.41-1.51(m,2H),1.17(s,2H),0.99(s,6H)。
中間體65
將中間體64(25.8，0.123摩爾)溶于冰乙酸(1300mL)中，并且在40atm的氫氣下，在Pd/C(13g，10％)上在室溫下攪拌2h。濾出催化劑，并且將濾液在真空下濃縮。向殘余物中添加DCM(200mL)和飽和NaHCO3水溶液(200mL)，并且將混合物攪拌10min。分離有機(jī)層，用Na2SO4干燥并且在真空下濃縮，以給出3-氯-5,5-二甲基氮雜環(huán)庚烷-2-酮(19.1g)，將其不經(jīng)進(jìn)一步純化即用于下一步驟。1H NMR(300MHz,CDCl3):δ6.19(brs,1H),4.75(d,J＝11Hz,1H),3.30-3.36(m,1H),3.11-3.17(m,1H),1.91-2.09(m,2H),1.39-1.59(m,2H),1.14(s,3H),1.04(s,3H)。
中間體66
向裝入中間體65(16.1g，0.092mol)和Ba(OH)2(35.1g，0.11mol)的燒瓶中添加水(400mL)。將這一混合物在110℃下攪拌2h。然后將其冷卻至室溫，并且添加CBZ氯化物(20.6g，0.121mol)在THF(400mL)中的溶液。將混合物在室溫下攪拌過夜，然后使用1N HCl調(diào)節(jié)至pH 3。將粗產(chǎn)物用乙酸乙酯(2×200mL)萃取。將合并的萃取物用鹽水(100mL)洗滌，用Na2SO4干燥，并且在減壓下濃縮。將殘余物通過硅膠色譜法純化，以給出1-((芐氧基)羰基)-4,4-二甲基哌啶-2-甲酸(7g)，為一種粘稠的油。1H NMR(300MHz,CDCl3):δ7.33-7.38(m,5H),5.16-5.19(m,2H),4.78-4.88(m,1H),3.95-3.99(m,1H),3.23-3.27(m,1H),2.07(s,2H),1.64-1.71(m,1H),1.37-1.40(m,2H),0.97(s,3H),0.93(s,3H)。
中間體67
通過手性pak IC，使用流動(dòng)相A 90％二氧化碳/流動(dòng)相B 10％乙醇分離兩種對(duì)映異構(gòu)體(在210nm檢測(cè))。
(R)-1-((芐氧基)羰基)-4,4-二甲基哌啶-2-甲酸：LC-MS：292[M+1]；1H NMR(400MHz,氯仿-d)δppm 0.93(s,3H)0.98(s,3H)1.40(d,J＝11.80Hz,2H)1.68(dd,J＝14.05,7.28Hz,1H)1.99-2.18(m,1H)3.27(m,J＝12.30Hz,1H)3.97(m,J＝12.80Hz,1H)4.69-4.95(m,1H)5.11-5.25(m,2H)7.28-7.44(m,5H)9.63(br.s,1H)
中間體68
向中間體67(1.14g，3.91mmol)在MeOH(20mL)和水(20.00mL)中的溶液中添加多聚甲醛(0.705g，7.83mmol)和Pd/C(10％)(0.4g，3.76mmol)。將反應(yīng)混合物在氫氣氛下在室溫下攪拌過夜。根據(jù)TLC，反應(yīng)沒有完成。添加另一多聚甲醛(0.705g，7.83mmol)，并且將反應(yīng)混合物在氫氣氛下在室溫下攪拌過夜。TLC表明反應(yīng)完成。將反應(yīng)混合物過濾，用MeOH(2×20mL)洗滌催化劑。將濾液真空濃縮，以給出粗產(chǎn)物，為白色固體，將其用醚(3×20mL)洗滌，在高真空中干燥過夜，以產(chǎn)生(R)-1,4,4-三甲基哌啶-2-甲酸(0.671g，100％)，為白色固體。LC-MS：172[M+1]；1H NMR(400MHz,D2O)δppm 0.96(s,3H)1.01(s,3H)1.49-1.63(m,3H)1.83(dt,J＝14.56,2.64Hz,1H)2.79(s,3H)3.08-3.18(m,1H)3.27-3.34(m,1H)3.54(dd,J＝12.80,3.26Hz,1H)。
中間體69
向樹脂中間體62(0.1g，0.16mmol)中添加中間體68(0.055g，0.32mmol)，HATU(0.122g，0.32mmol)，2,4,6-三甲基吡啶(0.064mL，0.48mmol)，和DIEA(0.056mL，0.32mmol)在DMF(1mL)中的溶液。將混合物在室溫下振蕩2小時(shí)，過濾所得樹脂，用DMF(3×2mL)，MeOH(3×2mL)，和DCM(3×2mL)洗滌，在真空中干燥。少量的化合物從樹脂上切下，通過LCMS分析，這表明反應(yīng)完成。將所得樹脂用于下一步驟。LC-MS：756(M+1)。
化合物4
向樹脂中間體69(0.1g，0.13mmol)中添加DCM(1mL)和TFA(1mL)。將混合物在室溫下振蕩20min，然后過濾，用DCM/TFA(1:1，3×2mL)洗滌樹脂，真空蒸發(fā)濾液。將殘余物通過反相HPLC純化(ACN/H2O0.1％TFA ACN，從5％至75％，在14min內(nèi))。將純的級(jí)分凍干，以給出(2S,4R)-4-(2-((1R,3R)-1-乙酰氧基-3-((2S,3S)-N,3-二甲基-2-((R)-1,4,4-三甲基哌啶-2-甲酰胺基)戊酰胺基)-4-甲基戊基)噻唑-4-甲酰胺基)-2-甲基-5-苯基戊酸(30mg，產(chǎn)率30％)，為白色固體。LC-MS：756.5[M+1]；1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δppm 0.75(dd,J＝6.53,2.01Hz,3H),0.85(td,J＝7.34,3.64Hz,4H),0.90-0.99(m,11H),1.01-1.16(m,9H),1.45-1.66(m,6H),1.67-1.85(m,4H),1.86-1.97(m,1H),2.03-2.06(m,3H),2.16-2.34(m,2H),2.39-2.51(m,1H),2.66(d,J＝1.25Hz,3H),2.75-2.85(m,2H),3.02(d,J＝1.25Hz,3H),3.16(br.s.,1H),3.79-3.93(m,1H),4.29(br.s.,2H),4.57-4.66(m,1H),5.55-5.70(m,1H),7.01-7.18(m,5H),7.98(d,J＝1.25Hz,1H)。
中間體70
向樹脂中間體62(0.1g，0.16mmol)中添加中間體1(0.050g，0.32mmol)，HATU(0.122g，0.32mmol)，2,4,6-三甲基吡啶(0.064mL，0.48mmol)，和DIEA(0.056mL，0.32mmol)在DMF(1mL)中的溶液。將混合物在室溫下振蕩2小時(shí)，過濾所得樹脂，用DMF(3×2mL)，MeOH(3×2mL)，和DCM(3×2mL)洗滌，在真空中干燥。少量的化合物從樹脂上切下，通過LCMS分析，這表明反應(yīng)完成。將所得樹脂用于下一步驟。LC-MS：742(M+1)。
化合物5
向樹脂中間體70(0.1g，0.16mmol)中添加DCM(1mL)和TFA(1mL)。將混合物在室溫下振蕩20min，然后過濾，用DCM/TFA(1:1，3×2mL)洗滌樹脂，真空蒸發(fā)濾液。殘余物通過反相HPLC(ACN/H2O 0.1％TFA，ACN從5％至50％，在14min內(nèi))純化。將純的級(jí)分凍干，以給出(2S,4R)-4-(2-((1R,3R)-1-乙酰氧基-3-((2S,3S)-2-((2R,4R)-1,4-二甲基哌啶-2-甲酰胺基)-N,3-二甲基戊酰胺基)-4-甲基戊基)噻唑-4-甲酰胺基)-2-甲基-5-苯基戊酸(0.040g，29.2％)，為白色固體。LC-MS：742(M+1)；1H NMR(400MHz,CD3OD)δppm 0.71-0.78(m,3H),0.80-0.87(m,3H),0.93(dd,J＝9.91,6.65Hz,6H),1.07(d,J＝7.03Hz,6H),1.42-1.65(m,3H),1.74-1.85(m,3H),1.86-1.98(m,3H),2.05(s,4H),2.16-2.35(m,2H),2.38-2.51(m,1H),2.59-2.72(m,3H),2.77-2.83(m,2H),3.02(s,3H),3.84-3.94(m,1H),4.20-4.35(m,2H),4.56-4.65(m,1H),5.57-5.67(m,1H),7.03-7.09(m,1H),7.13(s,4H),7.91-8.02(m,2H)。
中間體71
向2-((1R,3R)-3-((2S,3S)-2-(叔丁氧基羰基氨基)-N,3-二甲基戊酰胺基)-1-羥基-4-甲基戊基)噻唑-4-甲酸乙酯(按照帕特森(Patterson A.)等人，有機(jī)化學(xué)雜志(J.Org.Chem)，2008，73，4362中描述的制備)(1.2g，2.40mmol)在DCM(24mL)中溶液中添加等體積的TFA(24.00mL)，同時(shí)攪拌1h。然后將溶液濃縮，用EtOAc稀釋，并且用飽和NaHCO3(水溶液)洗滌一次。將水性級(jí)分用EtOAc反萃取兩次，并且將合并的有機(jī)級(jí)分用Na2SO4干燥，過濾并且濃縮，以給出Boc-去保護(hù)的游離胺，將其不經(jīng)進(jìn)一步純化即用于下一步驟。向CH2Cl2(24mL)中的該胺中添加HOBT(0.368g，2.40mmol)和中間體1(0.3969g，2.52mmol)。然后將混合物在鹽水冰-水浴中在攪拌下冷卻，并且添加PS-碳二亞胺(1.23mmol/g)(2.598g，2.88mmol)。將浴加溫至RT，并且繼續(xù)攪拌14h。然后過濾混合物，用DCM洗滌樹脂，并且濃縮濾液。然后將粗混合物用EtOAc稀釋并且用飽和NaHCO3水溶液洗滌一次。將水性級(jí)分用EtOAc反萃取兩次，并且將合并的有機(jī)級(jí)分用Na2SO4干燥，過濾，并且濃縮，以給出4-甲基Mep偶聯(lián)的中間體，將其不經(jīng)進(jìn)一步純化即使用。向在二噁烷(24mL)中稀釋的粗中間體添加LiOH(0.230g，9.60mmol)在脫氣水(24mL)中的溶液。攪拌5h后，濃縮溶液。通過使用正相快速色譜法，將殘余物通過硅膠柱純化，用DCM/DCM:MeOH:NH4OH(90:10:1至70:30:1)(DCM:MeOH:NH4OH，為0至100％的梯度)洗脫。將純級(jí)分濃縮并且最后在高真空下干燥，以給出2-((1R,3R)-3-((2S,3S)-2-((2R,4R)-1,4-二甲基哌啶-2-甲酰胺基)-N,3-二甲基戊酰胺基)-1-羥基-4-甲基戊基)噻唑-4-甲酸(1.003g，82％)，為無(wú)定形固體。LC-MS：509[M+1]。
中間體72
將中間體71(1.0026g，1.96mmol)在吡啶(19.47mL)中的溶液在冰-水浴中冷卻，并且在攪拌下添加乙酸酐(0.927ml，9.82mmol)。將浴加溫至室溫，并且繼續(xù)攪拌22h。然后將溶液在冰-水浴中冷卻，并且添加脫氣的水/二噁烷(40mL)的1:1(v/v)溶液。將浴加溫至室溫，并且繼續(xù)攪拌22h。通過蒸發(fā)濃縮殘余物，并且通過使用ACN/H2O(0.1％TFA)，ACN從5％至50％，在14分鐘內(nèi)的反相色譜，純化殘余物，將純級(jí)分凍干，以給出2-((1R,3R)-1-乙酰氧基-3-((2S,3S)-2-((2R,4R)-1,4-二甲基哌啶-2-甲酰胺基)-N,3-二甲基戊酰胺基)-4-甲基戊基)噻唑-4-甲酸(0.945g，72.2％)，為無(wú)色固體。LC-MS：551[M+1]；1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δppm 0.85(d,J＝6.53Hz,3H),0.88-0.98(m,4H),0.98-1.08(m,6H),1.10-1.28(m,4H),1.59(ddd,J＝13.49,7.47,2.89Hz,1H),1.70(d,J＝14.05Hz,1H),1.81-2.12(m,5H),2.12-2.25(m,3H),2.32(d,J＝7.78Hz,2H),2.72-2.93(m,4H),3.07-3.18(m,4H),4.02(d,J＝10.54Hz,1H),4.10-4.39(m,1H),4.65-4.76(m,1H),5.64-5.80(m,1H),8.30-8.39(m,1H),8.66(d,J＝7.28Hz,1H)。
中間體73
在0℃，將中間體72(100mg，0.18mmol)添加到2,3,4,5,6-五氟苯酚(49.32mg，0.27mmol)和DIC(41.34μl，0.27mmol)在DCM(5mL)中的溶液中。允許溶液達(dá)到室溫，攪拌4小時(shí)，然后在真空下除去溶劑。將EtOAc(4mL)添加到混合物中，并且將所得懸浮液抽濾，以給出濾液中希望的活化酸。在真空下除去EtOAc，然后添加干DMF(1.3mL)，隨后添加中間體18(52.2mg，0.18mmol)和DIEA(0.213mL)。將混合物攪拌過夜，然后在高真空下除去DMF。將殘余物通過反相色譜法(ACN/H2O，具有10mM乙酸銨，ACN從10％至80％，在20分鐘內(nèi))純化，將純級(jí)分凍干，以給出(2S,4R)-4-(2-((1R,3R)-1-乙酰氧基-3-((2S,3S)-2-((2R,4R)-1,4-二甲基哌啶-2-甲酰胺基)-N,3-二甲基戊酰胺基)-4-甲基戊基)噻唑-4-甲酰胺基)-2-甲基-5-(4-硝基苯基)戊酸(85mg，59.3％)，為無(wú)色固體。LC-MS：787[M+1]
化合物6
向25mL圓底燒瓶中裝入攪拌棒和中間體73(84.5mg，0.11mmol)以及MeOH(5mL)，在氮?dú)庀绿砑覲d-C 10％(50mg，0.47mmol)。將混合物通過使用氫氣球在室溫下氫化1小時(shí)。粗LC/MS示出起始材料完全轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物。將反應(yīng)混合物通過硅藻土墊過濾，并且在過濾器上用MeOH洗滌。在減壓下濃縮濾液，并且最后在高真空下干燥，以給出(2S,4R)-4-(2-((1R,3R)-1-乙酰氧基-3-((2S,3S)-2-(2R,4R)-1,4-二甲基哌啶-2-甲酰胺基)-N,3-二甲基戊酰胺基)-4-甲基戊基)噻唑-4-甲酰胺基)-5-(4-氨基苯基)-2-甲基戊酸，(79mg，97％)，為一種固體。LC-MS：757[M+1]；1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δppm8.10(s,1H)6.99(d,J＝8.28Hz,2H)6.65(d,J＝8.28Hz,2H)5.66-5.78(m,1H)4.71-4.80(m,1H)4.24-4.43(m,2H)3.13(s,3H)2.77-2.83(m,2H)2.61-2.71(m,1H)2.49-2.56(m,1H)2.44(s,3H)2.27-2.40(m,2H)2.17(s,3H)1.86-2.04(m,4H)1.74-1.83(m,1H)1.53-1.69(m,3H)1.31(br.s.,3H)1.17(d,J＝7.03Hz,4H)0.98-1.07(m,8H)0.93(d,J＝7.53Hz,6H)0.83-0.87(m,3H)。
化合物7-10的一般合成方案
中間體74
向樹脂中間體28(0.2g，0.32mmol)中添加(S)-2-(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基氨基)-6-(叔丁氧羰基氨基)己酸(0.300g，0.64mmol)，HATU(0.243g，0.64mmol)，2,4,6-三甲基吡啶(0.128mL，0.96mmol)，和DIEA(0.168mL，0.96mmol)在DMF(4mL)中的溶液。將混合物在室溫下振蕩2小時(shí)，過濾所得樹脂，用DMF(3×2mL)，MeOH(3×2mL)，和DCM(3×2mL)洗滌，并且在真空中干燥。少量的化合物從樹脂上切下，通過LCMS分析，這表明反應(yīng)完成。將所得樹脂中間體74用于下一步反應(yīng)。LC-MS：1221(M+1)。
中間體75
向樹脂中間體74(0.2g，0.32mmol)中添加DMF(2mL)中的20％哌啶。將混合物在室溫下振蕩3min，將所得樹脂過濾，用DMF(3×3mL)，MeOH(3×3mL)，DCM(3×6mL)洗滌，在真空中干燥。少量的化合物從樹脂上切下，通過LCMS分析，這表明反應(yīng)完成。將所得樹脂中間體75用于下一步反應(yīng)。LC/MS：999(M+H)。
中間體76
在室溫下，向樹脂中間體75(0.2g，0.32mmol)中添加2,5-二氧代吡咯烷-1-基6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酸酯(0.148g，0.48mmol)在DMF(2mL)中的溶液，隨后添加n-甲基嗎啉(0.106mL，0.96mmol)。將混合物在室溫下振蕩2小時(shí)，過濾所得樹脂，用DMF(3×3mL)，DCM(3×3mL)洗滌，在真空中干燥。少量的化合物從樹脂上切下，通過LCMS分析，這表明反應(yīng)完成。將所得樹脂中間體76用于下一步驟。LC-MS：1192(M+1)。
化合物7
在室溫下向樹脂中間體76(0.2g，0.32mmol)中添加DCM(1mL)和TFA(1mL)。將混合物在室溫下振蕩20min，并且過濾。將樹脂用DCM/TFA(1:1，3×2mL)洗滌，真空蒸發(fā)合并的濾液。將殘余物通過反相HPLC(ACN/水0.1％TFA，ACN從5％至75％，在14min內(nèi))純化。將純的級(jí)分凍干，以給出(2S,4R)-4-(2-((1R,3R)-1-乙酰氧基-3-((2S,3S)-2-((2R,4R)-1,4-(二甲基哌啶-2-甲酰胺基)-N-乙基-3-甲基戊酰胺基)-4-甲基戊基)噻唑-4-甲酰胺基)-5-(4-((S)-6-氨基-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)己酰胺基)苯基)-2-甲基戊酸(0.095g，22.48％)，為白色固體。LC-MS：1092[M+1]；1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δppm 7.99(s,1H),7.34(d,J＝8.53Hz,2H),7.10(d,J＝8.53Hz,2H),6.66(s,2H),5.64(d,J＝10.79Hz,1H),4.50-4.61(m,1H),4.21-4.35(m,2H),3.92(d,J＝9.29Hz,1H),3.69(br.s.,1H),3.37(t,J＝7.15Hz,2H),3.15-3.35(m,4H),3.04(dt,J＝3.58,1.85Hz,1H),2.84(t,J＝7.65Hz,2H),2.76(d,J＝7.03Hz,2H),2.62(br.s.,2H),2.38-2.52(m,2H),2.25(t,J＝11.54Hz,1H),2.16(t,J＝7.40Hz,2H),2.04-2.11(m,4H),1.70-2.00(m,7H)1.42-1.69(m,11H),1.34-1.40(m,1H),1.27(t,J＝6.78Hz,3H),1.16-1.24(m,2H),1.01-1.14(m,7H),0.90(d,J＝6.78Hz,3H),0.94(d,J＝6.53Hz,3H),0.84(t,J＝7.40Hz,3H),0.79(d,J＝6.53Hz,3H)。
中間體77
向樹脂中間體28中添加(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-5-脲基戊酸(3.88g，9.76mmol)，HATU(3.71g，9.76mmol)，2,4,6-三甲基吡啶(2.59mL，19.52mmol)和DIEA(3.41mL，19.52mmol)在DMF(38mL)中的溶液。將混合物在室溫下振蕩2小時(shí)，過濾所得樹脂，用DMF(3×100mL)，MeOH(3×100mL)，和DCM(3×100mL)洗滌，并且在真空中干燥。少量的化合物從樹脂上切下，通過LCMS分析，這表明反應(yīng)完成。所得樹脂中間體77用于下一步反應(yīng)。LC-MS：1150(M+1)。
中間體78
向樹脂中間體77中添加DMF(35mL)中的20％哌啶的溶液。將混合物在室溫下振蕩六分鐘。將所得樹脂過濾，用DMF(3×100mL)，MeOH(3×100mL)，和DCM(3×100mL)洗滌，并且在真空中干燥。少量的化合物從樹脂上切下，通過LCMS分析并且示出弱信號(hào)。所得樹脂中間體78用于下一步反應(yīng)。LC-MS：928(M+1)。
中間體79
向樹脂中間體78中添加(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酸(1.529g，4.50mmol)，HATU(1.713g，4.50mmol)，2,4,6-三甲基吡啶(1.294mL，9.76mmol)和DIPEA(1.705mL，9.76mmol)在DMF(20mL)中的溶液。將混合物在室溫下振蕩2小時(shí)，過濾所得樹脂，用DMF(3×75mL)，MeOH(3×75mL)，和DCM(3×75mL)洗滌，并且在真空中干燥。少量的化合物從樹脂上切下，通過LC/MS分析，這表明反應(yīng)完成。將所得樹脂中間體79用于下一步反應(yīng)。LC-MS：1250(M+1)。
中間體80
向樹脂中間體79中添加DMF(20mL)中的20％哌啶的溶液。將混合物在室溫下振蕩六min，并且過濾所得樹脂，用DMF(3×75mL)，MeOH(3×75mL)，和DCM(3×75mL)洗滌，并且在真空中干燥。少量的化合物從樹脂上切下，通過LCMS分析，這表明反應(yīng)完成。將所得樹脂中間體80用于下一步反應(yīng)。LC/MS：1028(M+1)。
中間體81
在室溫下，向樹脂中間體80中添加2,5-二氧代吡咯烷-1-基6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酸酯(1.157g，3.75mmol)在DMF(18mL)中的溶液，隨后添加4-甲基嗎啉(1.032mL，9.38mmol)。將混合物在室溫下振蕩2小時(shí)，并且過濾所得樹脂，用DMF(3×75mL)，MeOH(3×75mL)，和DCM(3×75mL)洗滌，并且在真空中干燥。通過添加TFA切下少量樹脂，并且通過LC/MS分析，表明形成希望的產(chǎn)物。樹脂中間體81用于下一步驟。LC-MS：1220(M+1)。
化合物8
向來自81的樹脂中添加TFA(2.89mL，37.54mmol)在DCM(40mL)中的溶液。將混合物在室溫下振蕩5分鐘，將所得樹脂過濾，用另外的50mL DCM洗滌。將合并的萃取物濃縮。將粗材料通過反相HPLC(C18柱，0.1％TFA/水/0.1TFA乙腈，0-40％，30分鐘方法)純化。將純的級(jí)分凍干，以給出(2S,4R)-4-(2-((1R,3R)-1-乙酰氧基-3-((2S,3S)-2-((2R,4R)-1,4-二甲基哌啶-2-甲酰胺基)-N-乙基-3-甲基戊酰胺基)-4-甲基戊基)噻唑-4-甲酰胺基)-5-(4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苯基)-2-甲基戊酸(0.620g，12.38％)，為白色固體。LC-MS：1220(M+1)；1H NMR(400MHz,CD3OD)δppm 8.03(s,1H),7.30-7.44(m,2H),7.07(d,J＝8.53Hz,2H),6.69(s,2H),5.53-5.68(m,1H),4.52-4.63(m,1H),4.19-4.40(m,3H),4.01-4.12(m,2H),3.89-3.99(m,1H),3.56-3.74(m,1H),3.33-3.43(m,2H),3.23-3.32(m,1H),2.96-3.13(m,4H),2.83-2.95(m,1H),2.66-2.83(m,3H),2.57(br.s.,3H),2.40-2.52(m,2H),2.14-2.24(m,3H),2.02-2.11(m,4H),1.87-2.00(m,5H),1.72-1.87(m,4H),1.42-1.68(m,10H),1.16-1.28(m,5H),1.09(d,J＝7.03Hz,6H,)0.76-0.96(m,16H)。
中間體82
向樹脂中間體38(0.35g，0.56mmol)中添加(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-6-((叔丁氧羰基)氨基)己酸(0.525g，1.12mmol)，HATU(0.426g，1.12mmol)，2,4,6-三甲基吡啶(0.223mL，1.68mmol)和DIPEA(0.293mL，1.68mmol)在DMF(5mL)中的溶液。將該混合物在室溫下振蕩2小時(shí)，過濾所得樹脂，用DMF(3×5mL)，MeOH(3×5mL)，和DCM(3×5mL)洗滌，并且在真空中干燥。少量的化合物從樹脂上切下，通過LCMS分析，這表明反應(yīng)完成。所得樹脂中間體82用于下一步反應(yīng)。LC/MS：1221(M+1)。
中間體83
向樹脂中間體82中添加DMF(4mL)中的20％哌啶。將混合物在室溫下振蕩6min，并且過濾所得樹脂，用DMF(3×5mL)，MeOH(3×5mL)，DCM(3×5mL)洗滌，并且在真空中干燥。少量的化合物從樹脂上切下，通過LC/MS分析，這表明反應(yīng)完成。將所得樹脂中間體83用于下一步反應(yīng)。LC/MS：999(M+1)。
中間體84
在室溫下，向樹脂中間體83中添加2,5-二氧代吡咯烷-1-基6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酸酯(0.259g，0.84mmol)在DCM(4mL)中的溶液，隨后添加4-甲基嗎啉(0.185mL，1.68mmol)。將混合物在室溫下振蕩6小時(shí)，過濾所得樹脂，用DMF(3×5mL)，MeOH(3×5mL)，DCM(3×5mL)洗滌，在真空中干燥。少量的化合物從樹脂上切下，通過LC/MS分析，這表明反應(yīng)完成。將所得樹脂中間體84用于下一步反應(yīng)。LC-MS：1192(M+1)。
中間體85
向樹脂中間體84(0.35g，0.56mmol)中添加在DCM(5mL)中的TFA(0.216mL，2.80mmol)。將混合物在室溫下振蕩10分鐘。減壓除去溶劑。將殘余物溶于DMSO中并且通過反相HPLC(0.1TFA/水/乙腈，20％-80％，14分鐘)純化。將包含純產(chǎn)物的級(jí)分凍干，以給出(2S,4R)-4-(2-((1R,3R)-1-乙酰氧基-3-((2S,3S)-2-(1,2-二甲基哌啶-2-甲酰胺基)-N-乙基-3-甲基戊酰胺基)-4-甲基戊基)噻唑-4-甲酰胺基)-5-(4-((S)-6-((叔丁氧基羰基)氨基)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)己酰胺基)苯基)-2-甲基戊酸(0.123g，18.42％)，為白色固體。LC/MS：1192(M+1)。
化合物9
向中間體85(95mg，0.08mmol)中添加TFA(0.123mL，1.59mmol)在DCM(1mL)中的溶液。將混合物在室溫下振蕩1小時(shí)。減壓除去溶劑。將殘余物溶于DMSO中并且通過反相HPLC(0.1TFA/水/乙腈，10％-70％，10分鐘)純化。將包含純產(chǎn)物的級(jí)分凍干，以給出(2S,4R)-4-(2-((1R,3R)-1-乙酰氧基-3-((2S,3S)-2-((R)-1,2-二甲基哌啶-2-甲酰胺基)-N-乙基-3-甲基戊酰胺基)-4-甲基戊基)噻唑-4-甲酰胺基)-5-(4-((S)-6-氨基-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)己酰胺基)苯基)-2-甲基戊酸(53.0mg，50.4％)，為白色固體。LC-MS：1092(M+1).；1H NMR(400MHz,CD3OD)δppm 7.97(s,1H),7.36(d,J＝8.28Hz,2H),7.11(d,J＝8.28Hz,2H),6.65(s,2H),5.63(d,J＝11.29Hz,1H),4.34(dd,J＝8.28,5.77Hz,1H),4.26(br.s.,1H),3.75-3.60(m,1H),3.32-3.46(m,4H),3.30-3.25(m,1H),2.71-2.90(m,5H),2.49-2.62(m,3H),2.27(t,J＝12.05Hz,1H),2.17(t,J＝7.40Hz,3H)2.00-2.12(m,5H),1.84-1.96(m,3H),1.72-1.84(m,4H),1.58-1.69(m,5H),1.47-1.56(m,4H),1.36-1.44(m,5H),1.14-1.30(m,6H),1.01-1.10(m,4H),0.93(dd,J＝13.93,6.65Hz,7H),0.74-0.86(m,7H)。
中間體86
在室溫下，向樹脂中間體75(0.20g，0.16mmol)中添加2,5-二氧代吡咯烷-1-基-3-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙酸酯(85mg，0.32mmol)在DCM中的溶液，隨后添加DIEA(0.056mL，0.32mmol)。將混合物在室溫下振蕩4小時(shí)，所得樹脂用DMF(3×3mL)，DCM(3×3mL)，和MeOH(3×3mL)洗滌，并且在真空中干燥。用TFA/DCM(1:2)從樹脂上切下少量的化合物。蒸發(fā)溶劑后，通過LC/MS分析粗產(chǎn)物。LC/MS表明偶聯(lián)反應(yīng)完成。LC/MS：1050.37(M+1)。
化合物10
在室溫下向樹脂中間體86(0.20g，0.16mmol)中添加TFA/DCM(1:2，3mL)。將混合物在室溫下振蕩10min，并且過濾。將樹脂用DCM(3×3mL)洗滌，將所有濾液合并，并且在減壓下蒸發(fā)，以給出粗產(chǎn)物。將粗產(chǎn)物通過反相HPLC(H2O和CH3CN，具有0.1％TFA，CH3CN從5％至40％，在12CV的長(zhǎng)度中)純化。將收集的級(jí)分合并，并且凍干，以給出(2S,4R)-4-(2-((1R,3R)-1-乙酰氧基-3-((2S,3S)-2-((2R,4R)-1,4-二甲基哌啶-2-甲酰胺基)-N-乙基-3-甲基戊酰胺基)-4-甲基戊基)噻唑-4-甲酰胺基)-5-(4-((S)-6-氨基-2-(3-(2,5-二氧代-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)丙酰胺基)己酰胺基)苯基)-2-甲基戊酸(70mg，35％)，為白色粉末。LC/MS：1050.37(M+1)；1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.99(s,1H),7.35(d,J＝8.5Hz,2H),7.10(d,J＝8.5Hz,2H),6.65(s,2H),5.64(d,J＝10.9Hz,1H),4.56(d,J＝8.9Hz,1H),4.28(td,J＝11.3,10.0,6.1Hz,2H),3.92(d,J＝11.5Hz,1H),3.69(q,J＝6.8Hz,3H),3.31–3.23(m,1H),3.18(s,1H),2.83(t,J＝7.7Hz,3H),2.76(d,J＝7.1Hz,3H),2.63(s,3H),2.50–2.40(m,4H),2.25(t,J＝12.8Hz,1H),2.06(s,4H),2.00–1.69(m,8H),1.69–1.52(m,6H),1.53–1.31(m,4H),1.28(d,J＝6.4Hz,3H),1.08(d,J＝7.1Hz,7H),0.92(dd,J＝13.7,6.7Hz,7H),0.83(t,J＝7.4Hz,4H),0.78(d,J＝6.6Hz,3H)。
綴合的一般描述
包含抗體的ADC可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法制備，例如但不限于醛/希夫(Schiff)連接，巰基連接，酸不穩(wěn)定連接，順式-烏頭酸連接，腙連接，通過與由漢布萊特(Hamblett)，癌癥研究(Cancer Res.)，2004，10，7063-7070；德羅尼納(Doronina)等，自然生物技術(shù)(Nat.Biotechnol.)，2003，21(7)，778-784和弗朗西斯科(Francisco)等，血液(Blood)，2003，102，1458-1465中描述的那些，以及以下非限制性實(shí)例的適當(dāng)修改類似的方法。
在還原條件下，使用PBS pH 7.2和1mM EDTA中的40摩爾當(dāng)量TCEP在37℃下處理抗體3小時(shí)，以除去硫醇反應(yīng)性物質(zhì)，例如半胱氨酸、谷胱甘肽、金屬，并且減少抗體中的鏈間二硫鍵。該步驟之后是通過使用10,000MWCO透析盒(賽默科技公司(Thermo Scientific))在PBS pH 7.2，1mM EDTA中在4℃下進(jìn)行兩輪透析。通過在抗體上，在25℃下，在PBS pH7.2，1mM EDTA中用脫氫抗壞血酸氧化4小時(shí)來重新形成二硫鍵。此后，具有化學(xué)式II的化合物的20摩爾當(dāng)量是通過在25℃下在PBS pH 7.2，1mM EDTA，10％v/v DMSO(二甲基亞砜)(Thermo Scientific)中孵育1小時(shí)，經(jīng)由抗體的反應(yīng)性硫醇基團(tuán)進(jìn)行綴合。通過過濾純化綴合物。通過添加4摩爾當(dāng)量的N-乙酰半胱氨酸(西格瑪-奧德里奇(Sigma-Aldrich))來淬滅綴合反應(yīng)。使用在5mM NaPO4，pH 6中的20K MWCO盒，在4℃下將抗體-藥物綴合物透析過夜，并且隨后使用5mL ceramix羥基磷灰石(CHT)II型筒(伯樂(Biorad))進(jìn)行純化。使用10mM NaPO4pH 6和0至2M NaCl線性梯度從筒上洗脫綴合物，并且可以濃縮并且通過使用在20mM組氨酸-HCl，pH 6.0中透析的緩沖液交換進(jìn)行配制。
體外增殖測(cè)定
獲自美國(guó)典型組織收集中心(ATCC)(郵政信箱1549，馬納薩斯(Manassa)，弗吉尼亞州，20108(美國(guó)))的一組人類癌細(xì)胞系(DU145，NCI-N87和MDA-MB-361)用于確定本發(fā)明的微管溶素化合物的相對(duì)細(xì)胞毒性。將細(xì)胞以80μl的體積中在組織培養(yǎng)物處理的96孔板的每孔2,000至5,000個(gè)的密度接種在培養(yǎng)基中，并且允許粘附過夜。通過在培養(yǎng)基中稀釋測(cè)試制品來制備5X濃度的每種測(cè)試化合物。將二十微升的每種測(cè)試制品以一式兩份或三份添加細(xì)胞中，使得最終劑量曲線以逐步1:4連續(xù)稀釋系列范圍從4g/ml降至61pg/ml。將處理的細(xì)胞在37℃/5％CO2下培養(yǎng)72至144小時(shí)。使用來自普洛麥格(Promega)的CellTiter-Glo發(fā)光生存力測(cè)定來確定相對(duì)細(xì)胞毒性。簡(jiǎn)言之，將100μl CellTiter-Glo試劑添加到每個(gè)孔中，允許其在室溫下，在溫和振蕩下，孵育10分鐘，并且然后使用珀金埃爾默(Perkin Elmer)易美遜(EnVision)光度計(jì)讀取每個(gè)樣品在560nM的吸光度。通過下式計(jì)算百分比細(xì)胞活力：(處理的樣品的平均發(fā)光/對(duì)照(未處理的)樣品的平均發(fā)光)×100。使用GraphPad Prism軟件的邏輯非線性回歸分析確定IC50值。并非所有化合物都針對(duì)所有細(xì)胞系進(jìn)行測(cè)定。表I提供了測(cè)定的數(shù)據(jù)。
表I
將在此引用的所有參考文獻(xiàn)，包括專利、專利申請(qǐng)、論文、教科書和類似物，以及其中引用的參考文獻(xiàn)，在尚未被結(jié)合在此的程度上，出于所有目的以其全部?jī)?nèi)容特此通過引用結(jié)合在此。