本發(fā)明還涉及以此方式獲得的微藻分離蛋白。
背景技術(shù)：
：所屬領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，小球藻是一種潛在的食物來(lái)源，因?yàn)樗鼈兏缓鞍踪|(zhì)和其他必需營(yíng)養(yǎng)素。它們被描述為包含45％的蛋白質(zhì)、20％的脂肪、20％的碳水化合物、5％的纖維素和10％的礦物質(zhì)和維生素。鑒于其豐度和氨基酸譜，微藻蛋白因此被認(rèn)為是大豆蛋白或豌豆蛋白的替代性食物來(lái)源。蛋白部分也可以被開(kāi)發(fā)為化妝品行業(yè)、或甚至醫(yī)藥行業(yè)中的功能劑。然而，由于在所述部分中存在不希望的化合物(例如葉綠素)而導(dǎo)致包含它們的食物組合物的顏色、味道和結(jié)構(gòu)方面發(fā)生不希望的變化，所以在微藻蛋白的食品應(yīng)用方面的發(fā)展尚不顯著。為了增加其在食品應(yīng)用中的潛力，并且也為了增加其商業(yè)價(jià)值，必須在不影響它們的分子結(jié)構(gòu)的前提下從微藻中提取這些蛋白。“軟”提取技術(shù)將因此需要分離具有高溶解度和良好技術(shù)和功能特性的蛋白質(zhì)，但是微藻細(xì)胞壁的剛性，尤其綠色微藻的剛性，根本上與這一點(diǎn)矛盾，這是因?yàn)樗茐牧思?xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的提取和完整性。因此，與其相反，常規(guī)地“硬”的物理或化學(xué)條件被用來(lái)破壞微藻細(xì)胞壁。因此，許多研究提出了通過(guò)有機(jī)溶劑型或高壓勻漿類(lèi)型進(jìn)行提取的技術(shù)。然而，在這些技術(shù)選擇中，蛋白質(zhì)的變性未認(rèn)為是麻煩的，這是因?yàn)榇蠖鄶?shù)的這些方法開(kāi)發(fā)，是出于分析的目的，或意在提供用于酶消化的底物，從而產(chǎn)生水解蛋白。然而，保存細(xì)胞組分完整性的有效崩解方法不僅應(yīng)最大化產(chǎn)率，而且應(yīng)最大化提取的產(chǎn)物的質(zhì)量。換言之，用于優(yōu)化崩解壁的方法必須例如避免：-目標(biāo)產(chǎn)物的化學(xué)污染，-使用過(guò)高的破裂能；后者可能導(dǎo)致感興趣的細(xì)胞內(nèi)分子的不可逆變性或降解。此外，對(duì)于大規(guī)模生產(chǎn)而言，對(duì)于選擇的方法，重要的是可轉(zhuǎn)換值這一規(guī)模。最后，這一細(xì)胞崩解步驟的引入必須是容易的，并且必須對(duì)隨后的方法/處理步驟不具有負(fù)面影響。所有這些限制影響崩解方法的效率并且由于同樣原因影響其能量消耗。這就是為什么珠磨機(jī)技術(shù)是優(yōu)選的，因?yàn)樗徽J(rèn)為對(duì)于按其天然形式釋放細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)是有效的。在珠磨機(jī)中，將細(xì)胞與小球形顆粒一起以懸浮液狀態(tài)攪動(dòng)。細(xì)胞的破碎是由珠間剪切力、碾磨以及與珠的碰撞引起的。例如，專(zhuān)利US5330913中給出了一種適合的珠磨機(jī)的描述。這些珠使細(xì)胞破裂以從中釋放細(xì)胞內(nèi)容物。然后以“水包油”乳液形式獲得粒徑小于起源細(xì)胞的懸浮液。通常霧化此乳液并且消除水，然而留下包含由細(xì)胞碎片、間質(zhì)可溶性化合物和油組成的異質(zhì)混合物的干燥粉末。在使用這些細(xì)胞崩解技術(shù)時(shí)難以解決的是單獨(dú)地分離細(xì)胞內(nèi)內(nèi)容物(以便排除膜碎片、糖、纖維和脂肪)，并且尤其是保存蛋白負(fù)載的質(zhì)量。在四爿藻屬的微藻的情況下，安雅施文茨法伊爾(AnjaSchwenzfeier)等人(生物資源技術(shù)(BioresourceTechnology)，2011，102，9121-9127)提出了保證分離蛋白質(zhì)的溶解度和氨基酸譜質(zhì)量的方法，其中污染物(例如染色物質(zhì))被除去，該方法包括以下步驟：-用珠磨機(jī)進(jìn)行細(xì)胞崩解，-將磨碎的微藻懸浮液離心，-上清液的透析，-穿過(guò)離子交換樹(shù)脂，-洗脫物的透析，-脫色，然后-洗滌和再懸浮。然而，這種實(shí)驗(yàn)室方法(用于處理24g的生物質(zhì))不能放大到工業(yè)規(guī)模，其中而將珠磨機(jī)方法用于回收完整生物質(zhì)。此外，該方法不適合在其生物質(zhì)中包含并非不顯著脂質(zhì)含量的微藻(例如在原殼小球藻中，脂質(zhì)含量大于15％)。的確，即使在細(xì)胞壁的這種“相對(duì)軟的”破裂之后，磨碎的細(xì)胞材料呈相對(duì)穩(wěn)定的絡(luò)合物“水包油”乳液的形式。因此，而在此階段通常通過(guò)溶劑或機(jī)械地提取細(xì)胞組分，但是這有損害于其完整性?，F(xiàn)有技術(shù)提出了第一解決方案，并且此外由本申請(qǐng)人公司測(cè)試了該第一解決方案，該方案包括將機(jī)械研磨與蒸發(fā)偶聯(lián)，以便嘗試將該乳液去穩(wěn)定化，然后包括通過(guò)離心分離脂肪部分。然而，該分離步驟(堿性乳油化)的差的質(zhì)量使得這種相分離方法的效率非常低。即使在此階段推薦添加乙醇(20％-30％/原始)改進(jìn)了該乳液的去穩(wěn)定化，然而它僅使能夠?qū)崿F(xiàn)50％的級(jí)別的脫脂，甚至在低產(chǎn)率的情況下。此外，當(dāng)該脂質(zhì)部分與蛋白/多糖基質(zhì)結(jié)合時(shí)，該機(jī)械途徑是特別難以實(shí)施或甚至不可能實(shí)施的。另一個(gè)解決方案提出使用中性溶劑。然而，它面臨巨大的限制(質(zhì)量、安全性、法規(guī)等)。發(fā)明主題其結(jié)果是，對(duì)于提取并穩(wěn)定化感興趣的微藻的細(xì)胞組分的技術(shù)(通過(guò)機(jī)械研磨釋放所述細(xì)胞組分)存在未滿足的需要。本申請(qǐng)人公司已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，這一需要可以通過(guò)如下方式滿足：通過(guò)提出從現(xiàn)有技術(shù)中已知的那些方法的替代方法，通過(guò)將用于機(jī)械研磨微藻細(xì)胞的方法與用于使通過(guò)選自由堿處理和酶處理組成的組中的處理產(chǎn)生的脂質(zhì)部分變構(gòu)的步驟，隨后是離心的步驟組合。然后通過(guò)微孔過(guò)濾將脫脂可溶性部分澄清，然后超濾，以獲得該分離蛋白。因此，本發(fā)明涉及一種用于從小球藻屬微藻生物質(zhì)制備分離蛋白的方法，該方法包括以下步驟：-提供一種由發(fā)酵產(chǎn)生的微藻生物質(zhì)，-洗滌該生物質(zhì)，以便消除間質(zhì)可溶性化合物，并且濃縮，-在臥式珠磨機(jī)類(lèi)型系統(tǒng)中實(shí)施對(duì)經(jīng)過(guò)洗滌并且濃縮的生物質(zhì)的機(jī)械研磨，以獲得一種乳液，-將以此方式獲得的乳液變構(gòu)，-三相分離，以便從包含脂質(zhì)和細(xì)胞碎片的部分中分離可溶性部分，-尤其通過(guò)微孔過(guò)濾，回收以及任選的澄清以此方式獲得的可溶性部分，以便從中除去殘留不溶性物質(zhì)，以便獲得可溶性分離蛋白，-在具有小于5kDa，優(yōu)選在1kDa和5kDa之間的截止閾值的膜上對(duì)澄清的可溶性部分進(jìn)行任選的超濾，以便獲得一種可溶性分離蛋白，-在pH7下進(jìn)行任選的中和，-將所述分離蛋白蒸發(fā)、巴氏滅菌并霧化。微藻生物質(zhì)的選擇優(yōu)選地，小球藻屬微藻選自由普通小球藻、根腐小球藻和原殼小球藻組成的組，并且更具體地是原殼小球藻。在一個(gè)具體實(shí)施例中，該菌株為原殼小球藻(菌株UTEX250-美國(guó)得克薩斯大學(xué)奧斯汀分校藻類(lèi)培養(yǎng)物保藏中心(TheCultureCollectionofAlgaeattheUniversityofTexasatAustin-USA))。在另一個(gè)具體實(shí)施例中，該菌株為耐熱性小球藻(菌株UTEX1663-美國(guó)得克薩斯大學(xué)奧斯汀分校藻類(lèi)培養(yǎng)物保藏中心(TheCultureCollectionofAlgaeattheUniversityofTexasatAustin-USA))。在異養(yǎng)條件下并且在不存在光的情況下進(jìn)行培養(yǎng)通常導(dǎo)致產(chǎn)生具有按干細(xì)胞的重量計(jì)，45％至70％的蛋白含量(通過(guò)測(cè)量氮含量N×6.25進(jìn)行評(píng)估)的小球藻生物質(zhì)。如將在下文示例，分兩個(gè)步驟進(jìn)行這一培養(yǎng)：-在包含葡萄糖和酵母提取物的培養(yǎng)基中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，在28℃下，伴隨攪動(dòng)，持續(xù)72h，然后-自身在葡萄糖和酵母提取物中持續(xù)多于36h，在28℃下，伴隨攪動(dòng)并且在用氨水調(diào)節(jié)的pH6.5下，進(jìn)行用于產(chǎn)生生物質(zhì)的培養(yǎng)，這生成具有按干細(xì)胞的重量計(jì)，52％的級(jí)別的蛋白含量(用Nx6.25進(jìn)行評(píng)估)的大約80g/l的生物質(zhì)。然后通過(guò)固液分離，通過(guò)正面過(guò)濾或切向過(guò)濾、或通過(guò)另外為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任一方式收集生物質(zhì)。有利地，本申請(qǐng)人公司然后推薦洗滌并濃縮生物質(zhì)，以便通過(guò)生物質(zhì)的一系列的濃縮(通過(guò)離心)/稀釋來(lái)消除間質(zhì)可溶性化合物。在工業(yè)規(guī)模上，有利地選擇通過(guò)分一個(gè)階段或兩個(gè)階段的離心，來(lái)進(jìn)行順序稀釋和離心。出于本發(fā)明的目的，術(shù)語(yǔ)“間質(zhì)可溶性化合物”旨在意指發(fā)酵培養(yǎng)基中的所有可溶性有機(jī)污染物，例如水溶性化合物，例如鹽、殘留葡萄糖、具有2或3的聚合度(或DP)的寡糖、或肽。然后將其間質(zhì)可溶性化合物的以此方式純化的生物質(zhì)優(yōu)先調(diào)節(jié)至按重量計(jì)15％和30％之間的干物質(zhì)，優(yōu)選調(diào)節(jié)至20％和30％之間的干物質(zhì)。對(duì)于本發(fā)明的方法的剩余部分，以此方式獲得的生物質(zhì)可以被用作為，或被熱透化(通過(guò)高溫短時(shí)或HTST方法-同樣由本申請(qǐng)人公司開(kāi)發(fā)并且在其迄今仍未公開(kāi)的申請(qǐng)之一中加以保護(hù))，以便從中釋放可溶性肽的內(nèi)容物?？梢酝ㄟ^(guò)隨后的以下步驟來(lái)提取此生物質(zhì)的殘留蛋白。生物質(zhì)研磨本申請(qǐng)人公司推薦使用(臥式)珠磨機(jī)技術(shù)。更具體地，有利地，可以根據(jù)由本申請(qǐng)人公司已經(jīng)開(kāi)發(fā)的并且在其迄今未審查的申請(qǐng)之一中加以保護(hù)的方法來(lái)實(shí)施該研磨，其中：-硅酸鋯珠的表觀密度在2kg/l和3.5kg/l之間，并且-研磨室的填充率大于或等于80％。按連續(xù)模式，例如通過(guò)串聯(lián)連續(xù)多遍來(lái)實(shí)施該研磨。選擇待研磨的微藻的密度在小于250g/l的水平。在研磨結(jié)束時(shí)，獲得一種乳液。乳液的變構(gòu)及其組分的分離為了從中提取感興趣的肽的和多肽部分，乳液的組分的分離需要將由細(xì)胞研磨得到的乳液(脂質(zhì)、蛋白-肽和多肽-以及細(xì)胞碎片的復(fù)雜混合物)變構(gòu)/去穩(wěn)定化?？梢酝ㄟ^(guò)以下方式來(lái)促進(jìn)該乳液的這種變構(gòu)/去穩(wěn)定化：-通過(guò)酶預(yù)消化，尤其是通過(guò)特異性蛋白酶，通過(guò)用極性溶劑進(jìn)行處理和/或通過(guò)靶向乳液蛋白部分的受控堿處理，-抑或通過(guò)調(diào)節(jié)pH和溫度，通過(guò)用極性溶劑進(jìn)行處理和/或通過(guò)靶向與乳液脂質(zhì)部分的界面的酶消化，尤其是纖維素酶類(lèi)型的酶消化。因此，在裝有低剪切攪拌模塊的攪拌式反應(yīng)器中調(diào)節(jié)研磨的細(xì)胞材料，以便限制乳化，同時(shí)使得能夠進(jìn)行促進(jìn)所選擇的特定處理(設(shè)定pH，水解酶的作用等)的均勻混合。例如，在目的在于經(jīng)由酶途徑(例如通過(guò)堿性蛋白酶)通過(guò)處理混合物中的蛋白部分來(lái)使乳液去穩(wěn)定化的處理的情況下，將乳液的溫度和pH調(diào)節(jié)至針對(duì)所述蛋白酶的反應(yīng)條件：-將溫度調(diào)節(jié)至大于30℃的值，優(yōu)選為60℃的級(jí)別，并且-將pH調(diào)節(jié)至大于7的值，優(yōu)選為8的級(jí)別，(或甚至任選地為10的級(jí)別，如果僅僅利用了pH的作用)。反應(yīng)的持續(xù)時(shí)間在2h和8h之間。在裂解結(jié)束時(shí)，可以按大于5％(v/v)將乙醇作為針對(duì)乳液的去穩(wěn)定劑添加至反應(yīng)混合物中(在水包油乳液的情況下)?？梢酝ㄟ^(guò)三相分離(例如通過(guò)離心)使以此方式去穩(wěn)定化的乳液(部分地)分裂。因此，獲得了3個(gè)相：-上層脂質(zhì)乳膏，-水性/中間的(＝“原始”可溶性物質(zhì))可溶性化合物(和殘留不溶性物質(zhì))相，以及-集中細(xì)胞碎片的球粒?？扇苄圆糠只旧嫌芍饕牡鞍撞糠帧⒖扇苄蕴?、鹽和殘留脂質(zhì)小球組成。膜分離為了釋放肽和多肽，本發(fā)明的方法接下來(lái)導(dǎo)致優(yōu)選通過(guò)膜分級(jí)來(lái)分離感興趣的蛋白。因此，本申請(qǐng)人公司推薦分三個(gè)步驟進(jìn)行該方法：-將以此方式獲得的可溶性部分通過(guò)微孔過(guò)濾進(jìn)行回收和澄清，以便從中除去殘留不溶性物質(zhì)，-在具有小于5kDa，優(yōu)選在1kDa和5kDa之間的截止閾值的膜上對(duì)澄清的可溶性部分進(jìn)行超濾，并且-在6和8之間，優(yōu)選在7的pH值下，進(jìn)行任選的中和。利用這些通路使可能純化其殘留的鹽和糖的可溶性肽和多肽。在pI下的沉淀可替代地，為了分離感興趣的肽和多肽，可以做出選擇來(lái)進(jìn)行分三個(gè)步驟的方法：-通過(guò)調(diào)節(jié)介質(zhì)的pH至4和5之間的值，在其pI下沉淀蛋白質(zhì)，-離心或者微孔過(guò)濾，以便回收沉淀的蛋白，并且-在6和8之間，優(yōu)選7的pH下，溶解于水中。應(yīng)注意，盡管根據(jù)本發(fā)明的方法，后兩個(gè)步驟使得可能獲得具有按重量計(jì)大于80％，優(yōu)選大于90％蛋白含量的分離蛋白，但是通過(guò)其實(shí)施方法，它們導(dǎo)致了本質(zhì)上不同的組成。獲得呈粉末形式的分離物以此方式獲得的呈可溶形式的分離蛋白可以進(jìn)行以下處理：-通過(guò)蒸發(fā)進(jìn)行濃縮，-巴氏滅菌，并且最后-霧化。從以下實(shí)例將更清楚地理解本發(fā)明，所述實(shí)例旨在是說(shuō)明性的，并且是非限制性的。實(shí)例實(shí)例1：通過(guò)分批補(bǔ)料發(fā)酵進(jìn)行原殼小球藻的生產(chǎn)使用的藻種是原殼小球藻UTEX250。預(yù)培養(yǎng)：-在一個(gè)2l錐形瓶中的500ml的培養(yǎng)基；-該培養(yǎng)基的組成(以g/l計(jì))：表1孵育在以下條件下進(jìn)行：持續(xù)時(shí)間：72h；溫度：28℃；攪動(dòng)：110rpm(伊孚森莫特頓(InforsMultitron)孵育器)。然后將預(yù)培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到30l賽多利斯(Sartorius)型發(fā)酵罐中。用于生物質(zhì)生產(chǎn)的培養(yǎng)：該培養(yǎng)基如下：表2在接種后將發(fā)酵罐的初始體積(Vi)調(diào)節(jié)至17l。達(dá)到大約20l-25l的最終體積。用于進(jìn)行發(fā)酵的參數(shù)如下：表3溫度28℃pH5.0-5.2，使用28％w/wNH3pO220％±5％(通過(guò)搖動(dòng)來(lái)維持)搖動(dòng)最小300rpm氣流速率15l/min當(dāng)殘留葡萄糖濃度下降至低于10g/l時(shí)，則引入處于在大約800g/l的濃縮溶液形式的葡萄糖，以維持發(fā)酵罐中的葡萄糖含量在0與20g/l之間。結(jié)果在40h時(shí)獲得包含52％的蛋白的80g/l的生物質(zhì)。實(shí)例2.研磨原殼小球藻生物質(zhì)并且回收可溶性部分-通過(guò)處理肽和多肽部分，將乳液變構(gòu)將根據(jù)實(shí)例1獲得的生物質(zhì)洗滌并且通過(guò)離心濃縮，以便達(dá)到220g/l的干物質(zhì)含量并且達(dá)到多于90％的純度(用生物質(zhì)的干物質(zhì)與總干物質(zhì)的比率定義純度)。然后通過(guò)用硅酸鋯珠(0.6mm直徑，表觀密度2.4)的珠磨(臥式珠磨機(jī))來(lái)將其研磨。然后在裝有海洋推進(jìn)器和擋板的反應(yīng)器中攪動(dòng)研磨的生物質(zhì)。溫度被調(diào)節(jié)為60℃，并且pH被氫氧化鉀調(diào)節(jié)到8。添加結(jié)合纖維素酶的堿性蛋白酶，其中這些反應(yīng)條件被維持持續(xù)6h。然后在使可能獲得3個(gè)相的三相離心機(jī)上將乳液離心，這三個(gè)相是：上層脂質(zhì)乳膏，水性/中間的(＝“原始”可溶性物質(zhì))可溶性化合物(和殘留不溶性物質(zhì))相，以及集中細(xì)胞碎片的球粒。通過(guò)微孔過(guò)濾來(lái)使原始可溶性物質(zhì)的部分澄清。微孔過(guò)濾滲透物“P1”具有55％和70％之間的滴度的肽和蛋白(表示為總氨基酸)，并且然后在具有<5kDa截止閾值的膜上進(jìn)行超濾。以此方式獲得的超濾滲余物“R2”包含80％以上具有大于或等于5kDa的分子量的肽。滲透物“P2”包含具有小于5kDa的分子量的肽和寡糖以及殘留的鹽。然后尤其可以在反滲透膜(具有93％的NaCl排斥程度)上過(guò)濾這一滲透物“P2”，以獲得：ο滲余物“R3”，包含具有小于5kDa的分子量的肽和DP2的寡糖，例如蔗糖；以及ο滲透物“R3”，包含DP1的寡糖、鹽、游離氨基酸和有機(jī)酸。然后將分離蛋白“R2”：-用氫氧化鉀中和至pH7，-通過(guò)蒸發(fā)濃縮至35％干物質(zhì)(DM)，-巴氏滅菌，然后-霧化。實(shí)例3.研磨原殼小球藻生物質(zhì)并且回收可溶性部分-通過(guò)處理脂質(zhì)部分，將乳液變構(gòu)根據(jù)如實(shí)例2中所述的相同順序，在裝有海洋推進(jìn)器和擋板的反應(yīng)器中攪動(dòng)研磨的生物質(zhì)。溫度被調(diào)節(jié)至50℃，而不調(diào)節(jié)pH(自然地在5和6之間)。添加在此pH和溫度范圍中具有最佳活性的纖維素酶，其中將這些反應(yīng)條件維持6h的持續(xù)時(shí)間。在反應(yīng)結(jié)束時(shí)，pH被調(diào)節(jié)至8，之后分離為3個(gè)相。操作的剩余部分如在實(shí)例2中所述。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3