本申請根據(jù)35USC 119(e)要求于2014年5月9日提交的美國臨時申請?zhí)?1/990,913的權(quán)益，出于所有目的將其通過引用全文并入本文。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了激發(fā)態(tài)能量的猝滅劑、包含這些猝滅劑的探針和其他綴合物以及它們的使用方法。本發(fā)明的其他目的、優(yōu)勢和方面從以下的具體實施方式將是顯而易見的。

附圖說明

圖1顯示了本發(fā)明的示例性化合物。

圖2是概括了本發(fā)明的示例性化合物的合成的示意圖。

圖3顯示了實時PCR測定中Quasar 670-Cosmic猝滅劑、Quasar 670-BHQ2和Quasar 670-BBQ探針的擴增曲線。

圖4顯示了實時PCR測定中Quasar 705-Cosmic猝滅劑和Quasar 705-BHQ2探針的擴增曲線。

圖5A-圖5B。圖5A顯示了核酸酶消化測定中Quasar 670-Cosmic猝滅劑、Quasar 670-BHQ2、Quasar 670-BBQ、Quasar 705-Cosmic猝滅劑和Quasar 705-BHQ2探針的熒光強度。圖5B顯示了核酸酶消化測定中Quasar 670-Cosmic猝滅劑、Quasar 670-BHQ2、Quasar 670-BBQ、Quasar 705-Cosmic猝滅劑和Quasar 705-BHQ2探針的信噪比。

具體實施方式

縮寫

本文使用的“BHQ”通常是指包括一個或多個重氮鍵的暗猝滅劑，尤其是指“黑洞猝滅劑^TM(Black Hole Quenchers^TM)”。美國專利號7,019,129中描述了示例性的BHQ。本文使用的“FET”是指“熒光能量轉(zhuǎn)移”。本文使用的“FRET”是指“熒光共振能量轉(zhuǎn)移”。本文使用的這些術(shù)語是指輻射能量轉(zhuǎn)移過程和非輻射能量轉(zhuǎn)移過程兩者。例如，這些術(shù)語中包括發(fā)射光子和涉及長程電子轉(zhuǎn)移的過程。貫穿本說明書，將這兩種現(xiàn)象歸入通用術(shù)語“供體-受體能量轉(zhuǎn)移”?！癝NP”是指單核苷酸多態(tài)性。

定義

下列定義廣泛地適用于下文中記載的本發(fā)明的每種實施方式。除非另有定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語一般具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的相同的含義。一般地，在下文描述的細胞培養(yǎng)、分子遺傳學(xué)、有機化學(xué)，以及核酸化學(xué)和雜交中，本文使用的命名法和實驗室程序是本領(lǐng)域熟知和通常采用的。標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)用于核酸和肽的合成。一般根據(jù)本領(lǐng)域和各種一般參考文獻中的常規(guī)方法進行分子生物學(xué)技術(shù)和程序(一般見Sambrook等人，分子克?。簩嶒炇謨?Molecular Cloning:A Laboratory Manual)，第二版(1989)冷泉港實驗室出版社，冷泉港，N.Y.)，其通過引用并入本文。本文使用的命名法和在分析化學(xué)和有機合成中的實驗室程序是本領(lǐng)域熟知和通常采用的。標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)或其修改用于化學(xué)合成和化學(xué)分析。

除非另有說明，術(shù)語“烷基”，單獨地或作為另一種取代基的部分，是指直鏈或支鏈，或環(huán)烴基團，或其組合，所述烷基可以是完全飽和的、單不飽和的或多不飽和的，并且可包括具有指定的碳原子數(shù)(即C₁-C₁₀指1至10個碳原子)的一價基團、二價基團、三價基團和四價基團。飽和烴基的例子包括但不限于，基團如甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、叔丁基、異丁基、仲丁基、環(huán)己基、(環(huán)己基)甲基、環(huán)丙基甲基，例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基等的同系物和異構(gòu)體。不飽和烷基是具有一個或多個雙鍵或三鍵的烷基。不飽和烷基的例子包括但不限于乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-異戊烯基、2-(丁二烯基)、2,4-戊二烯基、3-(1,4-戊二烯基)、乙炔基、1-丙炔基和3-丙炔基、3-丁炔基，以及更高級的同系物和異構(gòu)體。除非另有注明，術(shù)語“烷基”也任選地包括下面更詳細地定義的烷基衍生物，如“雜烷基(heteroalkyl)”。限于烴基的烷基被稱為“同烷基(homoalkyl)”。本文使用的術(shù)語“烷基”是指烷基、鏈烯基和炔基部分，其中的每種視情況而定可以是一價、二價或三價物質(zhì)以滿足化合價要求。烷基也任選地被例如一種或多種在本文被稱為“烷基取代基”的基團取代。

術(shù)語“亞烷基”，單獨地或作為另一種取代基的部分，是指烷基部分衍生的二價基團，例如但不限于-CH₂CH₂CH₂CH₂-，并進一步包括下文描述的如“雜亞烷基(heteroalkylene)”的基團。典型地，烷基(或亞烷基)會具有1至24個碳原子，在本發(fā)明中優(yōu)選具有10個或更少的碳原子的那些基團。對于亞烷基和雜亞烷基接頭基團，任選的是不通過寫出接頭基團式的方向暗示接頭基團的取向。例如，式-C(O)₂R’-表示-C(O)₂R’-，和任選地-R’C(O)₂-?！暗图壨榛被颉暗图墎喭榛笔嵌替溚榛蚨替渷喭榛?，通常具有8個、7個、6個、5個或更少的碳原子。

術(shù)語“烷氧基”、“烷基氨基”“烷硫基”(或硫代烷氧基)以其常規(guī)意義使用，分別是指通過氧原子、氨基或硫原子連接于分子的剩余部分的烷基。

除非另有說明，術(shù)語“雜烷基”，單獨地或與另一術(shù)語結(jié)合，是指由規(guī)定數(shù)目的碳原子和至少一個雜原子組成的穩(wěn)定的直鏈烷基或支鏈烷基，或環(huán)烷基，所述雜原子選自由B、O、N、Si和S組成的組，其中雜原子可任選地被氧化，并且氮原子可任選地被季銨化。雜原子可位于雜烷基的任何內(nèi)部位置或在鏈的末端，例如烷基通過其連接到分子的剩余部分的位置?！半s烷基”基團的例子包括但不限于-CH₂-CH₂-O-CH₃、-CH₂-CH₂-NH-CH₃、-CH₂-CH₂-N(CH₃)-CH₃、-CH₂-S-CH₂-CH₃、-CH₂-CH₂,-S(O)-CH₃、-CH₂-CH₂-S(O)₂-CH₃、-CH＝CH-O-CH₃、-Si(CH₃)₃、-CH₂-CH＝N-OCH₃和-CH＝CH-N(CH₃)-CH₃。兩個或更多個雜原子可以是連續(xù)的，例如-CH₂-NH-OCH₃和-CH₂-O-Si(CH₃)₃。相似地，術(shù)語“雜亞烷基”，單獨地或作為另一種取代基的部分，是指取代的或未被取代的二價雜烷基，例如但不限于-CH₂-CH₂-S-CH₂-CH₂-和-CH₂-S-CH₂-CH₂-NH-CH₂-。對于雜亞烷基，雜原子也可以位于鏈末端的任一端或兩端(例如，亞烷氧基、亞烷二氧基、亞烷氨基、亞烷二氨基等)。

除非另有說明，術(shù)語“環(huán)烷基”和“雜環(huán)烷基”，單獨地或與其他術(shù)語結(jié)合，分別表示環(huán)形式的“烷基”和“雜烷基”。另外，對于雜環(huán)烷基，雜原子可位于雜環(huán)與分子的剩余部分連接的位置。環(huán)烷基的例子包括但不限于環(huán)戊基、環(huán)己基、1-環(huán)己烯基、3-環(huán)己烯基、環(huán)庚基等。雜環(huán)烷基的例子包括但不限于1-(1,2,5,6-四氫吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-嗎啉基、3-嗎啉基、四氫呋喃-2-基、四氫呋喃-3-基、四氫噻吩-2-基、四氫噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等。

除非另有說明，術(shù)語“鹵(halo)”或“鹵素(halogen)”，單獨地或作為另一種取代基的部分，是指氟、氯、溴或碘原子。另外，術(shù)語如“鹵代烷基”指包括單鹵代烷基和多鹵代烷基。例如，術(shù)語“鹵代(C₁-C₄)烷基”指包括但不限于三氟甲基、2,2,2-三氟乙基、4-氯丁基、3-溴丙基等。

除非另有說明，術(shù)語“芳基”是指多不飽和的芳香族取代基，其可以是稠合在一起或共價連接的單環(huán)或多環(huán)(優(yōu)選1至3個環(huán)，其中的一個或多個環(huán)任選地是環(huán)烷基或雜環(huán)烷基)。術(shù)語“雜芳基”是指含有1至4個選自N、O和S的雜原子的芳基(或環(huán))，其中氮原子和硫原子任選地被氧化，氮原子任選地被季銨化。雜芳基可以通過雜原子連接于分子的剩余部分。芳基和雜芳基的非限制性的例子包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-聯(lián)苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-唑基、4-唑基、2-苯基-4-唑基、5-唑基、3-異唑基、4-異唑基、5-異唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-異喹啉基、5-異喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基和6-喹啉基。上述芳基環(huán)和雜芳基環(huán)體系中的每一種的取代基選自下文描述的“芳基取代基”的組。

為簡潔起見，術(shù)語“芳基”當(dāng)與其他術(shù)語結(jié)合使用(例如芳基氧基、芳基硫氧基、芳基烷基)時，所述“芳基”任選地包括如上定義的同芳環(huán)和雜芳環(huán)。因此，術(shù)語“芳基烷基”任選地包括其中芳基連接于烷基的基團(如芐基、苯乙基、吡啶基甲基等)，所述烷基包括碳原子(例如亞甲基)已被例如氧原子取代的烷基(例如苯氧甲基、2-吡啶苯氧甲基、3-(1-萘氧基)丙基等)。

烷基和雜烷基(包括常常被稱為亞烷基、鏈烯基、雜亞烷基、雜烯基、炔基、環(huán)烷基、雜環(huán)烷基、環(huán)烯基和雜環(huán)烯基)的取代基通常被稱為“烷基取代基”，并且其可以選自但不限于數(shù)目為0至(2m’+1)的范圍內(nèi)的以下各種基團中的一種或多種：-OR’、＝O、＝NR’、＝N-OR’、-NR’R”、-SR’、-鹵素、-SiR’R”R”’、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO₂R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR’-C(O)NR”R”’、-NR”C(O)₂R’、-NR-C(NR’R”R’”)＝NR””、-NR-C(NR’R”)＝NR’”、-S(O)R’、-S(O)₂R’、-S(O)₂NR’R”、-NRSO₂R’、-CN和-NO₂，其中m’是在這樣的基團中碳原子的總數(shù)目。R’、R”、R”’和R””各自優(yōu)選獨立地指氫，取代的或未被取代的雜烷基，取代的或未被取代的芳基(例如1-3個鹵原子取代的芳基)，取代的或未被取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基，或芳基烷基。當(dāng)本發(fā)明的化合物包括多于一種R基團，例如，當(dāng)存在多于一種這些基團時，每種R基團被獨立地選擇為各種R’、R”、R’”和R””基團。當(dāng)R’和R”連接于相同的氮原子時，它們可以與氮原子結(jié)合以形成5元環(huán)、6元環(huán)或7元環(huán)。例如，-NR’R”指包括但不限于1-吡咯烷基和4-嗎啉基。從上文對取代基的討論中，本領(lǐng)域技術(shù)人員將明白術(shù)語“烷基”包括具有結(jié)合于除氫原子以外的基團的碳原子的基團，如鹵代烷基(例如-CF₃和-CH₂CF₃)和芳基(例如-C(O)CH₃、-C(O)CF₃、-C(O)CH₂OCH₃等)。示例性烷基取代基包括在本文中被稱為“反應(yīng)性官能團”和“連接位點”的基團。在各種實施方式中，烷基取代基是含磷部分，例如本文所述的磷酸二酯或磷酸二酯修飾物。

與描述的烷基取代基相似，芳基基團和雜芳基基團的取代基通常被稱為“芳基取代基”。示例性取代基選自烷基取代基和其他取代基列表，例如：鹵素、-OR’、＝O、＝NR’、＝N-OR’、-NR’R”、-SR’、-SiR’R”R”’、-OC(O)R’、-C(O)R’、-CO₂R’、-CONR’R”、-OC(O)NR’R”、-NR”C(O)R’、-NR’-C(O)NR”R”’、-NR”C(O)₂R’、-NR-C(NR’R”R’”)＝NR””、-NR-C(NR’R”)＝NR’”、-S(O)R’、-S(O)₂R’、-S(O)₂NR’R”、-NRSO₂R’、-CN和-NO₂、-R’、-N₃、-CH(Ph)₂、氟(C₁-C₄)烷氧基和氟(C₁-C₄)烷基，數(shù)目在0至芳香環(huán)體系的開環(huán)化合價的總數(shù)范圍內(nèi)；以及其中R’、R”、R”’和R””優(yōu)選地獨立地選自氫，取代的或未被取代的烷基、取代的或未被取代的雜烷基、取代的或未被取代的芳基和取代的或未被取代的雜芳基。當(dāng)本發(fā)明的化合物包括多于一種R基團，例如，當(dāng)存在多于一種這些基團時，每種R基團被獨立地選擇為各種R’、R”、R’”和R””基團。

芳基環(huán)或雜芳基環(huán)的相鄰原子上的兩個取代基可任選地被式-T-C(O)-(CRR’)_q-U-的取代基取代，其中T和U獨立地是-NR-、-O-、-CRR’-或單鍵，以及q是0至3的整數(shù)?？晒┻x擇地，芳基環(huán)或雜芳基環(huán)的相鄰原子上的兩個取代基任選地被式-A-(CH₂)_r-B-的取代基取代，其中A和B獨立地是-CRR’-、-O-、-NR-、-S-、-S(O)-、-S(O)₂-、-S(O)₂NR’-或單鍵，以及r是1至4的整數(shù)。如此形成的新環(huán)的一個單鍵可任選地被雙鍵取代?？晒┻x擇地，芳基環(huán)或雜芳基環(huán)的相鄰原子上的兩個取代基可任選地被式-(CRR’)_s-X-(CR”R’”)_d-的取代基取代，其中s和d獨立地是0至3的整數(shù)，并且X是-O-、-NR’-、-S-、-S(O)-、-S(O)₂-或-S(O)₂NR’-。取代基R、R’、R”和R’”優(yōu)選地獨立選自氫或取代的或未被取代的(C₁-C₁₆)烷基。示例性芳基取代基包括在本文中被稱為“反應(yīng)性官能團”和“鍵合位點”的基團。

如本文使用的，術(shù)語“雜原子”包括氧(O)、氮(N)、硫(S)和硅(Si)。

符號“R”是表示取代基的通用縮寫，所述取代基選自H、取代的或未被取代的烷基、取代的或未被取代的雜烷基、取代的或未被取代的芳基、取代的或未被取代的雜芳基和取代的或未被取代的雜環(huán)基。R也可以指烷基取代基和芳基取代基。

術(shù)語“鹽”包括根據(jù)本文描述的化合物上的具體取代基，用相對無毒的酸或堿制備的化合物的鹽。當(dāng)本發(fā)明的化合物含有相對酸性官能性時，可通過使中性形式的這樣的化合物與足量的凈相(neat)或在適當(dāng)?shù)亩栊匀軇┲械南Ｍ膲A接觸，獲得堿加成鹽。堿加成鹽的例子包括鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、銨鹽、有機氨鹽或鎂鹽，或相似的鹽。當(dāng)本發(fā)明的化合物含有相對堿性官能性時，可通過使中性形式的這樣的化合物與足量的凈相或在適當(dāng)?shù)亩栊匀軇┲械南Ｍ乃峤佑|，獲得酸加成鹽。酸加成鹽的例子包括來源于無機酸如鹽酸、氫溴酸、硝酸、碳酸、一氫碳酸、磷酸、一氫磷酸、二氫磷酸、硫酸、一氫硫酸、氫碘酸或亞磷酸等的鹽，以及來源于相對無毒的有機酸如乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、馬來酸、蘋果酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、富馬酸、乳酸、扁桃酸、鄰苯二甲酸、苯磺酸、對甲苯磺酸、檸檬酸、酒石酸、甲磺酸等的鹽。還包括氨基酸如精氨酸等的鹽，以及有機酸如葡萄糖醛酸或半乳糖醛酸等的鹽(見例如Berge等人,Journal of Pharmaceutical Science,66:1-19(1977))。本發(fā)明的某些特定化合物兼有堿性官能性和酸性官能性，這允許化合物被轉(zhuǎn)化為堿加成鹽或酸加成鹽。還包括鹽的水合物。

如本文使用的，“核酸”是指核苷、核苷酸和寡核苷酸，例如DNA、RNA，無論單鏈、雙鏈或更高度聚合的雜交基序，以及其任何化學(xué)修飾物。修飾物包括但不限于提供化學(xué)基團的修飾物，所述化學(xué)基團將另外的電荷、極化性、氫鍵、靜電相互作用和反應(yīng)性合并至核酸配基核堿基或合并至核酸配基作為整體。這樣的修飾物包括但不限于磷酸二酯基團修飾物(例如硫代磷酸酯、甲基膦酸酯)、糖修飾物、5-位嘧啶修飾物、8-位嘌呤修飾物、在環(huán)外胺處的修飾、內(nèi)容非標(biāo)準(zhǔn)或非天然核堿基如4-硫脲核苷、5-溴代尿嘧啶或5-碘代尿嘧啶置換；骨架修飾物如肽核酸(PNA)、乙二醇核酸(GNA)、嗎啉代基；甲基化物如2’-O-甲基核苷、5-甲基-2’-脫氧胞苷；非常規(guī)堿基配對組合物如異堿基、異胞苷和異胍等。“核單體(nucleomonomer)”是指單個核酸單位，其可以是核苷、核苷酸或其修飾物。

本文使用的“核堿基(nucleobase)”包括不僅含有已知的嘌呤雜環(huán)和嘧啶雜環(huán)和本發(fā)明的嘧啶，還含有其雜環(huán)類似物和互變異構(gòu)體的部分。嘌呤包括腺嘌呤和鳥嘌呤，示例性的嘌呤類似物包括8-氧代-N⁶-甲基腺嘌呤和7-脫氮雜黃嘌呤。嘧啶包括胸腺嘧啶、尿嘧啶和胞嘧啶，以及其類似物如5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶和4,4-乙基胞嘧啶(4,4-ethanocytosine)。該術(shù)語還涵蓋非天然核堿基。代表性的非天然核堿基包括5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羥基甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、β-d-半乳糖基辮苷(beta-D-galactosylqueosine)、肌苷、N⁶-異戊烯基腺嘌呤、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N⁶-腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基辮苷(beta-D-mannosylqueosine)、5’-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫-N⁶-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-羥乙酸(v)、懷丁氧苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶、辮苷(queuosine)、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-羥乙酸甲酯、尿嘧啶-5-羥乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w、硝基吲哚和2,6-二氨基嘌呤。

在各種實施方式中，本發(fā)明的化合物包括在5-位衍生的嘧啶。衍生物是1-鏈烯基、1-炔基、芳雜環(huán)和1-炔基芳雜環(huán)修飾物。“1-鏈烯基”是指烯屬不飽和(含雙鍵)非環(huán)基團(acyclic group)?！?-炔基”是指炔屬不飽和(含有三鍵)非環(huán)基團。

本文使用的“核苷”是指核酸的亞單位，其中核堿基共價連接于糖或糖類似物，并且所述亞單位任選地包括亞磷酸酯、亞磷酰胺或磷化氫。術(shù)語核苷包括核糖核苷、脫氧核糖核苷或任何其他核苷，所述其他核苷是核堿基的N-糖苷或C-糖苷。糖碳的立體化學(xué)結(jié)構(gòu)可以不同于D-核糖的立體化學(xué)結(jié)構(gòu)。核苷還包括含有糖部分的修飾物的物質(zhì)，例如，其中一個或多個羥基被鹵素、雜原子、脂肪族基團取代，或被官能化為醚類、胺類、硫醇等。戊糖部分可以被己糖或可供選擇的結(jié)構(gòu)如環(huán)戊烷環(huán)、6元嗎啉環(huán)等取代。如本文定義的核苷還包括連接于氨基酸和/或氨基酸類似物的核堿基，所述氨基酸和/或氨基酸類似物具有游離羧基和/或游離氨基和/或其受保護的形式。核苷也任選地包括一種或多種核堿基修飾物，例如用氟碳基(fluorocarbyl)、鏈烯基或炔基部分修飾的核堿基修飾物。包括磷酸二酯或磷酸二酯修飾物的核苷在本文中被稱為核苷酸。如本文定義的核苷也意圖包括連接于氨基酸和/或氨基酸類似物的核堿基，所述氨基酸和/或氨基酸類似物具有游離羧基和/或游離氨基和/或其受保護的形式。

如本文使用的“糖修飾物”是指除了2’-脫氧核糖以外的任何戊糖或己糖部分。修飾的糖包括例如D-核糖，2’-O-烷基、2’-氨基、2’-鹵素官能化的戊糖、己糖等。示例性糖修飾物包括其中一個或多個羥基被鹵素、雜原子、烷基部分取代，或被官能化為醚類、酯類等的糖。戊糖部分可以被己糖或可供選擇的結(jié)構(gòu)如環(huán)戊烷環(huán)、6元嗎啉環(huán)等取代。還包括具有除了D-核糖的立體化學(xué)結(jié)構(gòu)以外的立體化學(xué)結(jié)構(gòu)的糖。

“磷酸二酯基團修飾物”是指共價偶聯(lián)相鄰的核單體的天然磷酸二酯基團的任何類似物。替代鍵合包括：磷酸二酯類似物，例如硫代磷酸酯和甲基膦酸酯；和含有鍵的非磷物質(zhì)，例如縮醛和酰胺。

核酸修飾物還包括3’、5’和堿基修飾物如用猝滅劑(例如BHQ)、熒光團、插入劑、小溝結(jié)合劑、碳氟化合物、穩(wěn)定基團或另一部分標(biāo)記。在各種實施方式中，修飾物或標(biāo)記通過接頭基團共價綴合于低聚物。

本文將低聚物定義為彼此通過磷酸二酯或修飾的磷酸二酯部分共價偶聯(lián)的兩個或更多個核單體(nucleomonomer)。因此，低聚物可具有少至兩個核單體(二聚體)，且基本上沒有核單體的上限。低聚物可以是有能力結(jié)合的，因此，可以與同源的單鏈或雙鏈(或更高級聚合)核酸序列進行堿基配對。低聚物也用作如本文描述的更長的低聚物的合成子。低聚物也可含有脫堿基位點和假核苷。在各種實施方式中，本發(fā)明的低聚物是官能化的。下文討論了官能化低聚物的部分。在描述某些實施方式中，術(shù)語“低聚物”可交換地用于指低聚物的核酸序列、提供本發(fā)明的探針的修飾的核酸序列或提供本發(fā)明的固體支持物的修飾的核酸序列。

“肽”是指其中單體是氨基酸并通過酰胺鍵連接在一起的低聚物，可供選擇地被稱為多肽。當(dāng)氨基酸是α-氨基酸時，可使用L-旋光異構(gòu)體或D-旋光異構(gòu)體。另外，也包括非天然氨基酸，例如β-丙氨酸、苯甘氨酸和高精氨酸。通常遇見的非基因編碼的氨基酸也可用于本發(fā)明。本發(fā)明使用的所有氨基酸可以是D-異構(gòu)體或L-異構(gòu)體。一般優(yōu)選L-異構(gòu)體。另外，其他模擬肽在本發(fā)明中也是有用的。一般性綜述見Spatola,A.F.,氨基酸、肽和蛋白質(zhì)的化學(xué)和生物化學(xué)(Chemistry and Biochemistry of Amino Acids,Peptides and Proteins),B.Weinstein編,Marcel Dekker,New York,p.267(1983)。

“固體支持物”是具有用于連接分子、化合物、細胞或其他實體的表面或這些物質(zhì)連接的表面的固體物質(zhì)。固體支持物的表面可以是平的或呈其他結(jié)構(gòu)的。固體支持物可以是有孔的或無孔的。固體支持物可以是包括表面的芯片或陣列，以及可包括玻璃、硅、尼龍、聚合物、塑料、陶瓷或金屬的芯片或陣列。固體支持物也可以是膜(如尼龍膜、硝化纖維素膜或高分子膜)，或板或盤，并且可以由玻璃、陶瓷、金屬或塑料組成，例如由例如聚苯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯或聚異質(zhì)同晶體制成的96孔板。固體支持物也可以是任何形狀的珠或顆粒，并優(yōu)選是球形的或接近球形的，并且珠或顆粒優(yōu)選具有1毫米或更少的直徑或最大寬度，更優(yōu)選為0.1至100微米的直徑或最大寬度。這樣的顆?；蛑榭梢杂扇魏芜m合的材料(例如玻璃或陶瓷)和/或一種或多種聚合物(例如尼龍、聚四氟乙烯、TEFLON^TM、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、瓊脂糖凝膠(sepaharose)、瓊脂糖、纖維素、纖維素衍生物或葡聚糖)組成，和/或可包括金屬，尤其是順磁性金屬，如鐵。

用于固相合成的支持物是本領(lǐng)域已知的，并且包括但不限于高交聯(lián)劑聚苯乙烯(McCollum等人,Tetrahedron Lett.32:4069-4072(1991))、聚苯乙烯/PEG共聚物(Gao等人,Tetrahedron Lett.32:5477-5480(1991))、硅膠(Chow等人,Nucl.Acids Res.9:2807-2817(1981))、聚酰胺鍵合硅膠(Gait等人,Nucl.Acids Res.10:6243-6254(1982))、纖維素(Crea等人,Nucl.Acids Res.8:2331-2348(1980))和可控孔度玻璃(CPG)(Koster等人,Tetrahedron Lett.24:747-750(1983))。示例性固體支持物是CPG珠。CPG珠可衍生化用于以各種方式連接核單體或低聚物。例如，可以用3-氨丙基三乙氧基硅烷處理CPG珠，以添加氨丙基接頭柄(handle)，用于連接寡核苷酸類似物單體或二聚體(Koster,等人,Tetrahedron Lett.24:747-750(1983))，或者，優(yōu)選長鏈烷基胺基團，最優(yōu)選包括末端核苷的長鏈烷基胺基團，可以連接于CPG(Adams,等人,J.Am.Chem.Soc.105:661-663(1983))。用于寡核苷酸合成或肽合成的支持物例如dT-LCAA-CPG(Applied Biosystems)是商業(yè)可獲得的。

“插入劑”是指能在相鄰的核堿基之間部分插入和堆疊的平面芳香族或芳雜環(huán)部分。這些部分可以是小分子或更大實體如蛋白質(zhì)的一部分。插入劑的非限制性的例子包括吖啶、蒽、蒽環(huán)類、蒽環(huán)酮、亞甲基藍、吲哚、蒽醌、喹啉、異喹啉、二氫醌、四環(huán)素、補骨脂素、香豆素、鹵化乙錠、乙錠均二聚體、同型二聚體唑黃(YOYO)、噻唑橙(TOTO)、蒽環(huán)抗生素(dynemicins)、1,10-菲咯啉-銅、卡奇霉素(calcheamicin)、卟啉類、偏端霉素、紡錘菌素(netropcins)和紫羅堿。

“小溝結(jié)合劑”是指典型地具有約150至約2000道爾頓的分子量的部分。所述部分以非插入的方式結(jié)合于雙鏈(或更高級聚合)DNA、RNA或其雜交體的小溝內(nèi)，優(yōu)選地，具有大于約10³M^-1的締合常數(shù)。小溝結(jié)合化合物具有廣泛變化的化學(xué)結(jié)構(gòu)，然而，示例性小溝結(jié)合劑具有月牙形三維結(jié)構(gòu)。示例包括某些天然存在的化合物如紡錘菌素、偏端霉素和萊克西菌素(lexitropsin)、光神霉素、色霉素A₃、橄欖霉素、蒽霉素、西伯利亞霉素，以及進一步相關(guān)的抗生素和合成衍生物。某些雙季銨鹽雜環(huán)化合物，二芳基脒如戊烷脒、脒(stilbamidine)和貝尼爾(berenil)、CC-1065和相關(guān)吡咯并吲哚和吲哚多肽、赫斯特33258、4’-6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)以及許多由天然存在的或合成的氨基酸組成的寡肽是小溝結(jié)合劑化合物。美國專利號6,084,102中描述了示例性小溝結(jié)合劑?？梢酝ㄟ^良好建立的分光光度法如紫外(u.v.)光譜和核磁共振(NMR)光譜以及通過凝膠電泳檢測該類型的結(jié)合。當(dāng)小溝結(jié)合劑分子結(jié)合時紫外光譜的移位和利用“核歐沃豪斯”(NOSEY)效應(yīng)的NMR光譜是尤其熟知的并且是對于該目的有用的技術(shù)。凝膠電泳檢測小溝結(jié)合劑與雙鏈DNA或其片段的結(jié)合，因為在這種結(jié)合時雙鏈DNA的遷移率改變。

小溝結(jié)合劑典型地通過包括約20個原子、約15個原子、約10個原子或約5個原子的鏈的接頭連接于低聚物或固體支持物。

基于相對于小溝結(jié)合劑的“月牙形”或類似的幾何結(jié)構(gòu)，插入劑是平面芳香族(優(yōu)選多環(huán)的)分子，容易地將插入部分或插入劑與小溝結(jié)合劑區(qū)分開。通過利用核歐沃豪斯效應(yīng)的NMR光譜也可以進行實驗性區(qū)分。

本文使用的術(shù)語“接頭”或“L”是指單個共價鍵(“零級”)或并入了1-30個選自由C、N、O、S、Si和P組成的組的非氫原子的一系列穩(wěn)定的共價鍵，所述共價鍵使本發(fā)明的組分共價連接在一起，例如使固體支持物連接于本發(fā)明的穩(wěn)定劑、猝滅劑、核單體或低聚物；或使猝滅劑或穩(wěn)定部分與本發(fā)明的亞酰胺中的核堿基連接。示例性接頭包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個非氫原子。除非另有說明，涉及連接的“連接(linking)”、“連接的(linked)”、“鍵合(linkage)”、“綴合(conjugating)”、“綴合的(conjugated)”和類似術(shù)語是指利用接頭的技術(shù)和并入接頭的物質(zhì)。示例性接頭包括如本文定義的鍵合位點。此外，接頭用于使低聚物或初期低聚物(低聚物合成過程中)與本發(fā)明的固體支持物連接。因此，本發(fā)明也提供通過接頭共價連接于固體支持物(例如本發(fā)明的固體支持物)的本發(fā)明的低聚物。本發(fā)明的固體支持物和低聚物任選地包括固體支持物和低聚物的兩種組分之間(例如，低聚物和固體支持物之間，熒光團和低聚物之間，猝滅劑和低聚物之間，熒光團和猝滅劑之間等)的可裂解接頭。在各種實施方式中，將固體支持物連接于低聚物的接頭是可裂解接頭。

“可裂解接頭”是具有一個或多個可裂解基團的接頭，所述可裂解基團可通過反應(yīng)或條件的結(jié)果被破壞。示例性可裂解接頭位于式I或式II的R⁸內(nèi)，用于使本發(fā)明的合成的低聚物從在其上合成該低聚物的固體支持物方便地分離。術(shù)語“可裂解基團”是指通過裂解連接釋放部分與綴合物剩余部分的鍵，允許釋放本發(fā)明的固體支持物或低聚物的組分的部分。在制備和使用本發(fā)明的低聚物和固體支持物中所使用的示例性裂解機制是酶促或以其他方式化學(xué)介導(dǎo)的。

除了酶促可裂解基團外，本發(fā)明的范圍也包括通過試劑而非酶的作用裂解的一個或多個位點。示例性非酶促裂解試劑包括但不限于酸、堿、光(例如硝基芐基衍生物、苯甲酰甲基、鄰-羥基肉桂酸酯、苯偶姻酯)和熱。許多可裂解基團是本領(lǐng)域已知的。見例如Jung等人,Biochem.Biophys.Acta,761:152-162(1983)；Joshi等人,J.Biol.Chem.,265:14518-14525(1990)；Zarling等人,J.Immunol.,124:913-920(1980)；Bouizar等人,Eur.J.Biochem.,155:141-147(1986)；Park等人,J.Biol.Chem.,261:205-210(1986)；Browning等人,J.Immunol.,143:1859-1867(1989)。此外，寬范圍的可裂解的、雙官能的(同雙官能和異雙官能的)間隔臂是商業(yè)可獲得的。

示例性可裂解基團是可通過試劑例如氫氧化鈉、氨或其他胺裂解的。在各種實施方式中，在室溫或在加熱下容易地裂解可裂解接頭。在一個實施方式中，式I和式II的R⁸包括通過胺(例如氨或有機溶液中的基本無水的胺)處理裂解的可裂解接頭。

“鍵合位點”是連接兩種或更多種組分(例如官能性組分、固體支持物、寡肽或接頭)的部分。該術(shù)語是指通過互補反應(yīng)配偶體的反應(yīng)形成的共價鍵，每個配偶體具有與其配偶體的官能團互補反應(yīng)性的官能團。本發(fā)明的固體支持物和低聚物中的鍵合位點是獨立選擇的。示例性鍵合位點包括但不限于S、SC(O)NH、HNC(O)S、SC(O)O、O、NH、NHC(O)、(O)CNH和NHC(O)O，和OC(O)NH、CH₂S、CH₂O、CH₂CH₂O、CH₂CH₂S、(CH₂)_oO、(CH₂)_oS或(CH₂)_oY^x-PEG，其中Y^x是S、NH、NHC(O)、C(O)NH、NHC(O)O、OC(O)NH或O，以及o是1至50的整數(shù)。在每個這些示例性鍵合位點中，NH可以是NR^t，其中R^t是取代的或未被取代的烷基，或取代的或未被取代的雜烷基。鍵合位點可以是磷酸二酯基團。在各種實施方式中，鍵合位點在接頭和熒光團之間，接頭和猝滅劑之間，接頭和穩(wěn)定部分之間或接頭和固體支持物之間。在本發(fā)明的低聚物和固體支持物的示例性實施方式中，每個鍵合位點是不同的。

本文使用的術(shù)語“熒光團”是指固有熒光的部分，或說明在結(jié)合于生物化合物或金屬離子，或通過酶促代謝時熒光性的改變，即熒光的(fluorogenic)。熒光團可以被取代以改變熒光團的溶解性、光譜性能或物理性能。許多熒光團對本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的，并包括但不限于香豆素、吖啶、呋喃、丹酰、花菁(cyanines)、芘、萘、苯并呋喃、喹啉、喹唑啉酮、吲哚、氮茚、硼聚苯并氮雜吲哚(borapolyazaindacene)、嗪和氧雜蒽，后者包括熒光素、若丹明、若薩明(rosamine)、對甲氨基酚(rhodol)。Haugland,分子探針(Molecular Probes)，熒光探針和研究化學(xué)的手冊(Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals)中描述了本發(fā)明使用的這些和其他熒光團。在共同擁有的美國專利申請?zhí)?005/0214833和2005/0170363，以及本文下文中描述了進一步有用的熒光團。

本文使用的“猝滅劑”是指可以至少部分地使熒光團發(fā)射的光減弱的本發(fā)明的任何修飾部分。這種減弱被稱為“猝滅”。因此在各種實施方式中，在猝滅基團的存在下熒光團的激發(fā)導(dǎo)致產(chǎn)生比預(yù)期強度小或者甚至完全不存在的發(fā)射信號。猝滅典型地通過激發(fā)的熒光團和猝滅基團之間的能量轉(zhuǎn)移發(fā)生。

熒光團或猝滅劑可包括提高希望的特性的取代基，相對于不存在這樣的取代基的“母體”化合物，所述希望的特性例如水中的溶解度、細胞通透性或改變的吸收和發(fā)射譜。如此，本發(fā)明中使用的熒光團或猝滅劑包括相對于不存在改進取代基的相同母體化合物，提高希望的特性的取代基。

“官能性組分”是對本發(fā)明的具有選自以下結(jié)構(gòu)的化合物中的部分的通用術(shù)語，所述結(jié)構(gòu)選自猝滅劑、熒光團或穩(wěn)定部分(包括但不限于插入劑、小溝結(jié)合部分、穩(wěn)定部分(例如炔基和氟烷基部分)修飾的核堿基，和構(gòu)象穩(wěn)定部分，如共同擁有的美國專利申請?zhí)?007/0059752中描述的那些)。

表述“多核苷酸的擴增”包括但不限于方法如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、連接擴增(或連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，LCR)和基于使用Q-β復(fù)制酶的擴增方法。這些方法是眾所周知的并在本領(lǐng)域廣泛實踐的。見例如，美國專利號4,683,195和4,683,202，以及Innis等人,1990(對于PCR)；以及Wu等人,1989a(對于LCR)。用于進行PCR的試劑和硬件是商業(yè)可獲得的。用于擴增來自具體基因區(qū)域的序列的引物優(yōu)選與靶區(qū)域或靶區(qū)域側(cè)翼區(qū)中的序列互補并與其特異地雜交。可直接對通過擴增產(chǎn)生的核酸序列測序?？晒┻x擇地，在序列分析之前可以克隆擴增的序列。Scharf(1986)描述了用于酶促擴增的基因組片段的直接克隆和序列分析的方法。本發(fā)明提供了用于擴增過程的低聚物引物。此外，提供了用于合成這樣的引物的固體支持物。除了引物，本發(fā)明提供了探針，使用這樣的探針的方法，以檢測、表征或定量擴增產(chǎn)物：還提供了使用固體支持物以合成這些低聚物探針。

術(shù)語“堿基堆積擾動(base-stacking perturbations)”是指引起堿基堆積的擾動的任何事件，例如堿基對錯配、蛋白質(zhì)結(jié)合于其識別位點，或任何其他形成寡核苷酸加合物的實體。本發(fā)明的各種探針能夠檢測、表征和/或定量這樣的堿基堆積擾動。此外，本發(fā)明提供用于合成能夠檢測、表征和/或定量這樣的堿基堆積擾動的探針的固體支持物。

術(shù)語“雜交的”是指兩個核酸鏈相互關(guān)聯(lián)，所述關(guān)聯(lián)可以是完全堿基配對的或不完全堿基配對的：一般地，該術(shù)語是指包括本發(fā)明的低聚物的關(guān)聯(lián)，無論所述低聚物結(jié)合于固體支持物或在溶液中。

術(shù)語“變性”是指核酸雙螺旋(或更高級聚合體)的鏈不再通過氫鍵堿基配對并且分離成為單鏈分子的過程。變性的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是熟知的，并且包括熱變性和堿變性。該術(shù)語一般是指本發(fā)明的探針從其靶核酸解離。

術(shù)語“錯配”是指在非100％互補的雜交核酸雙螺旋(或更高級聚合體)中的核酸的核堿基。錯配包括任何位于核酸互補鏈的兩個核堿基的核堿基之間的不正確配對，所述不正確配對不是沃森-克里克堿基配對，例如A:T或G:C?？偼葱缘娜狈赡苁怯捎谌笔?、插入、倒位、置換或移碼突變。在各種實施方式中，本發(fā)明的低聚物包括相對于其靶核酸的錯配，優(yōu)選允許該低聚物的靶標(biāo)中對應(yīng)錯配的檢測和/或表征和/或定量。在某些實施方式中，錯配是單個核苷酸錯配。

如本文使用的，術(shù)語“多態(tài)性”是指基因中的序列變異，以及“突變”是指與表型相關(guān)或被認為與表型相關(guān)的基因中的序列變異。術(shù)語“基因”是指編碼功能性產(chǎn)物蛋白控制區(qū)域的基因組片段。根據(jù)本發(fā)明使用的用于受試者識別的多態(tài)性標(biāo)記位于基因組的編碼區(qū)或非編碼區(qū)，并且本發(fā)明的各種探針被設(shè)計為與包括這些標(biāo)記的核酸區(qū)域雜交。如本文使用的術(shù)語“受試者”是指提供出于基因測試的目的獲得靶核酸的測試樣品的受試者。本發(fā)明的低聚物用于檢測和/或表征和/或定量多態(tài)性和突變。此外，本發(fā)明的固體支持物用于合成用于檢測和/或表征和/或定量多態(tài)性和突變的低聚物。

如本文使用的術(shù)語“探針”是指使用本發(fā)明的固體支持物或亞酰胺制備的核酸低聚物。在各種實施方式中，探針在與結(jié)合配偶體相互作用時產(chǎn)生了可檢測的響應(yīng)。探針包括至少一個可檢測部分，或在探針響應(yīng)于與結(jié)合配偶體的相互作用探針的狀態(tài)發(fā)生一些改變時，形成可檢測的能量轉(zhuǎn)移對的一對部分。本發(fā)明提供了探針，和用于合成探針的亞酰胺和固體支持物。本發(fā)明的示例性探針用于檢測多態(tài)性。在各種實施方式中，多態(tài)性是單核苷酸多態(tài)性(SNP)。

本文使用的術(shù)語“可檢測響應(yīng)”是指信號的改變或發(fā)生，所述信號是通過觀察或通過儀器直接或間接可檢測的，以及所述信號的存在，優(yōu)選所述信號的幅度是用于測試樣品中的探針的靶結(jié)合配偶體的存在的函數(shù)。典型地，可檢測響應(yīng)是來自熒光團的光學(xué)響應(yīng)，該光學(xué)響應(yīng)導(dǎo)致吸收光或熒光的波長分布特征或強度的改變，或光散射、熒光量子收率、熒光壽命、熒光偏振的改變，激發(fā)或發(fā)射波長的轉(zhuǎn)變或以上參數(shù)的組合。給出的光譜特性的可檢測的改變一般是熒光強度的增加或減少。然而，導(dǎo)致熒光發(fā)射或激發(fā)的波長的轉(zhuǎn)變的光譜改變也是有用的。在離子結(jié)合上的熒光的改變通常是因為可以在熒光團的激發(fā)態(tài)或基態(tài)發(fā)生的指示劑中的構(gòu)象或電荷改變，因為在離子結(jié)合位點的電荷密度的改變，因為通過結(jié)合的靶金屬離子而使熒光猝滅，或因為這些或其他作用的任何組合。可供選擇地，可檢測響應(yīng)是信號的發(fā)生，其中熒光團是內(nèi)在發(fā)熒光的，并且在結(jié)合于金屬離子或生物化合物時信號不產(chǎn)生改變。本發(fā)明提供了提供可檢測響應(yīng)的探針和用于合成這樣的探針的固體支持物。

本文使用的術(shù)語“載體分子”是指本發(fā)明的化合物連接的任何分子。代表性載體分子包括但不限制于蛋白質(zhì)(例如酶、抗體)、糖蛋白、肽、糖類(例如單糖、寡糖和多糖)、激素、受體、抗原、底物、代謝物、過渡態(tài)類似物、輔因子、抑制劑、藥物、染料、營養(yǎng)物、生長因子等?！拜d體分子”也指不能被認為落入“分子”的經(jīng)典定義的物質(zhì)，例如固體支持物(例如合成支持物、色譜支持物、膜)、病毒和微生物。

符號展示與鍵垂直，表明所展示的部分與分子剩余部分連接的點。

在一些實施方式中，本文使用的術(shù)語的定義是根據(jù)IUPAC進行的。

Cosmic猝滅劑

在一個方面，本發(fā)明提供了具有根據(jù)式I或式II的結(jié)構(gòu)的化合物(猝滅劑)：

R^1a、R^1b、R^7a和R^7b獨立地選自H、取代的或未被取代的烷基、取代的或未被取代的環(huán)烷基、取代的或未被取代的雜烷基和取代的或未被取代的雜環(huán)烷基。

R^1a和R^1b與它們所連接的碳原子任選地連接在一起以形成環(huán)，所述環(huán)是選自取代的或未被取代的C₃-C₇環(huán)烷基和3元至7元雜環(huán)烷基的成員。

R^7a和R^7b與它們所連接的碳原子任選地連接在一起以形成環(huán)，所述環(huán)是選自取代的或未被取代的C₃-C₇環(huán)烷基和3元至7元雜環(huán)烷基的成員。

R^1a、R^1b、R^7a和R^7b中的至少一個不是H。

R⁸選自H、L^x、L^xs、R^s和R^x如本文的定義。

本公開涵蓋了R^1a、R^1b、R^7a、R^7b和R⁸的任意組合，并且本發(fā)明特別提供了R^1a、R^1b、R^7a、R^7b和R⁸的任意組合。

在一些實施方式中，R^1a和R^1b各自是H。

在一些實施方式中，R^1a和R^1b獨立地選自未被取代的C₁、C₂、C₃、C₄、C₅和C₆烷基。

在一些實施方式中，R^1a和R^1b各自是甲基。

在一些實施方式中，R^7a和R^7b各自是H。

在一些實施方式中，R^7a和R^7b獨立地選自未被取代的C₁、C₂、C₃、C₄、C₅和C₆烷基。

在一些實施方式中，R^7a和R^7b各自是甲基。

在一些實施方式中，R^1a和R^1b獨立地選自未被取代的C₁、C₂、C₃、C₄、C₅和C₆烷基，以及R^7a和R^7b各自是H。

在一些實施方式中，R^1a和R^1b各自是甲基，以及R^7a和R^7b各自是H。

在一些實施方式中，R^1a和R^1b各自是H，以及R^7a和R^7b獨立地選自未被取代的C₁、C₂、C₃、C₄、C₅和C₆烷基。

在一些實施方式中，R^1a和R^1b各自是H，以及R^7a和R^7b各自是甲基。

在一些實施方式中，R^1a、R^1b、R^7a和R^7b獨立地選自未被取代的C₁、C₂、C₃、C₄、C₅、和C₆烷基。

在一些實施方式中，R^1a、R^1b、R^7a和R^7b各自是甲基。

在一些實施方式中，L^x選自鍵、取代的或未被取代的烷基、取代的或未被取代的環(huán)烷基、取代的或未被取代的雜烷基和取代的或未被取代的雜環(huán)烷基。

在一些實施方式中，L^x選自未被取代的C₁、C₂、C₃、C₄、C₅、C₆、C₇、C₈、C₉和C₁₀烷基。

在一些實施方式中，L^xs選自取代的或未被取代的烷基、取代的或未被取代的環(huán)烷基、取代的或未被取代的雜烷基和取代的或未被取代的雜環(huán)烷基。

在一些實施方式中，L^xs是取代的雜烷基。

在一些實施方式中，R^s選自保護或未保護的反應(yīng)性官能團、鍵合位點和固體支持物。

在一些實施方式中，R^s選自-OH、-ODMT和共價結(jié)合固體支持物的接頭的鍵合位點。

“DMT”是指4,4’-二甲氧基三苯甲基。

在一些實施方式中，固體支持物是可控孔度玻璃(CPG)。

在一些實施方式中，R^x選自保護或未保護的反應(yīng)性官能團和鍵合位點。

在一些實施方式中，R^x選自亞磷酰胺、-OH、-ODMT、-COOH、活性酯(如N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)酯)和-NH₂。

“DMT”是指4,4’-二甲氧基三苯甲基。

在一些實施方式中，鍵合位點共價結(jié)合于獨立地選自核苷、核苷的接頭、核苷酸、核苷酸的接頭、寡核苷酸、寡核苷酸的接頭、核酸、核酸的接頭、載體分子、載體分子的接頭、固體支持物和固體支持物的接頭的成員。

在一些實施方式中，R^x是共價結(jié)合于核苷的接頭的鍵合位點，其中所述核苷具有結(jié)構(gòu)：

其中標(biāo)記環(huán)的B是核堿基；

Rⁿ³是-OH或亞磷酰胺；以及

Rⁿ⁵是-OH或-ODMT。

“DMT”是指4,4’-二甲氧基三苯甲基。

在一些實施方式中，R⁸選自：

單體

在各種實施方式中，本發(fā)明提供了用于合成具有內(nèi)在修飾的低聚物的單體核酸。在代表性的實施方式中，單體核酸具有猝滅劑部分。根據(jù)該實施方式的示例性單體核酸具有式：

其中Q是猝滅劑部分；

Lⁿ是接頭；

標(biāo)記環(huán)的B是核堿基；

Rⁿ³是-OH或亞磷酰胺；以及

Rⁿ⁵是-OH或-ODMT。

“DMT”是指4,4’-二甲氧基三苯甲基。

在一些實施方式中，猝滅劑部分(Q)具有根據(jù)式I或式II的結(jié)構(gòu)：

其中R^1a、R^1b、R^7a、R^7b和R⁸如本文所定義；以及R⁸包括共價結(jié)合于Lⁿ的鍵合位點。

在一些實施方式中，Lⁿ選自鍵、取代的或未被取代的烷基、取代的或未被取代的環(huán)烷基、取代的或未被取代的雜烷基和取代的或未被取代的雜環(huán)烷基。

示例性核堿基包括：

低聚物

還提供了核酸低聚物(例如探針)，所述核酸低聚物使用本發(fā)明的單體制備并包括合成該核酸低聚物的單體的組分。

示例性低聚物包括寡核苷酸、寡核苷、寡脫氧核糖核苷酸(包含2’-脫氧-D-核糖或其修飾形式)即DNA、寡核糖核苷酸(包含D-核糖或其修飾的形式)即RNA，以及任何其他類型的多核苷酸，所述其他類型的多核苷酸是嘌呤或嘧啶核堿基或修飾的嘌呤或嘧啶核堿基的N-糖苷或C-糖苷。如本文使用的低聚物還包括化合物，其中相鄰的核單體通過酰胺鍵連接，如之前所描述的(Nielsen等人,Science(1991)254:1497-1500)。一般在低聚物中發(fā)現(xiàn)的元件，如呋喃糖環(huán)和/或磷酸二酯鍵可以被任何合適的功能上等價的元件取代?！暗途畚铩币虼艘鈭D包括充當(dāng)用于核堿基的支架或支持物的任何結(jié)構(gòu)，其中支架允許以序列依賴的方式結(jié)合于靶核酸。

連接本發(fā)明的低聚物中的核單體的示例性基團包括(I)磷酸二酯和磷酸二酯修飾物(硫代磷酸酯、甲基膦酸酯等)，(II)含有非磷等排物(甲酰縮醛(formacetal)、核糖縮醛(riboacetal)、氨基甲酸酯等)的替代鍵合，(III)嗎啉基殘基、碳環(huán)殘基或其他呋喃糖，如阿拉伯糖，或代替核糖或脫氧核糖的己糖，以及(IV)通過酰胺鍵連接的核單體或通過任何合適的替代鍵合連接的非環(huán)核單體。

本發(fā)明的低聚物可以用修飾的和常見的核單體形成，以及使用目前商業(yè)可獲得的標(biāo)準(zhǔn)固相(或溶液相)低聚物合成技術(shù)合成。通常，通過包括以下步驟的方法合成低聚物：合成具有保護基團和核堿基以及能夠偶聯(lián)于核單體或低聚物的偶聯(lián)基團的核單體或低聚物合成子；將核單體或低聚物合成子偶聯(lián)于受體核單體或受體低聚物；移除保護基團；并根據(jù)需要重復(fù)循環(huán)直至合成希望的低聚物。

本發(fā)明的低聚物可以是包括大于40、50或100個核單體的低聚物的任何長度的低聚物。在各種實施方式中，低聚物含有2～100個核單體。大于或等于約10～40個核單體的長度對治療性或診斷性應(yīng)用是有用的。本發(fā)明特別地包括含有2、3、4或5個核單體的短低聚物，并且所述短低聚物是有用的，例如用作合成子是有用的。

具有隨機化序列并含有少于20個、少于15個或少于10個核單體的低聚物對引物是有用的(例如在使用隨機序列引物的克隆或擴增方案中的引物)，條件是低聚物含有可以作為用于聚合酶或反轉(zhuǎn)錄酶的引物的殘基。

低聚物可包含常見的磷酸二酯鍵，或可包含磷酸二酯修飾物如磷酰胺鍵。這些替代鍵合包括但不限于以下實施方式，其中式-O-P(O)(S)-O-(“硫逐磷酸酯”)、-O-P(S)(S)-O-(“二硫代磷酸酯”)、-O-P(O)-(NR^o₂)-X-、-O-P(O)(R^o)-O-O-P(S)(R^o)-O-(“硫逐烷基磷酸酯(thionoalkylphosphonate)”)、-P(O)(OR^p)-X-、-O-C(O)-X-或-O-C(O)(NR^p₂)-X-的部分，其中R^o是H(或鹽)或烷基(1-12C)，以及R^p是烷基(1-9C)，以及通過鍵合于核單體的碳的-O-或-S-使所述鍵與相鄰的核單體連接。在各種實施方式中，用于本發(fā)明的低聚物的替代鍵合包括磷酸二酯鍵、硫代磷酸酯鍵、甲基膦酸酯鍵和硫逐甲基膦酸酯鍵。硫代磷酸酯鍵和甲基膦酸酯鍵向生理環(huán)境下的低聚物提供額外的穩(wěn)定性。雖然不需要相同低聚物中所有這樣的鍵是相同的，但尤其優(yōu)選的本發(fā)明的低聚物含有一致的硫代磷酸酯鍵或一致的甲基膦酸酯鍵。

低聚物或其片段是常規(guī)地合成的，并且可以使用本發(fā)明的化合物制備?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知和本文描述的合成方法，使用適當(dāng)保護的核單體，合成含有本發(fā)明的化合物的低聚物以及本領(lǐng)域已知的其他堿基。發(fā)現(xiàn)了用于合成低聚物的方法，例如Froehler,B.,等人,nucleic acid Res.(1986)14:5399-5467；nucleic acids Res.(1988)16:4831-4839；nucleosides and nucleic acids(1987)6:287-291；Froehler,B.,Tetrahedron Lett.(1986)27:5575-5578；Caruthers,M.H.，寡脫氧核苷酸-基因表達的反義抑制(Oligodeoxynucleotides-Antisense Inhibitions of Gene Expression)(1989),J.S.Cohen,編者,CRC Press,Boca Raton,p7-24；Reese,C.B.等人,Tetrahedron Lett.(1985)26:2245-2248。還描述了通過甲基亞磷酰胺(methyl phosphonamidite)化學(xué)結(jié)構(gòu)合成甲基膦酸酯連接的低聚物(Agrawal,S.等人,Tetrahedron Lett.(1987)28:3539-3542；Klem,R.E.,等人，國際公開號WO 92/07864)。

如本文公開的，本發(fā)明提供了低聚物的“綴合物”。例如，低聚物可以共價連接于各種功能性組分，如穩(wěn)定部分、熒光團、猝滅劑、插入劑和與DNA雙螺旋的小溝特異地相互作用的物質(zhì)(小溝結(jié)合劑，“MGB”)。其他選擇的綴合部分可以是標(biāo)記如放射性標(biāo)記、熒光標(biāo)記、酶標(biāo)記或使用可裂解接頭促進細胞聯(lián)合的部分等。合適的放射性標(biāo)記包括³²P、³⁵S、³H和¹⁴C；合適的熒光標(biāo)記包括熒光素、試鹵靈、若丹明、BODIPY(分子探針)和德克薩斯紅；合適的酶包括堿性磷酸酶和辣根過氧化物酶。另外的熒光團是本文中闡述的，并且是本領(lǐng)域公認的。其他共價連接部分包括生物素、抗體或抗體片段和蛋白質(zhì)(例如轉(zhuǎn)鐵蛋白和HIV Tat蛋白)。

如本文討論的和本領(lǐng)域公認的，可以通過任何方便的鍵合使低聚物衍生化。例如小溝結(jié)合劑、熒光團、猝滅劑和插入劑，如吖啶或補骨脂素可通過任何可用的-OH或-SH連接于本發(fā)明的低聚物，例如低聚物的5’-端位、RNA的2’-位或并入嘧啶的5-位的OH、NH₂、COOH或SH。在5-位含有例如-CH₂CH₂NH₂、-CH₂CH₂CH₂OH或-CH₂CH₂CH₂SH的衍生化形式用于本發(fā)明?？梢匀缢枋龅暮铣砂ň圪嚢彼峄蛸嚢彼岬木Y合物，且所述綴合物可以進一步提高低聚物與其靶核酸序列的結(jié)合親和性(Lemaitre,M.等人,Proc Natl Acad Sci(1987)84:648-652；Lemaitre,M.等人,nucleosides and nucleic acids(1987)6:311-315).

可以連接各種各樣的取代基，包括通過鍵和替代鍵結(jié)合的取代基。低聚物的磷酸二酯鍵的-OH部分可以被磷酸基團取代，通過標(biāo)準(zhǔn)保護基團，或偶聯(lián)基團保護以制備與其他核單體的另外的鍵，或可以結(jié)合到綴合的取代基。5’-端OH可以是磷酸化的；2’-OH或3’端的OH取代基也可以是磷酸化的。羥基也可以被衍生化為標(biāo)準(zhǔn)保護基團。

本發(fā)明的低聚物可以被共價衍生化為使用可裂解接頭促進細胞聯(lián)合的部分。用于這樣的綴合物的接頭可包括二硫鍵鍵，所述二硫鍵在低聚物運輸劑綴合物進入細胞后被還原。該類型的含有二硫鍵的接頭具有可控制的半衰期。由于二硫鍵連接的氧化還原電勢，相對于胞內(nèi)條件，這樣的接頭在胞外條件下是穩(wěn)定的。

供體和受體部分

猝滅劑

本發(fā)明的示例性固體支持物和低聚物包括共價連接于它們的猝滅劑，任選地通過接頭共價連接于它們。在各種實施方式中，猝滅劑是具有根據(jù)式I或式II的接頭的部分：

其中R^1a、R^1b、R^7a、R^7b和R⁸如本文定義；以及R⁸包括共價結(jié)合(直接或通過接頭)于固體支持物的鍵合位點，共價結(jié)合(直接或通過接頭)于低聚物的鍵合位點，或上述的兩者。

本發(fā)明的化合物的一個優(yōu)勢是廣泛的能量供體分子可以與猝滅劑官能化的固體支持物和低聚物結(jié)合使用。大量的熒光團對本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。見例如Cardullo等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:8790-8794(1988)；Dexter,D.L.,J.of Chemical Physics 21:836-850(1953)；Hochstrasser等人,Biophysical Chemistry 45:133-141(1992)；Selvin,P.,Methods in Enzymology 246:300-334(1995)；Steinberg,I.Ann.Rev.Biochem.,40:83-114(1971)；Stryer,L.Ann.Rev.Biochem.,47:819-846(1978)；Wang等人,Tetrahedron Letters 31:6493-6496(1990)；Wang等人,Anal.Chem.67:1197-1203(1995)。

表1提供了可以與本發(fā)明的猝滅劑結(jié)合使用的示例性供體的非限制性列表。

表1

文獻中存在用于為具體的探針選擇合適的供體受體對的大量可用的實踐指導(dǎo)，例如以下參考文獻：Pesce等人編，熒光光譜(Fluorescence Spectroscopy)(Marcel Dekker,New York,1971)；White等人，熒光分析：實用方法(Fluorescence Analysis:A Practical Approach)(Marcel Dekker,New York,1970)；等。文獻也包括提供熒光分子和顯色分子的詳盡列表和它們用于選擇報告分子-猝滅劑對的光學(xué)性能的參考文獻(見例如Berlman，芳香族分子的熒光光譜手冊(Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules)，第二版(Academic Press,New York,1971)；Griffiths，有機分子的顏色與結(jié)構(gòu)(Colour and Constitution of Organic Molecules)(Academic Press,New York,1976)；Bishop編，指示劑(Indicators)(Pergamon Press,Oxford,1972)；Haugland，熒光探針和研究化學(xué)手冊(Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals)(Molecular Probes,Eugene,1992)；Pringsheim,熒光和磷光(Fluorescence and Phosphorescence)(Interscience Publishers,New York,1949)；等。而且，文獻中存在用于使通過可以加入核酸的常見的反應(yīng)基團共價連接的報告分子和猝滅劑分子衍生化的大量的指導(dǎo)，例如以下參考文獻：Haugland(如上)；Ullman等人，美國專利號3,996,345；Khanna等人，美國專利號4,351,760。因此，選擇用于具體應(yīng)用的能量交換對和使能量交換對的成員與探針分子例如核酸、肽或其他聚合物綴合都在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力之內(nèi)。

一般地，優(yōu)選的是猝滅劑的吸光譜帶基本上與供體的熒光發(fā)射譜帶重疊。當(dāng)供體(熒光團)是利用供體-受體能量轉(zhuǎn)移的探針的組分時，本發(fā)明的供體熒光部分和猝滅劑(受體)優(yōu)選被選擇為使得當(dāng)供體部分被激發(fā)時供體和受體部分表現(xiàn)出供體受體-能量轉(zhuǎn)移。在選擇熒光團-猝滅劑對時要考慮的一個因素是它們之間的供體-受體能量轉(zhuǎn)移的效率。優(yōu)選地，供體和受體部分之間的FRET效率是至少10％，更優(yōu)選為至少50％，甚至更優(yōu)選為至少80％。使用本文描述或本領(lǐng)域已知的方法可以容易地實證檢驗FRET的效率。

也可以通過改變供體和受體基團二聚化或緊密聯(lián)系的能力來調(diào)整供體-受體對之間的能量轉(zhuǎn)移效率。如果供體和受體部分是已知或被確定緊密聯(lián)合的，則通過調(diào)整供體和受體之間的接頭部分或探針本身的長度可以促進聯(lián)合的增加或減少。通過調(diào)整探針構(gòu)建體中的疏水相互作用或離子相互作用，或位阻排斥力，可以增加或減少供體-受體聯(lián)合的能力。因此，負責(zé)供體-受體對聯(lián)合的分子內(nèi)相互作用可以是增強或減弱的。因此例如，通過例如利用具有總負電荷的供體和具有總正電荷的受體，可以降低供體-受體對之間的聯(lián)合。

除了直接連接于探針的熒光團以外，也可通過間接方式連接熒光團。在該實施方式中，配體分子(例如生物素)通常共價結(jié)合于探針物質(zhì)。然后配體結(jié)合于另一種分子(例如鏈霉親和素分子)，其固有地可被檢測到或共價結(jié)合于信號體系，如熒光化合物或通過非熒光化合物的轉(zhuǎn)化產(chǎn)生熒光化合物的酶。作為標(biāo)記感興趣的有用的酶包括例如水解酶，具體是磷酸酶、酯酶和糖苷酶，水解酶、肽酶或氧化酶，具體是過氧化物酶。熒光化合物包括如上文討論的熒光素和其衍生物、若丹明和其衍生物、丹酰、傘形酮等。對于可以使用的各種標(biāo)記或信號產(chǎn)生系統(tǒng)的綜述見美國專利號4,391,904。

用于與本發(fā)明的猝滅劑結(jié)合使用的供體包括例如呫噸染料(包括熒光素)、花青染料和若丹明染料。這些化合物的許多合適形式是廣泛商業(yè)可獲得的，在它們的苯基部分具有取代基，所述取代基可以用作結(jié)合的位點或用作與核酸連接的結(jié)合官能性。與本發(fā)明的猝滅劑結(jié)合使用的熒光化合物的另一個基團是在α位或β位具有氨基的萘胺。包括在這樣的萘胺基化合物中的是1-二甲氨基萘基-5-磺酸酯、1-苯胺基-8-萘磺酸酯和2-對甲苯氨基(touidinyl)-6-萘磺酸酯。其他供體包括3-苯基-7-異氰酸基香豆素，吖啶如9-異硫氰酸酯吖啶和吖啶橙、N-(對-(2-苯并唑基)苯基)馬來酰亞胺；苯并二唑、茋、芘等。

為了清楚說明，下文的討論集中于使猝滅劑和熒光團與核酸連接。對核酸探針的關(guān)注并不意圖限制猝滅劑可以連接的探針分子的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員會領(lǐng)會猝滅劑也可以使用標(biāo)準(zhǔn)合成化學(xué)法連接于小分子、蛋白質(zhì)、肽、合成聚合物、固體支持物等。

在其中探針是核酸探針的示例性的實施方式中，熒光團是染料(Biosearch Technologies,Inc.)。熒光團優(yōu)選連接于核酸的3’-端或5’-端，雖然內(nèi)部位點也是可以進入的并且具有針對選擇的目的的實用性。無論熒光團連接于哪個末端，猝滅劑通常將連接于它的對映點，或核酸鏈的內(nèi)部的位置。優(yōu)選使用供體的亞酰胺衍生物引入供體基團?？晒┻x擇地，通過與在連接到核酸的栓鏈(tether)或接頭臂上的反應(yīng)性官能團(例如己胺)反應(yīng)，可以引入包括反應(yīng)性官能團(例如異硫氰酸酯、活性酯等)的供體基團。

在另一種優(yōu)選的實施方式中，可以通過使用衍生化的合成支持物在核酸的3’端連接供體部分。例如，使用以該熒光團(Biosearch Technologies,Inc.)的類似物衍生化的固體支持物將TAMRA(四甲基若丹明羧酸)連接于核酸的3’端。

考慮到涉及小分子與核酸綴合的文獻中良好發(fā)展的主體，將供體/受體對連接于核酸的許多其他方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。例如，在固相合成結(jié)束時，通過用亞磷酰胺部分衍生化的染料的方式將若丹明和熒光素染料便利地連接于核酸的5’-羥基(見例如Woo等人，美國專利號5,231,191；和Hobbs,Jr.，美國專利號4,997,928)。

更特別地，存在許多接頭部分和用于將基團連接于核酸的5’末端或3’末端的方法，例如通過以下的參考文獻例證的：Eckstein,編者，核酸和類似物：實用方法(Nucleic Acids and Analogues:A Practical Approach)(IRL Press,Oxford,1991)；Zuckerman等人,Nucleic Acids Research,15:5305-5321(1987)(核酸上的3’-硫醇基團)；Sharma等人,Nucleic Acids Research,19:3019(1991)(3’-巰基)；Giusti等人,PCR方法和應(yīng)用(PCR Methods and Applications),2:223-227(1993)和Fung等人，美國專利號4,757,141(5’-磷氨基基團，通過從P.E.Biosystems,CA.獲得的Aminolink TM II所得)。Stabinsky，美國專利號4,739,044(3-氨基烷基磷?；鶊F)；Agrawal等人,Tetrahedron Letters,31:1543-1546(1990)(通過磷酰胺鍵的連接)；Sproat等人,Nucleic Acids Research,15:4837(1987)(5-巰基)；Nelson等人,Nucleic Acids Research,17:7187-7194(1989)(3’-氨基)等。

檢測熒光標(biāo)記的手段對本領(lǐng)域技術(shù)人員是熟知的。因此，例如，可以通過用合適波長的光激發(fā)熒光團并檢測產(chǎn)生的熒光來檢測熒光標(biāo)記?？梢砸曈X地，通過膠片的手段，通過使用電子檢測器如電荷耦合裝置(CCD)或光子倍增器等檢測熒光。相似地，通過提供合適的用于酶的底物和檢測產(chǎn)生的反應(yīng)產(chǎn)物可以檢測酶標(biāo)記。

反應(yīng)性官能團

本發(fā)明的化合物的組分(例如接頭、核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸、載體分子和固體支持物)可以通過由第一反應(yīng)性官能團和第二反應(yīng)性官能團的反應(yīng)形成的鍵合位點連接。反應(yīng)性官能團具有互補反應(yīng)性，并且它們反應(yīng)以在化合物的兩種組分之間形成共價連接，本文中被稱為鍵合位點。例如，根據(jù)式(I)或(II)的化合物，其中R^x或R^s是可以與在另一種組分(如接頭、核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸、載體分子和固體支持物)上的互補反應(yīng)性的反應(yīng)性官能團反應(yīng)以通過所產(chǎn)生的鍵合位點共價連接組分的反應(yīng)性官能團?；パa反應(yīng)性的反應(yīng)性官能團可以位于其他組分(接頭、核苷等)的任何位置，例如烷基或雜烷基，芳基或雜芳基核心，或芳基或雜芳基核心上的取代基。在各種實施方式中，當(dāng)反應(yīng)基團連接于烷基(或雜烷基)，或取代的烷基(或雜烷基)鏈時，反應(yīng)性基團優(yōu)選位于鏈的末端位置。

用于實踐本發(fā)明的反應(yīng)性基團和反應(yīng)的類別在生物綴合物化學(xué)領(lǐng)域中通常是熟知的那些。目前，用本發(fā)明的低聚物的反應(yīng)性前體可得到的反應(yīng)的有利的類別是在相對溫和條件下進行的反應(yīng)。這些包括但不限于親核取代(胺和醇與?；u，活性酯的反應(yīng))、親電取代(例如烯胺反應(yīng))，以及碳碳和碳雜原子多重鍵的加成(例如邁克爾加成反應(yīng)、第爾斯-阿爾德加成反應(yīng))。例如March,高級有機化學(xué)(Advanced Organic Chemistry)，第三版，John Wiley和Sons,New York,1985；Hermanson,生物綴合物技術(shù)(Bioconjugate Techniques),Academic Press,San Diego,1996；以及Feeney等人,蛋白質(zhì)的修飾(Modification of Proteins)；化學(xué)系列的進展(Advances in Chemistry Series),Vol.198,美國化學(xué)學(xué)會,Washington,D.C.,1982中討論了這些和其他有用的反應(yīng)。

例如，本發(fā)明中使用的反應(yīng)性官能團包括但不限于烯烴、乙炔、醇、酚、醚、氧化物、鹵化物、醛、酮、羧酸、酯、酰胺、氰酸酯、異氰酸酯、硫氰酸酯、異硫氰酸酯、胺、肼、腙、酰肼、重氮基、重氮基、硝基、腈、硫醇、硫化物、二硫化物、亞砜、砜、磺酸、亞磺酸、縮醛、縮酮、酐、硫酸鹽、次磺酸異腈、脒、酰亞胺、亞氨酸酯、硝酮、羥胺、肟、異羥肟酸、硫代異羥肟酸、丙二烯、原酸酯、亞硫酸鹽、烯胺、炔胺、脲、假脲、氨基脲、碳化二亞胺、氨基甲酸酯、亞胺、疊氮化物、偶氮化合物、氧化偶氮化合物、和亞硝基化合物。反應(yīng)性官能團也包括用于制備生物綴合物的官能團，例如N-羥基琥珀酰亞胺酯、馬來酰亞胺等。用于制備每個這些官能團的方法是本領(lǐng)域熟知的，并且它們應(yīng)用于具體目的或出于具體目的修飾在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)(見例如Sandler和Karo編,有機官能團制備(ORGANIC FUNCTIONAL GROUP PREPARATIONS),Academic Press,San Diego,1989)。

有用的反應(yīng)性官能團轉(zhuǎn)化包括，例如：

(a)容易地轉(zhuǎn)化為各種衍生物的羧基基團，所述衍生物包括但不限于活性酯(例如N-羥基琥珀酰亞胺酯、N-羥基苯并三唑酯、硫酯、對-硝基苯酯)、?；u、?；溥?、烷基、鏈烯基、炔基和芳香族酯；

(b)羥基基團，其可以轉(zhuǎn)化為酯、醚、鹵化物、醛等；

(c)鹵代烷基基團，其中鹵化物隨后可以被親核基團例如胺、羧酸陰離子、硫醇陰離子、碳負離子或醇鹽離子取代，由此導(dǎo)致在鹵素原子的位置共價連接新基團；

(d)親二烯體基團，其能夠參與第爾斯-阿爾德反應(yīng)，例如馬來酰亞胺基基團；

(e)醛或酮基團，使得通過形成羰基衍生物，例如亞胺、腙、縮氨基脲或肟的后續(xù)衍生化，或通過如格利雅加成或烷基鋰加成這的機制的后續(xù)衍生化是可能的；

(f)磺酰鹵基團，用于與胺的后續(xù)反應(yīng)，例如形成磺胺；

(g)硫醇基，其可以例如轉(zhuǎn)化為二硫化物或與?；u反應(yīng)；

(h)胺或巰基基團，其可以例如被?；?、烷基化或氧化；

(i)烯，其可經(jīng)歷例如環(huán)加成、?；⑦~克爾加成等；

(j)環(huán)氧化物，其可與例如胺和羥基化合物反應(yīng)；以及

(k)亞磷酰胺和用于核酸合成的其他標(biāo)準(zhǔn)官能團。

選擇反應(yīng)性官能團，以便它們不參與或干擾對組裝本發(fā)明的低聚物必需的反應(yīng)。供選擇地，可以通過保護基團的存在保護反應(yīng)性官能團避免參與反應(yīng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解如何保護具體的官能團以便其不干擾選擇的一組反應(yīng)條件。有用的官能團的例子，參見例如Greene等人，有機體系中的保護基團(Protective Groups in Organic Synthesis),John Wiley和Sons,New York,1991。

共價鍵合部分

本發(fā)明的一些低聚物包括反應(yīng)性官能團部分，其能夠影響低聚物和靶序列之間的至少一個共價鍵。通過提供多個這樣的部分也可以形成多重共價鍵。共價鍵優(yōu)選用于靶鏈的核堿基殘基，也可以用其他部分的靶標(biāo)(包括糖或磷酸二酯)制成。影響交聯(lián)劑的部分的反應(yīng)性質(zhì)決定了雙螺旋中靶標(biāo)的性質(zhì)。優(yōu)選的交聯(lián)劑部分包括?；瘎┖屯榛瘎?，尤其是相對于提供序列特異性部分的位置定位的那些，以便允許與鏈中的靶位置反應(yīng)。

可以將交聯(lián)劑部分方便地置于低聚物序列中類似的嘧啶或嘌呤殘基位置。定位可以在5’-和/或3’-端、序列的內(nèi)部或以上的組合。優(yōu)選在末端位置的放置以使柔性提高。類似部分也可以連接到肽骨架。

用于本發(fā)明的烷基化部分的例子包括N⁴,N⁴-橋亞乙基胞嘧啶和N⁶,N⁶-橋亞乙基腺嘌呤。

很明顯核堿基不需要是嘌呤或嘧啶；事實上反應(yīng)功能連接的部分完全不需要是核堿基，而且可以是糖、接頭、猝滅劑、穩(wěn)定部分、熒光團或本發(fā)明的這些低聚物組分的一些組合。連接反應(yīng)性基團的任何手段只要位置是正確的就符合要求。

合成

通常照慣例合成本發(fā)明的化合物(如本發(fā)明的固體支持物、單體(例如亞磷酰胺)和低聚物或其片段)。見例如美國專利號7,019,129；美國專利號8,466,266和美國專利號7,879,986。本領(lǐng)域已知和本文描述的合成方法可用于使用適當(dāng)保護的核單體合成含有本發(fā)明的化合物的低聚物，以及本領(lǐng)域已知的其他堿基。用于合成低聚物的方法可見于，例如Froehler,B.,等人,Nucleic acids Res.(1986)14:5399-5467；Nucleic acids Res.(1988)16:4831-4839；nucleosides and nucleotides(1987)6:287-291；Froehler,B.,Tetrahedron Letters(1986)27:5575-5578；Caruthers,M.H.，基因表達的寡脫氧核苷酸-反義抑制(Oligodeoxynucleotides-Antisense Inhibitions of Gene Expression)(1989),J.S.Cohen,編者,CRC Press,Boca Raton,p7-24；Reese,C.B.等人,Tetrahedron Letters(1985)28:2245-2248。還描述了通過甲基亞磷酰胺化學(xué)結(jié)構(gòu)合成甲基膦酸酯連接的低聚物(Agrawal,S.等人,Tetrahedron Letters(1987)28:3539-3542；Klem,R.E.,等人,國際公開號WO 92/07864)。

圖2和實施例1中描述了本發(fā)明的各種化合物的示例性合成。

在示例性的實施方式中，使用標(biāo)準(zhǔn)合成條件和試劑，將核單體直接并入低聚物或其適當(dāng)?shù)钠?。通過該方法形成的示例性鍵包括磷酸二酯、硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、二硫代磷酸酯、碳酸酯、嗎啉代氨基甲酸酯和磺酸酯。

在各種實施方式中，合成涉及從適當(dāng)?shù)那绑w開始合成短合成子(二聚體、三聚體等)。該途徑適于合成包括以下的鍵，N-甲基羥胺、二甲基氫化偶氮、氨基磺酸酯、氨基甲酸酯、磺酸酯、磺胺、縮甲醛(formacetal)、硫代縮甲醛(thioformacetal)和碳酸酯。

本發(fā)明的低聚物可以通過任何合適的化學(xué)方法合成，包括亞酰胺、三酯或氫磷酸酯偶聯(lián)方法和條件。低聚物優(yōu)選從合適的起始合成子合成，所述起始合成子優(yōu)選在5’-位用DMT、MMT、FMOC(9-芴基甲氧基羰基)、PACO(苯氧基乙?；?，甲硅烷基醚如TBDMS(叔丁基二苯基甲硅烷基)或TMS(三甲基甲硅烷基)保護，并在3’-位激活為酯、H-磷酸酯、亞酰胺，如β-氰乙基亞磷酰胺，甲硅烷基醚如TBDMS或TMS或叔丁基二苯基。可供選擇地，合適的尿苷或胞苷前體如嵌段的5-碘代-2’-脫氧尿苷、5-碘代-2’-O-烷基尿苷、5-溴代-2’-脫氧尿苷、5-三氟甲烷磺酸酯-2’-脫氧尿苷、5-溴代-2’-O-烷基尿苷或嵌段的和受保護的5-碘代-2’-脫氧胞苷、5-溴代-2’-脫氧胞苷、5-三氟甲烷磺酸酯-2’-脫氧胞苷、5-碘代-2’-O-烷基胞苷、5-溴代-2’-O-烷基胞苷，可被方便地并入短的低聚物，如二聚體、三聚體、四聚體或五聚體或更長的合成子中，該短的低聚物隨后被衍生化以產(chǎn)生合適的合成子和更長的低聚物。

使用合成子如單體、二聚體或三聚體完成含有約4個或更多個核單體殘基的示例性低聚物的合成，所述合成子攜帶適于與亞酰胺、H-磷酸酯或三酯化學(xué)物質(zhì)使用的偶聯(lián)基團。合成子可用于通過磷酸二酯或含磷鍵而非磷酸二酯(例如硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、硫逐甲基膦酸酯、磷酰胺等)連接低聚物的組分。

其他含非磷的取代鍵的合成可以使用本領(lǐng)域已知的合適的前體完成。

一旦合成了希望的核酸，優(yōu)選從其合成和處理的固體支持物上通過本領(lǐng)域已知的方法裂解，以移除存在的任何保護基團(例如60℃，5h，濃氨)。在堿基敏感基團(例如TAMRA)連接于核酸的那些實施方式中，去保護優(yōu)選使用更溫和的條件(例如，丁胺:水1:3，8個小時，70℃)。通過使用快速去保護劑亞酰胺(例如dC-乙?；?、dG-dmf)促進在這些條件下的去保護。

從支持物裂解和去保護之后，通過本領(lǐng)域已知的任何方法純化核酸，所述方法包括色譜、萃取和凝膠純化。在優(yōu)選的實施方式中，使用HPLC純化核酸。優(yōu)選通過在分光光度計中測量260nm處的光密度來確定分離的核酸的濃度和純度。

本發(fā)明的測定和低聚物探針

在各種實施方式中，本發(fā)明提供了用于一種或多種測定形式的低聚物。在選擇的實施方式中，低聚物參與與其靶標(biāo)聯(lián)合或解離時可檢測信號的產(chǎn)生。本發(fā)明的低聚物探針不限于用于任何具體測定的形式。因此，下面的描述意圖說明本發(fā)明的低聚物可使用的示例性測定形式，而不意圖限制所述低聚物可使用的測定形式。

測定

下面的討論一般地與本文描述的測定相關(guān)。該討論意圖通過引用某些優(yōu)選的實施方式說明本發(fā)明，并且不應(yīng)被解釋為限制可使用本發(fā)明的化合物的探針和測定類型的范圍。利用本發(fā)明的化合物的其他測定形式對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。

通常，為確定靶分子例如未知量的核酸的濃度，優(yōu)選首先獲得參比數(shù)據(jù)，其中恒定量的探針與一定范圍內(nèi)的已知量的核酸標(biāo)準(zhǔn)品接觸。使用來自每個參比混合物的熒光發(fā)射強度以獲得圖像或標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中將未知濃度與已知標(biāo)準(zhǔn)品的強度比較。例如，以下的探針可用于獲得這樣的參比數(shù)據(jù)：a)與靶核酸內(nèi)的序列雜交；b)在5’-和3’-末端為標(biāo)記位點時具有熒光團和猝滅劑修飾；并且c)具有在未結(jié)合構(gòu)象中猝滅的熒光特性，然后在結(jié)合于靶核酸時釋放信號。這樣的探針提供了特征性的熒光發(fā)射，其中信號隨靶核酸濃度的增加而增加。然后，將未知量的靶標(biāo)樣品與探針接觸，確定來自混合物的熒光強度。然后與參比標(biāo)準(zhǔn)比較熒光發(fā)射的強度，以獲得測試混合物中的靶標(biāo)的濃度。

多重分析

在另一種實施方式中，利用本發(fā)明的固體支持物和低聚物作為用于檢測混合物中的一種或多種物質(zhì)的多重測定中的探針或一種或多種探針的組分。

在進行多重類型分析和測定中，基于本發(fā)明的固體支持物或低聚物的探針是尤其有用的。在典型的多重分析中，使用兩種或更多種探針檢測兩種或更多種不同的物質(zhì)(或一種或多種物質(zhì)的不同區(qū)域)，其中每種探針標(biāo)記了不同的熒光團。用于依賴供體受體能量轉(zhuǎn)移的多重分析的優(yōu)選物質(zhì)滿足至少兩個標(biāo)準(zhǔn)：熒光物質(zhì)是明亮的和光譜良好分辨的；并且熒光物質(zhì)和猝滅劑之間的能量轉(zhuǎn)移是有效的。

本發(fā)明的固體支持物和低聚物允許多重測定的設(shè)計，其中多于一種熒光報告分子(reporter)與一種或多種猝滅劑結(jié)構(gòu)配偶。使用本發(fā)明的固體支持物或低聚物的許多不同的多重測定對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。在一種示例性測定中，至少兩種不同的熒光報告分子與在它們各自的低聚物上的相同類型的猝滅劑結(jié)構(gòu)配對，以通過FRET或接觸猝滅調(diào)節(jié)信號。可供選擇地，可以實施測定，其中將至少兩種不同的熒光報告分子與不同的熒光特性更好地“匹配”的猝滅劑結(jié)構(gòu)配偶。熒光團可結(jié)合于與猝滅劑相同的分子或不同的分子。此外，與猝滅劑和熒光團相似，在具體的測定系統(tǒng)(如共價連接熒光團和猝滅劑的寡序列)中使用的載體分子可以是相同的或不同的。

除上面描述的混合物以外，本發(fā)明還提供了檢測具體的分子物質(zhì)存在的定性方法。該方法包括：(a)使所述物質(zhì)與含有本發(fā)明的固體支持物或低聚物的混合物接觸；以及(b)檢測產(chǎn)生的混合物的一種或多種組分的熒光特性的改變，以此檢測分子物質(zhì)的存在。

使用供體-受體能量轉(zhuǎn)移的兩種或更多種探針的同時使用是本領(lǐng)域已知的。例如，已經(jīng)描述了使用具有不同序列特異性的核酸探針的多重測定。熒光探針已經(jīng)用于確定個體是純合的野生型、純合的突變體或?qū)τ谔囟ㄍ蛔兪请s合的。例如，使用識別野生型序列的一種熒光素猝滅的分子信標(biāo)和識別突變等位基因的另一種若丹明猝滅的分子信標(biāo)，對個體進行針對β-趨化因子受體的基因型分型是可能的(Kostrikis等人.Science 279:1228-1229(1998))。僅熒光素信號存在說明個體是野生型，僅若丹明信號存在說明個體是純合的突變體。若丹明和熒光素信號二者均存在是雜合子的特征。Tyagi等人.Nature Biotechnology 16:49-53(1998)描述了四種不同標(biāo)記的分子信標(biāo)同時用于辨別等位基因，以及Lee等人,BioTechniques 27:342-349(1999)描述了對六種PCR產(chǎn)物的七種顏色的同源檢測。

本發(fā)明的猝滅劑可以用于多重測定，所述多重測定被設(shè)計為檢測和/或定量基本上任何物質(zhì)，包括例如全細胞、病毒、蛋白質(zhì)(例如酶、抗體、受體)、糖蛋白、脂蛋白、亞細胞顆粒、生物體(例如沙門氏菌)、核酸(例如DNA、RNA和其類似物)、多糖、脂多糖、脂質(zhì)、脂肪酸、非生物聚合物和小分子(例如毒素、藥物、殺蟲劑、代謝物、激素、生物堿、類固醇)。

核酸探針

本發(fā)明的固體支持物和低聚物是有用的核酸探針，并且他們可以用作各種DNA擴增/定量策略的檢測劑的組分，所述DNA擴增/定量策略包括例如5’-核酸酶測定、鏈置換擴增(SDA)、基于核酸序列的擴增(NASBA)、滾環(huán)擴增(RCA)；以及用于對溶液相或固相(例如陣列)測定中的靶標(biāo)的直接檢測。此外，固體支持物和低聚物可以用于基本上任何形式的探針，包括例如選自分子信標(biāo)、Scorpion探針^TM、Sunrise探針^TM、構(gòu)象輔助探針、發(fā)光探針、入侵者檢測探針(Invader Detection probes)和TaqMan^TM探針的形式。見例如，Cardullo,R.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:8790-8794(1988)；Dexter,D.L.,J.Chem.Physics,21:836-850(1953)；Hochstrasser,R.A.等人,Biophysical Chemistry,45:133-141(1992)；Selvin,P.,Methods in Enzymology,246:300-334(1995)；Steinberg,I.,Ann.Rev.Biochem.,40:83-114(1971)；Stryer,L.,Ann.Rev.Biochem.,47:819-846(1978)；Wang,G.等人,Tetrahedron Letters,31:6493-6496(1990)；Wang,Y.等人,Anal.Chem.,67:1197-1203(1995)；Debouck,C.等人,nature genetics增刊,21:48-50(1999)；Rehman,F.N.等人,Nucleic Acids Research,27:649-655(1999)；Cooper,J.P.等人,Biochemistry,29:9261-9268(1990)；Gibson,E.M.等人,Genome Methods,6:995-1001(1996)；Hochstrasser,R.A.等人,Biophysical Chemistry,45:133-141(1992)；Holland,P.M.等人,Proc Natl.Acad.Sci USA,88:7276-7289(1991)；Lee,L.G.等人,Nucleic Acids Rsch.,21:3761-3766(1993)；Livak,K.J.等人,PCR Methods and Applications,Cold Spring Harbor Press(1995)；Vamosi,G.等人,Biophysical Journal,71:972-994(1996)；Wittwer,C.T.等人,Biotechniques,22:176-181(1997)；Wittwer,C.T.等人,Biotechniques,22:130-38(1997)；Giesendorf,B.A.J.等人,Clinical Chemistry,44:482-486(1998)；Kostrikis,L.G.等人,Science,279:1228-1229(1998)；Matsuo,T.,Biochemica et Biophysica Acta,1379:178-184(1998)；Piatek,A.S.等人,Nature Biotechnology,16:359-363(1998)；Schofield,P.等人,Appl.Environ.Microbiology,63:1143-1147(1997)；Tyagi S.等人,Nature Biotechnology,16:49-53(1998)；Tyagi,S.等人,Nature Biotechnology,14:303-308(1996)；Nazarenko,I.A.等人,Nucleic Acids Research,25:2516-2521(1997)；Uehara,H.等人,Biotechniques,26:552-558(1999)；D.Whitcombe等人,Nature Biotechnology,17:804-807(1999)；Lyamichev,V.等人,Nature Biotechnology,17:292(1999)；Daubendiek等人,Nature Biotechnology,15:273-277(1997)；Lizardi,P.M.等人,Nature Genetics,19:225-232(1998)；Walker,G.等人,Nucleic Acids Res.,20:1691-1696(1992)；Walker,G.T.等人,Clinical Chemistry,42:9-13(1996)；以及Compton,J.,Nature,350:91-92(1991)。

因此，本發(fā)明提供了用于檢測核酸靶序列的方法。所述方法包括：(a)使靶序列與檢測核酸(例如本發(fā)明的低聚物)接觸；(b)使靶結(jié)合序列與靶序列雜交，由此改變檢測核酸的構(gòu)象，引起熒光參數(shù)的改變；以及(c)檢測熒光參數(shù)的變化，由此檢測核酸靶序列。

除非另外注明，在本文描述的方法中，優(yōu)選的檢測核酸包括單鏈靶結(jié)合序列。結(jié)合序列連接于：i)熒光團；和ii)猝滅劑。結(jié)合序列具有任選地進一步連接于其的穩(wěn)定部分。此外，在檢測核酸與互補序列雜交之前，該檢測核酸優(yōu)選為在熒光團被激發(fā)時允許熒光團和猝滅劑之間進行供體-受體能量轉(zhuǎn)移的構(gòu)象。此外，在該部分描述的每種方法中，檢測熒光的改變作為靶序列存在的指示。優(yōu)選實時檢測熒光的改變。

目前優(yōu)選的核酸探針不要求核酸采用用于探針的二級結(jié)構(gòu)以起作用。在該方法中，并且除非另外注明，在該部分描述的其他方法中，檢測核酸可假定基本上任何分子內(nèi)相關(guān)的二級結(jié)構(gòu)，但該結(jié)構(gòu)優(yōu)選是選自發(fā)夾、莖環(huán)結(jié)構(gòu)、假結(jié)、三股螺旋和構(gòu)象輔助結(jié)構(gòu)的成員。此外，分子內(nèi)堿基配對的二級結(jié)構(gòu)優(yōu)選包括靶結(jié)合序列的部分。

在另一方面，本發(fā)明提供了用于檢測靶序列的擴增的方法。該方法涉及使用擴增反應(yīng)如PCR。示例性擴增反應(yīng)包括一個或多個以下的步驟：

(a)使包括感興趣的靶序列的樣品核酸與在靶序列側(cè)翼的PCR引物雜交；

(b)用聚合酶延伸雜交的引物以產(chǎn)生PCR產(chǎn)物，并使PCR產(chǎn)物的兩條鏈分離以使靶序列的有義鏈和反義鏈可進入；

(c)使檢測核酸與PCR產(chǎn)物中的靶序列的有義鏈或反義鏈雜交，由此改變檢測核酸的構(gòu)象(例如使有助于猝滅效率的任何二級結(jié)構(gòu)或無規(guī)卷曲構(gòu)象線性化)，引起熒光參數(shù)的改變(如信號強度)，其中檢測核酸包括：

i)單鏈靶結(jié)合序列，其與PCR產(chǎn)物中的靶序列的有義鏈或反義鏈的至少一個部分互補并與PCR引物之間的區(qū)域雜交；

ii)熒光團；以及

iii)本發(fā)明的猝滅劑；

其中在檢測核酸與靶序列雜交之前，該檢測核酸優(yōu)選是在熒光團被激發(fā)時允許熒光團和猝滅劑之間進行供體-受體能量轉(zhuǎn)移的構(gòu)象；以及

(d)測量熒光參數(shù)的改變以檢測靶序列和其擴增。

任選地，如果在引物延伸期間(上文步驟(b))聚合酶遇到雜交的檢測核酸，并且使連接了熒光團和猝滅劑的低聚物水解(如通過聚合酶的二級核酸酶活性)，則可以使熒光參數(shù)的變化恒定。

在進一步的方面，本發(fā)明提供了確定第一核酸和第二核酸是否雜交的方法。在該方法中，第一核酸是根據(jù)本發(fā)明的低聚物(在溶液中或結(jié)合于固體支持物)。該方法包括：(a)使第一核酸與第二核酸接觸；(b)檢測選自第一核酸、第二核酸和其組合的成員的熒光特性的改變，由此確定雜交是否發(fā)生。

在各種實施方式中，本發(fā)明提供了用于檢測核酸靶序列的多態(tài)性的探針和方法。多態(tài)性是指種群中兩種或更多種基因決定的替代序列或等位基因的發(fā)生。多態(tài)性標(biāo)記或位點是發(fā)生趨異(divergence)的基因座。優(yōu)選的標(biāo)記具有至少兩種等位基因，每種以選擇的群中大于1％的頻率，更優(yōu)選大于10％或20％的頻率發(fā)生。多態(tài)性基因座可以小至1個堿基對。多態(tài)性標(biāo)記包括限制性片段長度多態(tài)性、可變數(shù)量的串聯(lián)重復(fù)序列(VNTR)、高變區(qū)、微衛(wèi)星(minisatellite)、雙核苷酸重復(fù)、三核苷酸重復(fù)、四核苷酸重復(fù)、簡單序列重復(fù)和插入元件如Alu。首先鑒別的等位基因形式被任意地指定為參比形式，其他等位基因形式被指定為替代的或變異等位基因。在選擇的種群中最頻繁發(fā)生的等位基因形式有時被稱為野生型形式。二倍體生物體可以是對等位基因形式的純合的或雜合的。雙等位基因多態(tài)性具有兩種形式。三等位基因多態(tài)性具有三種形式。

在示例性的實施方式中，本發(fā)明的探針用于檢測單核苷酸多態(tài)性。單核苷酸多態(tài)性發(fā)生于由單個核苷酸所占據(jù)的多態(tài)性位點，所述多態(tài)性位點是等位基因序列之間的變異的位點。所述位點常常在等位基因的高度保守序列(例如在種群中少于1/100或1/1000的成員變異的序列)之前和之后。通常由于在多態(tài)性位點處的一種核苷酸被另一種核苷酸置換，導(dǎo)致單核苷酸多態(tài)性出現(xiàn)。轉(zhuǎn)換是一種嘌呤被另一種嘌呤取代，或一種嘧啶被另一種嘧啶取代。顛換是嘌呤被嘧啶取代或嘧啶被嘌呤取代。單核苷酸多態(tài)性也可以相對于參比等位基因的核苷酸缺失或核苷酸插入而發(fā)生。

可以使用具有猝滅劑和熒光團二者的本發(fā)明的低聚物，或可供選擇地，可以用能量轉(zhuǎn)移對的單個成員(例如猝滅劑或熒光團)單獨地標(biāo)記一種或多種核酸。當(dāng)用猝滅劑單獨標(biāo)記的核酸是探針時，可以通過觀察猝滅劑和核酸之間的相互作用，或更優(yōu)選地觀察猝滅劑對連接于第二核酸的熒光團的熒光的猝滅，來檢測第一核酸和第二核酸之間的相互作用。

在一些實施方式中，形成了本發(fā)明的猝滅劑和熒光團之間的基態(tài)復(fù)合體。在示例性的實施方式中，猝滅劑和熒光團二者綴合于相同的核酸低聚物。

除了設(shè)計為研究核酸擴增、多態(tài)性、檢測和定量的一般用途，本發(fā)明的固體支持物和低聚物可以用于目前已知或后來發(fā)現(xiàn)的基本上任何核酸探針形式。例如，本發(fā)明的固體支持物和低聚物可以并入探針基序，如Taqman^TM探針(Held等人,Genome Res.6:986-994(1996)；Holland等人,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 88:7276-7280(1991)；Lee等人,Nucleic Acids Res.21:3761-3766(1993))、分子信標(biāo)(Tyagi等人,Nature Biotechnology 14:303-308(1996)；Jayasena等人,美國專利號5,989,823,發(fā)布于1999年9月23日)、蝎子探針(scorpion probes)(Whitcomb等人,Nature Biotechnology 17:804-807(1999))、日出探針(sunrise probes)(Nazarenko等人,Nucleic Acids Res.25:2516-2521(1997))、構(gòu)象輔助探針(Cook,R.,同時待審和共同轉(zhuǎn)讓的美國專利申請2007/0059752,提交于1999年6月9日)、基于肽核酸(PNA)的發(fā)光探針(Kubista等人,WO 97/45539,1997年12月)、雙鏈特異性DNA染料(Higuchi等人,Bio/Technology 10:413-417(1992)；Wittwer等人,BioTechniques 22:130-138(1997))等。非同位素DNA探針技術(shù)(Nonisotopic DNA Probe Techniques),Academic Press,Inc.1992中綜述了可以使用本發(fā)明的猝滅劑的這些探針基序和其他探針基序。

用于本發(fā)明的探針的低聚物可以是任何適當(dāng)?shù)拇笮?，并且?yōu)選為約2～約100個核苷酸，更優(yōu)選為約10～80個核苷酸，還更優(yōu)選為約10～約40個核苷酸。在雙標(biāo)記(熒光團-猝滅劑)探針中，供體部分優(yōu)選是從猝滅劑分離至少約6個核苷酸，優(yōu)選至少約8個核苷酸，優(yōu)選至少10個核苷酸，和更優(yōu)選至少約15個核苷酸。在各種實施方式中，供體部分優(yōu)選連接于探針的3’-端核苷酸或5’-端核苷酸。猝滅劑部分也優(yōu)選連接于探針的3’-端核苷酸或5’-端核苷酸。更優(yōu)選地，供體和受體部分分別連接于探針的3’-端核苷酸和5’端核苷酸，雖然在內(nèi)部放置也是有效的。

本發(fā)明的核酸探針的精確序列和長度部分取決于其結(jié)合的靶多核苷酸的性質(zhì)。結(jié)合位置和長度可以改變以獲得對具體實施方式的退火和解鏈特性。在許多本領(lǐng)域公認的參考文獻中可以發(fā)現(xiàn)進行這樣的設(shè)計選擇的指導(dǎo)。

在一些實施方式中，核酸探針的3’-端核苷酸是封閉的或呈現(xiàn)出不能通過核酸聚合酶延伸。通過將供體或受體部分與核酸探針的末端3’-位直接連接或通過接頭部分連接，可以方便地進行這樣的封閉。

核酸可包括DNA、RNA或其嵌合混合物或衍生物或修飾的形式。探針和靶核酸二者都可以作為單鏈、雙螺旋或三螺旋等的形式存在。此外，可以在核堿基部分、糖部分或磷酸骨架處用其他基團修飾核酸，所述其它基團如放射性標(biāo)記、小溝結(jié)合劑、插入劑、乙酰類不飽和烴(acetylinically unsaturated hydrocarbons)、氟烷基、供體部分和/或受體部分等。

本發(fā)明的低聚物用作是離散序列的引物，或用作具有隨機序列的引物。隨機序列引物通常長度為約6或7個核單體。這樣的引物可以用于各種核酸擴增方案(PCR、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等)或用于克隆方案。在本發(fā)明的5’-端上的置換通常不干擾低聚物起引物作用的能力。具有不是3’-末端殘基的位點處的2’-修飾，使低聚物核糖核酸酶H無能力或反之使核酸酶穩(wěn)定的本發(fā)明的低聚物可以有利地用作含有核酸酶的細胞提取物或其他溶液中的RNA或DNA序列的探針或引物。因此，低聚物可以用于通過以下方法在樣品中擴增核酸的方案：即通過將低聚物與含有靶核酸的樣品混合，然后使低聚物與靶核酸雜交，并通過PCR、LCR或其他適當(dāng)?shù)姆椒〝U增靶核酸。

用螯合劑如EDTA、DTPA或1,2-環(huán)己二胺乙酸的類似物衍生化的低聚物可用于各種體外診斷測定，如(美國專利號4,772,548、4,707,440和4,707,352)所述?？晒┻x擇地，本發(fā)明的低聚物可以用交聯(lián)劑如5-(3-碘代乙酰氨基丙-1-基)-2’-脫氧尿苷或5-(3-(4-溴代丁酰胺基)丙-1-基)-2’-脫氧尿苷衍生化，并用于各種測定方法或試劑盒，如(國際公開號WO 90/14353)所述。

除上述的用途以外，通過用任何適當(dāng)?shù)姆椒y量受試細胞或重組系統(tǒng)中的表達水平，可以在體外系統(tǒng)中證實低聚物抑制基因表達的能力。(Graessmann,M.,等人,Nucleic Acids Res.(1991)19:53-59)。

本領(lǐng)域技術(shù)人員可以憑經(jīng)驗確定利于本發(fā)明的低聚物和靶核酸分子之間雜交的條件，所述條件可以包括最佳的溫育溫度、鹽濃度、寡核苷酸類似物探針的長度和和堿基組成，以及樣品中低聚物和核酸分子的濃度。優(yōu)選地，雜交在至少1毫摩爾鎂的存在下和在高于6.0的pH下進行。在一些實施方式中，可能需要或希望處理樣品以使樣品中的核酸分子在雜交前為單鏈。這樣的處理的例子包括但不限于用堿處理(優(yōu)選隨后中和)、在高溫下溫育或用核酸酶處理。

另外，因為與核酸雜交的鹽依賴性主要由雜交寡核苷酸類似物的骨架的電荷密度決定，因此將非標(biāo)準(zhǔn)核苷酸類似物摻入本發(fā)明的低聚物中可以提高或降低雜交的鹽依賴性。該調(diào)節(jié)可以用于使本發(fā)明的方法有優(yōu)勢，其中在某些方面該優(yōu)勢對能夠例如通過改變鹽條件提高雜交的嚴格性或通過減少鹽濃度釋放雜交的核酸可以是希望的。在本發(fā)明的其他方面，在非常低的鹽中使本發(fā)明的寡核苷酸類似物與核酸的高親和性結(jié)合可以是希望的。在這種情況下，使具有無電荷的骨架部分的核苷酸單體定位于本發(fā)明的寡核苷酸內(nèi)是有利的。

本發(fā)明的低聚物與靶核酸分子結(jié)合的高度特異性允許從業(yè)者選擇可以有利于區(qū)別核酸序列和靶核酸分子的雜交條件，所述核酸序列包括與一種或多種低聚體的至少一個部分完全互補的一段序列，所述靶核酸分子包括在基本上互補的序列內(nèi)含有少數(shù)非互補堿基的一段序列。例如，雜交或洗滌溫度可以選擇為允許本發(fā)明的低聚物與沿一段序列完全互補的靶核酸分子之間的穩(wěn)定雜交體，但促進本發(fā)明的低聚物與不完全互補的靶核酸分子(包括沿一段互補序列含有一個或兩個堿基錯配的那些靶核酸分子)之間的雜交體解離。雜交溫度和洗滌溫度的選擇可以是至少部分地依賴于其他條件，如鹽濃度、低聚物和靶核酸分子的濃度、低聚物與靶核酸分子的相對比例、要雜交的低聚物的長度、低聚物和靶核酸分子的核堿基組成、寡核苷酸類似物分子的單體組成等。此外，當(dāng)選擇利于完全互補分子的穩(wěn)定雜交體，而不利于一個或多個核堿基錯配的低聚物和靶核酸分子之間的穩(wěn)定雜交體的條件時，可以考慮額外的條件，并且，需要時改變該額外條件，包括但不限于要雜交的寡核苷酸類似物的長度、低聚物和靶核酸分子之間的一段互補性序列的長度、該段互補性序列內(nèi)的非互補核堿基的數(shù)量、錯配核堿基的同一性、錯配核堿基附近的核堿基的同一性以及任何沿一段互補序列錯配的核堿基的相對位置。核酸雜交領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠根據(jù)具體的應(yīng)用，確定在使用本發(fā)明的低聚物與靶核酸分子雜交中的有利的雜交和洗滌條件。“有利的條件”可以是有利于低聚物和靶核酸分子之間形成穩(wěn)定雜交體的條件，所述穩(wěn)定雜交體至少部分是基本上互補的，包括包含一個或多個錯配的那些雜交體。

“有利的條件”可以是有利于低聚物和靶核酸分子之間形成穩(wěn)定的雜交體而不利于不完全互補的分子之間形成雜交體或在不完全互補的分子之間形成不穩(wěn)定的雜交體的條件，所述穩(wěn)定雜交體至少部分是完全互補的。

使用如本文公開的方法，與不同序列的靶核酸分子雜交的本發(fā)明的低聚物的解鏈溫度可以被確定，并且可以用于確定針對給定應(yīng)用的有利條件。通過例如將靶核酸分子與結(jié)合于固體支持物的低聚物雜交和檢測雜交的復(fù)合體，也可能憑經(jīng)驗確定有利雜交條件。

通過低聚物探針與固體支持物的直接或間接結(jié)合，可以方便地并有效地將結(jié)合于本發(fā)明的固體支持物或低聚物探針的靶核酸分子從調(diào)查群體的未結(jié)合的核酸分子中分離?？梢栽诟邍栏裥詶l件下洗滌固體支持物以移除未結(jié)合于低聚物探針的核酸分子。然而，低聚物探針與固體支持物的結(jié)合不是本發(fā)明的要求。例如，在某些應(yīng)用中，通過穿過基質(zhì)的離心或通過相分離或某些通過其他形式的分離(例如示差沉淀)可以分離結(jié)合的和未結(jié)合的核酸分子，所述其他形式的分離可任選地通過并入低聚物探針的化學(xué)基團輔助(見例如，2000年5月9日授予Nie等人的美國專利號6,060,242)

核酸捕獲探針

在一種實施方式中，包括猝滅劑的固定化核酸用作捕獲探針。固定化核酸任選地進一步包括穩(wěn)定部分。核酸探針可以直接結(jié)合于固體支持物，例如通過探針的3’末端核苷酸或5’末端核苷酸與固體支持物結(jié)合。然而，更優(yōu)選地，探針通過接頭(如上文)結(jié)合于固體支持物。接頭用于探針與固體支持物的距離。接頭的長度最優(yōu)選為約5～約30個原子，更優(yōu)選為約10～約50個原子。

在各種實施方式中，固體支持物還用作在制備低聚物(探針)中的合成支持物。固體支持物和核酸的第一個3’單位之間的接頭的長度和化學(xué)穩(wěn)定性在支持物結(jié)合的核酸的有效合成和雜交中起重要作用。接頭臂優(yōu)選足夠長以便在自動合成期間可以獲得高收率(>97％)。需要的接頭的長度將取決于具體使用的固體支持物。例如，當(dāng)高交聯(lián)聚苯乙烯用作固體支持物時，6個原子的接頭通常足以在核酸的自動合成期間獲得97％的收率。當(dāng)CPG用作固體支持物時，接頭臂優(yōu)選為至少20個原子長以在自動合成期間獲得高收率(>97％)。

固體支持物上固定的探針的雜交通常要求探針通過至少30個原子，優(yōu)選至少50個原子與固體支持物分離。為了獲得這種分離，接頭通常包括位于接頭和3’端之間的間隔區(qū)。對于核酸合成，接頭臂常常通過酯鍵與3’端的3’-OH連接，所述酯鍵可以用堿試劑裂解以使核酸從固體支持物釋放。

各種各樣的接頭是本領(lǐng)域已知的，其可用于將核酸探針結(jié)合于固體支持物。接頭可以由任何化合物形成，所述化合物不顯著干擾靶序列與結(jié)合于固體支持物的探針的雜交。接頭可以由例如同聚核酸(homopolymeric nucleic acid)形成，所述同聚核酸通過自動合成可容易地被插入接頭上?？晒┻x擇地，聚合物如官能化的聚乙二醇可以用作接頭。當(dāng)前相對于同聚核酸，優(yōu)選這樣的聚合物，因為它們不顯著干擾探針與靶核酸的雜交。聚乙二醇是尤其優(yōu)選的，因為它是商業(yè)可獲得的，可溶于有機介質(zhì)和含水介質(zhì)兩者，易于官能化，并且在核酸合成條件和合成后條件下是完全穩(wěn)定的。

在高溫下在堿性條件下合成或移除核堿基保護基團的過程中，固體支持物、接頭和探針之間的鍵合位點優(yōu)選不被裂解。然而，這些鍵可以選自在各種條件下可裂解的基團。當(dāng)前優(yōu)選的鍵的例子包括氨基甲酸酯、酯和酰胺鍵。

樣品中核酸的檢測

本發(fā)明的固體支持物和低聚物可用于檢測核酸。這樣的檢測方法包括：提供樣品，在允許低聚物與核酸分子雜交的條件下使至少一種本發(fā)明的寡核苷酸類似物與樣品接觸，以及檢測樣品的已經(jīng)與本發(fā)明的一種或多種低聚物雜交的一種或多種核酸分子。

樣品可以來自任何來源，并且可以是生物樣品，如來自一種有機體或來自一組有機體的樣品，所述一組有機體來自相同的或不同的物種。生物樣品可以是體液樣品，例如血液樣品、血清樣品、淋巴液樣品、骨髓樣品、腹水、胸水、骨盆洗液、眼內(nèi)液、尿液、精液、痰液或唾液。生物樣品也可以是來自皮膚、鼻、喉和生殖拭樣(genital swab)的提取物，或糞便物的提取物。生物樣品也可以是器官或組織(包括腫瘤)的樣品。生物樣品也可以是細胞培養(yǎng)物的樣品，所述細胞培養(yǎng)物包括原核細胞和真核細胞兩者的細胞系和原代培養(yǎng)物兩者。

樣品可以來自環(huán)境，如來自水體或來自土壤，或來自食品、飲料或水源，來自工業(yè)源、工作區(qū)、公共區(qū)或生活區(qū)。樣品可以是提取物，例如土壤或食品樣品的液體提取物。樣品可以是通過洗滌或浸泡或懸浮拭樣制成的溶液，所述拭樣來自如工具的物品，如衣物、人工制品或其他物體的物品。

樣品可以是未加工或加工的樣品；加工可以涉及增加樣品的組分的純度、濃度或可進入性的步驟以促進樣品的分析。作為非限制性實例，加工可以包括以下步驟：減少樣品的體積，移除或分離樣品的組分、使樣品或一種或多種樣品組分溶解或破壞、修飾、暴露、釋放或分離樣品的組分。這樣的步驟的非限制性的例子是離心、沉淀、過濾、均化、細胞裂解、抗體結(jié)合、細胞分離等。例如，在本發(fā)明的一些優(yōu)選的實施方式中，樣品是至少部分加工的血液樣品，例如，通過移除紅細胞，通過濃縮，通過選擇一種或多種細胞或病毒(例如，白細胞或病原細胞)，或通過細胞的裂解等。

示例性的樣品包括至少部分純化的核酸分子的溶液。核酸分子可以來自單個來源或多個來源，并且可以包括DNA、RNA或兩者。例如，核酸分子的溶液可以是以下樣品，即所述樣品經(jīng)歷了任何的以下步驟：細胞裂解、濃縮、提取、沉淀、核酸選擇(例如聚A RNA選擇或包括Alu元件的DNA序列的選擇)或用一種或多種酶處理。樣品可以是包括合成核酸分子的溶液。

本發(fā)明的低聚物或固體支持物可以是本文公開的任何低聚物形式，或包括本文公開的單體、二聚體或非核酸組分(例如接頭、熒光團、猝滅劑、穩(wěn)定部分)的任何低聚物。用于本發(fā)明的方法的寡核苷酸類似物可以具有任何長度和任何核堿基組成，并且可以包括一種或多種核酸部分、肽、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖類、類固醇和其他生物化學(xué)和化學(xué)部分。本發(fā)明的寡核苷酸類似物可以在溶液中提供或結(jié)合于固體支持物。在本發(fā)明的某些優(yōu)選實施方式中，低聚物包括非標(biāo)準(zhǔn)核苷酸類似物。

用于結(jié)合的核酸的檢測方法是本領(lǐng)域熟知的，并且可以包括可檢測標(biāo)記的使用，所述標(biāo)記連接于或摻入調(diào)查種群的核酸分子，或適合結(jié)合于或摻入雜交的靶核酸分子或雜交的靶核酸分子復(fù)合體。用于核酸分子的可檢測標(biāo)記是本領(lǐng)域熟知的，包括熒光分子如熒光團(包括本文描述的熒光團)、放射性同位素、質(zhì)量改變的化學(xué)基團、特異性結(jié)合成員如可通過產(chǎn)生信號的分子檢測的生物素等。可檢測標(biāo)記也可以摻入或連接于本發(fā)明的低聚物，例如，在使用信號低聚物的夾心雜交用于檢測的情況下，或使用特異性結(jié)合成員如識別低聚物/靶核酸分子復(fù)合體的抗體進行檢測的情況下?？梢詫⒐腆w支持物掃描，曝光于膠片，目測觀察等，以確定可檢測標(biāo)記的存在，并由此確定靶核酸分子與固定于固體支持物上的低聚物的結(jié)合，如本發(fā)明的那些。

試劑盒

本發(fā)明的一個方面是試劑盒的配制，所述試劑盒促進使用本發(fā)明的化合物(如本發(fā)明的固體支持物或本發(fā)明的單體)的合成的實踐和使用本發(fā)明的低聚物的測定的實踐，如上所述。本發(fā)明的試劑盒典型地包括本發(fā)明的化合物(如本發(fā)明的固體支持物或本發(fā)明的低聚物)，該試劑盒呈現(xiàn)為用于制備綴合物的化學(xué)反應(yīng)性物質(zhì)或呈現(xiàn)為完整的低聚物，其中低聚物是特異性結(jié)合對成員。試劑盒任選地進一步包括一種或多種緩沖劑，典型地呈現(xiàn)為水溶液。本發(fā)明的試劑盒任選地進一步包括額外的檢測試劑，用于純化產(chǎn)生的標(biāo)記物質(zhì)的純化介質(zhì)、熒光標(biāo)準(zhǔn)品、酶、酶抑制劑、有機溶劑或用于進行本發(fā)明的測定的說明。試劑盒的其他形式對本領(lǐng)域技術(shù)人員會是顯而易見的，并且在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

作為總結(jié)，在示例性實施方式中，本發(fā)明提供了：

具有根據(jù)式I或式II的結(jié)構(gòu)的化合物：

R^1a、R^1b、R^7a和R^7b獨立地選自H、取代的或未被取代的烷基、取代的或未被取代的環(huán)烷基、取代的或未被取代的雜烷基和取代的或未被取代的雜環(huán)烷基。R^1a和R^1b與它們所連接的碳原子任選地連接在一起以形成環(huán)，所述環(huán)是選自以下的成員：取代的或未被取代的C₃-C₇環(huán)烷基和取代的或未被取代的3元至7元雜環(huán)烷基。R^7a和R^7b連同它們所連接的碳原子任選地連接在一起以形成環(huán)，所述環(huán)是選自以下的成員：取代的或未被取代的C₃-C₇環(huán)烷基和取代的或未被取代的3元至7元雜環(huán)烷基。R^1a、R^1b、R^7a和R^7b中的至少一個不是H。R⁸選自H、L^x選自鍵、取代的或未被取代的烷基、取代的或未被取代的環(huán)烷基、取代的或未被取代的雜烷基和取代的或未被取代的雜環(huán)烷基。L^xs選自取代的或未被取代的烷基、取代的或未被取代的環(huán)烷基、取代的或未被取代的雜烷基和取代的或未被取代的雜環(huán)烷基。R^s選自保護或未保護的反應(yīng)性官能團、鍵合位點和固體支持物。R^x選自保護或未保護的反應(yīng)性官能團和鍵合位點。每個鍵合位點共價結(jié)合于獨立地選自以下的成員：核苷、核苷的接頭、核苷酸、核苷酸的接頭、寡核苷酸、寡核苷酸的接頭、核酸、核酸的接頭、載體分子、載體分子的接頭、固體支持物和固體支持物的接頭。

根據(jù)前述段落的化合物，其中R^1a和R^1b獨立地選自未被取代的C₁、C₂、C₃、C₄、C₅和C₆烷基。

根據(jù)前述段落的化合物，其中R^1a和R^1b各自是甲基。

根據(jù)前述任一段落的化合物，其中R^7a和R^7b各自是H。

根據(jù)前述任一段落的化合物，其中R^7a和R^7b獨立地選自未被取代的C₁、C₂、C₃、C₄、C₅和C₆烷基。

根據(jù)前述任一段落的化合物，其中R^7a和R^7b各自是甲基。

根據(jù)前述任一段落的化合物，其中R^1a和R^1b各自是H。

根據(jù)前述任一段落的化合物，其中R^1a、R^1b、R^7a和R^7b獨立地選自未被取代的C₁、C₂、C₃、C₄、C₅和C₆烷基。

根據(jù)前述任一段落的化合物，其中R^1a、R^1b、R^7a和R^7b各自是甲基。

根據(jù)前述任一段落的化合物，其中L^x選自未被取代的C₁、C₂、C₃、C₄、C₅、C₆、C₇、C₈、C₉和C₁₀烷基。

根據(jù)前述任一段落的化合物，其中L^xs是取代的雜烷基。

根據(jù)前述任一段落的化合物，其中R^x選自亞磷酰胺、-OH、-ODMT、-COOH、活性酯和-NH₂。

根據(jù)前述任一段落的化合物，其中R^s選自-OH、-ODMT和共價結(jié)合于固體支持物的接頭的鍵合位點。

根據(jù)前述任一段落的化合物，其中R^x選自亞磷酰胺、-OH、-ODMT、-COOH、活性酯和-NH₂。

根據(jù)前述任一段落的化合物，其中R^x是共價結(jié)合于核苷的接頭的鍵合位點，其中核苷具有結(jié)構(gòu)：

標(biāo)記環(huán)的B是核堿基；Rⁿ³是-OH或亞磷酰胺。Rⁿ⁵是-OH或-ODMT。

根據(jù)前述任一段落的化合物，其中R⁸選自：

用于檢測核酸靶序列的方法，所述方法包括：

(a)使靶序列與檢測核酸接觸；所述檢測核酸包括單鏈靶結(jié)合序列，所述檢測核酸具有連接于其的，

i)熒光團；和

ii)根據(jù)前述任一段落的化合物，其中R⁸包括共價結(jié)合(直接地或通過接頭)于檢測核酸的鍵合位點；

其中檢測核酸是在熒光團被激發(fā)時允許在熒光團和化合物之間進行供體-受體能量轉(zhuǎn)移的構(gòu)象；

(b)使靶結(jié)合序列與靶序列雜交，由此改變檢測核酸的構(gòu)象，引起熒光參數(shù)的改變；和

(c)檢測熒光參數(shù)的改變，由此檢測核酸靶序列。

確定第一核酸和第二核酸是否雜交的方法，第一核酸包括根據(jù)前述任一段落的化合物，其中R⁸包括共價結(jié)合(直接地或通過接頭)于第一核酸的鍵合位點，該方法包括：

(a)使第一核酸與第二核酸接觸；和

(b)檢測選自第一核酸、第二核酸和其組合的成員的熒光特性的改變，由此確定雜交是否發(fā)生。

監(jiān)測核酸擴增反應(yīng)的方法，該方法包括：

(a)制備包括檢測核酸的擴增反應(yīng)混合物，所述檢測核酸具有連接于其的，

i)熒光團；和

ii)根據(jù)前述任一段落的化合物，其中R⁸包括共價結(jié)合(直接地或通過接頭)于檢測核酸的鍵合位點；

(b)使擴增反應(yīng)混合物經(jīng)受擴增條件；

(c)監(jiān)測反應(yīng)混合物的來自檢測核酸的熒光信號以獲得測定結(jié)果；和

(d)采用測定結(jié)果監(jiān)測核酸擴增反應(yīng)。

檢測靶序列的擴增的方法，該方法包括：

(a)使包括靶序列的樣品核酸與在靶序列側(cè)翼的PCR引物雜交；

(b)用聚合酶延伸雜交的引物以產(chǎn)生PCR產(chǎn)物，并使PCR產(chǎn)物的兩條鏈分離以使靶序列的有義鏈和反義鏈可進入；

(c)使檢測核酸與PCR產(chǎn)物中的靶序列的有義鏈或反義鏈雜交，由此改變檢測核酸的構(gòu)象，引起熒光參數(shù)的改變，其中檢測核酸包括：

i)單鏈靶結(jié)合序列，其與PCR產(chǎn)物中的靶序列的至少一部分的有義鏈或反義鏈互補，并與PCR引物之間的區(qū)域雜交；

ii)熒光團；和

iii)根據(jù)前述任一段落的化合物，其中R⁸包括共價結(jié)合(直接地或通過接頭)于檢測核酸的鍵合位點；

其中在檢測核酸與靶序列雜交之前，檢測核酸是在熒光團被激發(fā)時允許在熒光團和猝滅劑之間進行供體-受體能量轉(zhuǎn)移的構(gòu)象；和

(d)測量熒光參數(shù)的改變以檢測靶序列和其擴增。

通過以下的實施例進一步說明本發(fā)明的物質(zhì)和方法。提供這些實施例以說明但不限制要求保護的發(fā)明。

實施例

實施例1：本發(fā)明的示例性化合物的合成

圖2中概括了本發(fā)明的各種示例性化合物的合成。

在不需要色譜法的情況下，通過羥基苯胺1以兩步制備總收率為約50％的羥基四甲基久洛尼定2)染料和色素(Dyes and Pigments)2003,59,63)。相對容易地按比例增加提供95g的2。2與固黑K(Fast Black K)(FBK)鹽的測試反應(yīng)產(chǎn)生深藍染料3。使用過量的氯己醇和碳酸鉀DMF在于無水條件下實現(xiàn)2至向C₆羥基化合物4的轉(zhuǎn)化。避免了在干DMF中使用氫化鈉進行烷基化的文獻方法，使得在大規(guī)模生產(chǎn)期間的困難最小化。將固黑K鹽的甲醇-水溶液添加至4的甲醇溶液，提供偶氮染料醇5，所述偶氮染料醇5轉(zhuǎn)化為亞酰胺6。按比例增加提供約13g亞酰胺。所述亞酰胺用于制備5’-標(biāo)記的聚T寡核苷酸，雙HPLC純化所述5’-標(biāo)記的聚T寡核苷酸(poly T oligo)，然后用于確定染料的消光系數(shù)。

使溴己酸與如上的2反應(yīng)不提供希望的化合物7。使溴己酸轉(zhuǎn)化為其甲酯8，然后將溴己酸的甲酯8與2偶聯(lián)以提供未分離的各自的C₆-酯化合物9。使用2M硫酸在THF中的水溶液裂解所述甲酯提供C₆-酸化合物7。與FBK鹽的偶聯(lián)提供酸性-偶氮染料10，所述酸性-偶氮染料10用于制備DMT保護的絲氨醇衍生物11。隨后將所述DMT保護的絲氨醇衍生物11轉(zhuǎn)化為羥乙酸酯12，然后轉(zhuǎn)化為CPG 13。CPG用于制備3’-標(biāo)記的聚T寡核苷酸，雙HPLC純化所述3’-標(biāo)記的聚T寡核苷酸，然后用于確定染料的消光系數(shù)。就5’-標(biāo)記的寡核苷酸來說，在堿性條件下去保護后的粗寡核苷酸樣品中，通過HPLC沒有看到染料分解或副產(chǎn)物的顯著痕跡。使酸性偶氮染料10轉(zhuǎn)化為活性酯14。

實施例2：BHQ2、BBQ和Cosmic猝滅劑的性能比較

前言

評價了Cosmic猝滅劑猝滅在更長的波長處染料發(fā)射光的性能。特別地，測試了猝滅劑消除來自熒光團Quasar 670和Quasar 705的信號的能力。作為參比，當(dāng)與這些相同的熒光團配偶時，還測試了BHQ2和BlackBerry猝滅劑(Berry&Associates,Inc.；描述于美國專利號7,879,986)的性能。通過實時PCR和核酸酶消化測定兩者評價了含有每種這些猝滅劑的TaqMan探針。

Cosmic猝滅劑

方案.猝滅劑部分。

方法

在本研究中利用模型TaqMan測定進行所有比較，并且將所述模型TaqMan測定設(shè)計為檢測人基因的毒蕈堿性膽堿能受體3(cholinergic receptor,muscarinic 3)(基因ID CHRM3，登錄號nm_000740)。探針序列是5’-[熒光團]-TCCTTTGGGCTCCTGCCATCT-[猝滅劑]-3’，并表示PCR引物5’-TTGGGTCATCTCCTTTG-3’和5’-GCACAGTTCTCTTTCCA-3’的擴增產(chǎn)物。用5種不同的熒光團猝滅劑組合中的每種合成該探針序列：Quasar 670-Cosmic猝滅劑、Quasar 670-BHQ2、Quasar 670-BBQ、Quasar 705-Cosmic猝滅劑和Quasar 705-BHQ2。每種探針與相同的引物集配偶，并且用一式三份的PCR擴增反應(yīng)從25ng人基因組DNA評價它們的猝滅效率。每個反應(yīng)的組成如下：

在RotorGene 6000(Corbett Research)上循環(huán)進行實時PCR反應(yīng)，在“紅色”信道(光源在625nm，檢測器在660nm，增益＝5)上檢測Quasar 670，在“深紅色”信道(光源在680nm，檢測器在710nm，增益＝10)上檢測Quasar 705。然后通過核酸酶消化測定檢測5種探針，其中將1.5個單位的微球菌核酸酶添加至具有濃度為400nM的探針的100μL核酸酶緩沖液的溶液。使消化進行10分鐘的間隔。在間隔后，在Tecan Safire熒光光度計上按以下設(shè)置測量信號強度：

通過使在用核酸酶處理的反應(yīng)中的探針的熒光強度除以在未處理的反應(yīng)中的相同探針的熒光強度計算信噪比值，在此之前，首先從各自中減去緩沖液空白對照的信號。

實時PCR結(jié)果

在Quasar 670曲線圖(圖3)中，實線擴增曲線表示Cosmic猝滅劑探針，虛線曲線表示BlackBerry猝滅劑(BBQ)探針，點曲線表示BHQ2探針。在Quasar 705曲線圖(圖4)中，實線曲線表示Cosmic猝滅劑探針，而點曲線表示BHQ2探針。采用任一種熒光團，Cosmic猝滅劑證實了比BHQ2或BBQ更高效的猝滅，如開始擴增前的基線信號強度所證明。

核酸酶消化結(jié)果

核酸酶測定揭示了Cosmic猝滅劑最有效地猝滅兩種熒光團，特別是采用Quasar 705，Quasar 705顯示了比采用BHQ高1/6的背景熒光被猝滅。由于Cosmic猝滅劑優(yōu)異的猝滅效率，Cosmic猝滅劑顯示了采用Quasar 705具有最高的信噪比，以及采用Quasar 670具有第二高的信噪比。

圖5A顯示了在核酸酶測定中，在有和沒有用Quasar 670-Cosmic猝滅劑、Quasar 670-BHQ2、Quasar 670-BBQ、Quasar 705-Cosmic猝滅劑和Quasar 705-BHQ2標(biāo)記的探針消化的情況下的熒光強度。圖5B顯示了在核酸酶消化測定中，由用Quasar 670-Cosmic猝滅劑、Quasar 670-BHQ2、Quasar 670-BBQ、Quasar 705-Cosmic猝滅劑和Quasar 705-BHQ2標(biāo)記的探針的消化的和未消化的熒光計算的信噪比。

理解的是，本文描述的實施例和實施方式僅用于說明性目的，并且，根據(jù)其進行的各種修改和改變會暗示本領(lǐng)域技術(shù)人員，并且包括在本申請的精神和范圍內(nèi)，并且被認為在所附的權(quán)利要求的范圍內(nèi)。本文引用的所有出版物、專利和專利申請在此出于所有目的通過引用全文并入。