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技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了具有載氧能力以替代天然血紅蛋白的重組血紅蛋白蛋白質(zhì)、重組血紅蛋白四聚體、二聚體和亞基，包括α、β、γ1、γ2單體(具有或不具有血紅素分子)。本發(fā)明還提供了使用重組血紅蛋白蛋白質(zhì)、重組血紅蛋白四聚體、二聚體或亞基來用于體內(nèi)或離體組織的氧合的方法。本發(fā)明還提供了基于重組血紅蛋白蛋白質(zhì)、重組血紅蛋白四聚體、二聚體或亞基的治療劑，至少一個血紅蛋白亞基已進(jìn)行化學(xué)修飾以產(chǎn)生能夠靶向和/或殺死癌細(xì)胞的物質(zhì)。本發(fā)明另外提供了用于構(gòu)建和表達(dá)不同重組血紅蛋白亞基(包括α、β、γ1、γ2單體(具有或不具有血紅素分子))及其二聚體和四聚體以及用于它們的化學(xué)修飾或工程化的方法。本發(fā)明還描述了用于產(chǎn)生基于重組血紅蛋白蛋白質(zhì)或者重組血紅蛋白四聚體、二聚體或亞基的治療劑的化學(xué)工程化設(shè)計。本發(fā)明還涉及包含基于重組血紅蛋白蛋白質(zhì)或者重組血紅蛋白四聚體、二聚體或亞基的治療劑的藥物組合物，其用于人及其他動物中的癌癥靶向治療，特別是用于肝癌、乳腺癌、胰腺癌和由相應(yīng)祖細(xì)胞誘發(fā)或與相應(yīng)祖細(xì)胞相關(guān)的腫瘤。
背景技術(shù)：
：血紅蛋白基氧載體(HBOC)最初開發(fā)作為血液替代品。人胎盤血紅蛋白是一種特別有前景的HBOC。人胎盤血紅蛋白由于與人紅細(xì)胞相比其氧親和力更高、粘度更低并且平均直徑更小而允許將更多的氧輸送至缺氧組織。然而，由大規(guī)模使用胎盤血紅蛋白所構(gòu)成的主要問題是由從胎盤提取胎盤血紅蛋白并純化的條件引起。將胎盤保持冷凍儲存，并且為了提取血紅蛋白，必須在解凍之前將其粉碎。然后，通過過濾除去組織和纖維蛋白原，并對所得濾液進(jìn)行色譜、沉淀和滲濾的幾個步驟。而且，人胚胎血紅蛋白和人血液的來源是有限的。因此，構(gòu)建和表達(dá)重組血紅蛋白蛋白質(zhì)或者重組血紅蛋白四聚體或二聚體或亞基對解決這一問題具有重要意義。缺氧在癌癥中是常見的。缺氧和貧血(其有助于腫瘤缺氧)可通過使腫瘤細(xì)胞缺乏對這些藥劑的細(xì)胞毒活性所必需的氧而導(dǎo)致電離輻射和化學(xué)治療抗性。缺氧還可通過一種或多種間接機理(包括蛋白質(zhì)組和基因組變化)而降低對放射治療和化學(xué)治療的腫瘤敏感性。因此，需要改進(jìn)的癌癥治療組合物，特別是有利于靶向癌細(xì)胞并增強細(xì)胞毒劑的效力的改進(jìn)的癌癥治療組合物。發(fā)明簡述因此，在本發(fā)明中，構(gòu)建了具有載氧能力的重組血紅蛋白蛋白質(zhì)、重組血紅蛋白四聚體、二聚體和/或亞基。本發(fā)明提供了具有載氧能力以替代天然血紅蛋白的重組血紅蛋白蛋白質(zhì)、重組血紅蛋白四聚體、二聚體和亞基，包括α、β、γ1、γ2單體(具有或不具有血紅素分子)。另外，提供了基于本發(fā)明的任意重組血紅蛋白蛋白質(zhì)、重組血紅蛋白四聚體、二聚體和/或亞基的治療劑，其能夠靶向癌細(xì)胞以通過所綴合的治療性藥物(例如，化學(xué)治療劑、放射治療劑、抗癌蛋白質(zhì)藥物)來高效地殺死癌細(xì)胞。然而，發(fā)現(xiàn)廣泛用于不同患者的常見化學(xué)治療劑、放射治療劑和抗癌蛋白質(zhì)藥物具有很多副作用。這些問題可通過對本發(fā)明的任意重組血紅蛋白蛋白質(zhì)、四聚體、二聚體或亞基進(jìn)行化學(xué)修飾并將其與一種或多種治療性藥物連接來克服。因此，本發(fā)明還提供了基于重組血紅蛋白蛋白質(zhì)、重組血紅蛋白四聚體、二聚體或亞基的治療劑，其已被化學(xué)修飾以產(chǎn)生能夠靶向和/或殺死癌細(xì)胞的物質(zhì)。本發(fā)明另外提供了用于構(gòu)建和表達(dá)不同重組血紅蛋白亞基(包括α、β、γ1、γ2單體(具有或不具有血紅素分子))及其二聚體和四聚體以及用于它們的化學(xué)修飾或工程化的方法。本發(fā)明還描述了用于產(chǎn)生基于重組血紅蛋白蛋白質(zhì)或者重組血紅蛋白四聚體、二聚體或亞基的治療劑的化學(xué)工程化設(shè)計。本發(fā)明還涉及包含基于重組血紅蛋白蛋白質(zhì)或者重組血紅蛋白四聚體、二聚體或亞基的治療劑的藥物組合物，其用于人及其他動物中的癌癥靶向治療，特別是用于肝癌、乳腺癌、胰腺癌和由相應(yīng)祖細(xì)胞誘發(fā)或與相應(yīng)祖細(xì)胞相關(guān)的腫瘤。當(dāng)與單獨用于治療癌癥的常規(guī)治療性藥物(例如，化學(xué)治療性藥物，包括5-氟尿嘧啶、替莫唑胺、順鉑)相比時，本發(fā)明的基于重組血紅蛋白蛋白質(zhì)、四聚體、二聚體或亞基的治療劑不僅可靶向癌細(xì)胞，而且由于對癌細(xì)胞/腫瘤的殺傷效應(yīng)進(jìn)一步增強而可更有效地治療癌癥/或腫瘤。此外，由于與其他已知的血紅蛋白基氧載體相比，靶向癌癥的基于重組血紅蛋白蛋白質(zhì)或者重組血紅蛋白四聚體或二聚體或亞基的治療劑可以以相對較低的劑量使用，因此來自用于癌癥的常規(guī)治療性藥物的不良副作用大大減弱。大部分的常規(guī)治療性藥物都非常昂貴。如果降低治療有效劑量的話，對于每位患者而言可顯著縮減治療成本。本發(fā)明的基于重組血紅蛋白蛋白質(zhì)或者重組血紅蛋白亞基的治療劑是用于降低治療有效劑量的優(yōu)良候選物，因為經(jīng)修飾的重組血紅蛋白蛋白質(zhì)或重組血紅蛋白亞基可靶向癌細(xì)胞。在一個實施方案中，基于重組血紅蛋白蛋白質(zhì)或者重組血紅蛋白四聚體或二聚體或亞基的治療劑用于在人中治療癌癥的治療有效劑量可為0.0024mg/kg受試者體重(對于單劑量而言)或更低。其可用于以多劑量(每周一次)治療癌癥。本發(fā)明還提供了使用重組血紅蛋白蛋白質(zhì)、重組血紅蛋白四聚體、二聚體或亞基來用于體內(nèi)和離體組織的氧合的方法。任選地，本發(fā)明要求保護的基于重組血紅蛋白蛋白質(zhì)或者重組血紅蛋白四聚體或二聚體或亞基的治療劑還可與熒光探針連接以有利于活細(xì)胞成像。綴合有熒光素的基于重組血紅蛋白蛋白質(zhì)或四聚體或二聚體或亞基的治療劑可被肝癌細(xì)胞攝取。細(xì)胞對新鮮熒光素綴合的基于重組血紅蛋白蛋白質(zhì)或四聚體或二聚體或亞基的治療劑的攝取通過在下文所述的一系列活細(xì)胞攝取研究中將其直接用于細(xì)胞來驗證。在一個實例中，顯示熒光素綴合的基于重組血紅蛋白蛋白質(zhì)或四聚體或二聚體或亞基的治療劑被肝癌細(xì)胞(例如HepG2細(xì)胞系)攝取。因此，在本發(fā)明的第一方面，提供了不同的重組血紅蛋白蛋白質(zhì)、重組四聚體、重組二聚體和/或重組血紅蛋白亞基(例如，α、β、γ1、γ2；具有或不具有血紅素分子)，以及由其形成的二聚體和四聚體，并且還提供所述重組血紅蛋白蛋白質(zhì)、四聚體、二聚體和亞基用于進(jìn)行進(jìn)一步化學(xué)工程化或修飾。還提供了用于構(gòu)建并在宿主中表達(dá)所述重組血紅蛋白蛋白質(zhì)或亞基及其二聚體和四聚體的方法。本發(fā)明的第二方面是構(gòu)建用于靶向癌細(xì)胞的具有一個或多個官能團的經(jīng)化學(xué)修飾的重組血紅蛋白蛋白質(zhì)或者重組血紅蛋白四聚體、二聚體或亞基，所述一個或多個官能團可用作與至少一種類型的治療性藥物連接的連接或接頭(可切割的或不可切割的)。在一個實施方案中，參與對本發(fā)明的重組血紅蛋白蛋白質(zhì)或者重組血紅蛋白四聚體、二聚體或亞基進(jìn)行化學(xué)修飾的化學(xué)反應(yīng)包括但不限于胺反應(yīng)、硫醇反應(yīng)、羧酸酯反應(yīng)、羥基反應(yīng)、使用硫酯的天然化學(xué)連接、生物正交官能團的引入、光化學(xué)反應(yīng)和金屬介導(dǎo)的反應(yīng)?？蓪χ亟M血紅蛋白蛋白質(zhì)的一個或多個血紅蛋白亞基進(jìn)行化學(xué)修飾。本發(fā)明的第三方面是通過所述可切割或不可切割的連接或接頭使本發(fā)明的重組血紅蛋白蛋白質(zhì)或者重組血紅蛋白四聚體、二聚體或亞基與至少一種類型的治療性藥物(活性劑)化學(xué)連接以殺死癌細(xì)胞?？膳c本發(fā)明的重組血紅蛋白蛋白質(zhì)或者重組血紅蛋白四聚體、二聚體或亞基連接的治療性藥物或活性劑包括但不限于化學(xué)治療性藥物(例如，5-氟尿嘧啶、替莫唑胺、順鉑)、放射治療性藥物(例如，銠-105絡(luò)合物、釤-153絡(luò)合物及其他相關(guān)絡(luò)合物)、抗癌蛋白質(zhì)藥物(例如，精氨酸酶、精氨酸脫亞胺酶)、任何其他治療性藥物和/或化合物：其被證明對于治療和/或減輕癌癥是有效的并且能夠通過與重組血紅蛋白蛋白質(zhì)或者重組血紅蛋白四聚體、二聚體或亞基連接的或者與本發(fā)明的第二方面的經(jīng)化學(xué)修飾的重組血紅蛋白蛋白質(zhì)或者重組血紅蛋白四聚體、二聚體或亞基連接的可切割或不可切割的連接或接頭容易地與本發(fā)明的重組血紅蛋白蛋白質(zhì)或者重組血紅蛋白四聚體、二聚體或亞基連接。本發(fā)明還涉及包含基于重組血紅蛋白蛋白質(zhì)或者重組血紅蛋白四聚體、二聚體或亞基的治療劑的藥物組合物，其用于人及其他動物中癌癥靶向治療。所述組合物包含治療有效量的所述治療劑以及可藥用載體、鹽、緩沖劑、水或其組合以用于靶向和治療癌癥。在一個實施方案中，所述藥物組合物的pH在5.5至9.5的范圍內(nèi)。在另一個實施方案中，所述藥物組合物的pH在7.2至8.0的范圍內(nèi)。在本發(fā)明的第四方面，提供了用于靶向和/或治療癌癥的方法，其包括向患有不同腫瘤和/或癌癥的有需要的受試者施用藥物組合物，所述藥物組合物包含治療有效量的本發(fā)明的基于重組血紅蛋白蛋白質(zhì)或者重組血紅蛋白四聚體、二聚體或亞基的治療劑。所述組合物可通過多種途徑施用于受試者，所述途徑包括但不限于靜脈內(nèi)注射、腹膜內(nèi)注射和皮下注射。在本發(fā)明中可制備可切割和不可切割兩種形式的包含活性劑(例如化學(xué)治療劑(例如，5-氟尿嘧啶，5FU))的基于重組血紅蛋白蛋白質(zhì)或者重組血紅蛋白四聚體、二聚體或亞基的治療劑以用于癌癥靶向治療。還可對本發(fā)明的基于重組血紅蛋白蛋白質(zhì)或者重組血紅蛋白四聚體、二聚體或亞基的治療劑進(jìn)行化學(xué)修飾以有利于治療劑靶向癌細(xì)胞，使得其更有效地殺死癌細(xì)胞?？蓪χ亟M血紅蛋白蛋白質(zhì)或者重組血紅蛋白四聚體、二聚體或亞基進(jìn)行化學(xué)修飾，并使其與不同的治療劑(例如，5FU、替莫唑胺、順鉑等)連接。重組血紅蛋白蛋白質(zhì)或者重組血紅蛋白四聚體、二聚體或亞基可靶向癌細(xì)胞。這一靶向特性有利于高效地通過誘導(dǎo)癌細(xì)胞、癌干細(xì)胞和/或癌祖細(xì)胞凋亡來殺死這些細(xì)胞。因此，可降低治療劑的劑量。本發(fā)明中提供的基于重組血紅蛋白蛋白質(zhì)或者重組血紅蛋白四聚體、二聚體或亞基的治療劑可用于治療多種癌癥，例如胰腺癌、白血病、頭頸癌、結(jié)腸直腸癌、肺癌、乳腺癌、肝癌、鼻咽癌、食管癌和腦癌。本發(fā)明涉及基于重組血紅蛋白蛋白質(zhì)或者重組血紅蛋白四聚體、二聚體或亞基的治療劑、治療癌癥的方法以及治療和/或抑制癌組織轉(zhuǎn)移和癌組織復(fù)發(fā)的方法，所述癌癥包括但不限于肝癌。腫瘤內(nèi)的細(xì)胞是異質(zhì)性的。一般認(rèn)為腫瘤由以下構(gòu)成：(1)大部分的分裂能力受到限制的癌細(xì)胞和(2)稀少的癌干細(xì)胞樣細(xì)胞(CSC)(也稱為祖細(xì)胞)群體，其可形成新的腫瘤細(xì)胞并且本質(zhì)上具有高轉(zhuǎn)移性。由于CSC固有的化學(xué)抗性和轉(zhuǎn)移性，已假設(shè)其是癌癥患者中復(fù)發(fā)的原因。由于本發(fā)明的基于重組血紅蛋白蛋白質(zhì)或者四聚體、二聚體或亞基的治療劑中的重組血紅蛋白蛋白質(zhì)或者重組血紅蛋白四聚體、二聚體或亞基部分可為CSC或祖細(xì)胞帶來氧以有利于殺死癌干細(xì)胞或祖細(xì)胞，而本發(fā)明基于重組血紅蛋白蛋白質(zhì)或亞基的治療劑中的活性劑部分可殺死癌細(xì)胞，因此本發(fā)明基于重組血紅蛋白蛋白質(zhì)或者重組血紅蛋白四聚體、二聚體或亞基的治療劑在癌癥治療中具有協(xié)同效應(yīng)。附圖簡述圖1示出了用于構(gòu)建基于重組血紅蛋白蛋白質(zhì)或者重組血紅蛋白四聚體、二聚體或亞基的治療劑的設(shè)計方法?？墒挂环N或多種治療性藥物與重組血紅蛋白蛋白質(zhì)或者重組血紅蛋白四聚體、二聚體或亞基(例如α、β、γ1、γ2)連接以形成基于重組血紅蛋白蛋白質(zhì)或者重組血紅蛋白四聚體、二聚體或亞基的治療劑?？墒怪亟M血紅蛋白蛋白質(zhì)或者重組血紅蛋白四聚體、二聚體或亞基通過可切割的(A)或不可切割的接頭/連接(B)與治療劑化學(xué)連接?？汕懈畹慕宇^可以是但不限于甲醇胺、二硫化物、尿素、縮醛胺、碳酸酯、酯、氨基甲酸酯、磷酸酯、酰胺、乙縮醛、亞胺、醚和磺胺基團；不可切割的接頭可以是但不限于烷基和芳基。圖2描繪了人源(智人)的不同血紅蛋白亞基(α、β、γ1、γ2)的氨基酸序列以及對于重組血紅蛋白單體(即，單體α、單體β、單體γ1和單體γ2)、二聚體(即，二聚體αβ、二聚體αγ1、二聚體αγ2、二聚體βγ1和二聚體βγ2)和四聚體(即，四聚體2αβ2、四聚體2αγ12、四聚體2αγ22、四聚體2βγ12、四聚體2βγ22)的設(shè)計。圖3是描繪用于由轉(zhuǎn)化有不同構(gòu)建體的細(xì)胞制備本發(fā)明的重組血紅蛋白蛋白質(zhì)或四聚體或二聚體或亞基的方法的概述的流程圖，所述不同構(gòu)建體表達(dá)具有本文中所述的氨基酸序列的不同血紅蛋白四聚體、二聚體或亞基的蛋白質(zhì)。圖4示出了用于表達(dá)重組血紅蛋白亞基γ1的大腸桿菌(E.coli)細(xì)胞JM109(DE3)的生長曲線。圖5示出了(A)經(jīng)純化的重組血紅蛋白亞基(α、β、γ1、γ2)和(B)經(jīng)純化的重組血紅蛋白二聚體和四聚體在SDS-PAGE中的分子大小。圖6示出了經(jīng)熒光染料標(biāo)記的具有或不具有血紅素的經(jīng)純化的重組血紅蛋白亞基(α、β、γ1、γ2)。圖7示出了本發(fā)明的(A)一種重組血紅蛋白四聚體(2αβ2)和另一種重組血紅蛋白四聚體(2αγ12)的氧平衡曲線。圖8描繪了本發(fā)明的一種重組血紅蛋白二聚體(αβ)的電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)分析。圖9描繪了本發(fā)明的一種重組血紅蛋白四聚體(2αβ2)的電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)分析。圖10顯示具有血紅素(+)或不具有血紅素(-)的經(jīng)熒光標(biāo)記的重組血紅蛋白亞基(α、β、γ1、γ2)可成功地進(jìn)入肝癌細(xì)胞(HepG2)中。圖11示出了(A)5FU連接的重組血紅蛋白四聚體(2αβ2)和(B)5FU連接的重組血紅蛋白四聚體(2αγ12)的液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)結(jié)果。圖12示出了(A)具有二硫鍵的N-(2-巰基乙基)苯甲酰胺(模型化合物)在還原條件(即，GSH(0.4當(dāng)量至1,000當(dāng)量)；PBS(pH7.4)；37℃，0小時至2小時)下的裂解；和(B)模型化合物在不同GSH水平下的轉(zhuǎn)化率：GSH(1當(dāng)量)類似于血流中，而GSH(1,000當(dāng)量)類似于細(xì)胞質(zhì)中。圖13示出了與對照和經(jīng)僅GEM處理的動物模型組相比，天然牛交聯(lián)血紅蛋白(Hb)四聚體和本發(fā)明的重組血紅蛋白四聚體(2αβ2)在具有或不具有吉西他濱(GEM)下在胰腺癌Capan-1動物模型中減小腫瘤尺寸(就腫瘤重量(g)而言)的效力；組1：PBS緩沖液(對照)；組2：吉西他濱(GEM)，100mg/kg；組3：天然牛交聯(lián)血紅蛋白(Hb)四聚體，30mg/kg；組4：天然牛交聯(lián)血紅蛋白四聚體+吉西他濱(Hb+GEM)；組5：重組血紅蛋白四聚體(2αβ2)，30mg/kg；組6：重組血紅蛋白四聚體(2αβ2)+吉西他濱。圖14示出了與對照和僅經(jīng)GEM處理的動物模型組相比，天然牛交聯(lián)血紅蛋白(Hb)四聚體和本發(fā)明的重組血紅蛋白四聚體(2αγ12)在具有或不具有吉西他濱(GEM)下在胰腺癌Capan-1動物模型中減小腫瘤尺寸(就腫瘤重量(g)而言)的效力；組1：PBS緩沖液(對照)；組2：吉西他濱(GEM)，100mg/kg；組3：天然牛交聯(lián)血紅蛋白(Hb)四聚體，30mg/kg；組4：天然牛交聯(lián)血紅蛋白四聚體+吉西他濱(Hb+GEM)；組5：重組血紅蛋白四聚體(2αγ12)，30mg/kg；組6：重組血紅蛋白四聚體(2αγ12)+吉西他濱。定義術(shù)語“癌干細(xì)胞”指瘤性克隆中能夠在體內(nèi)起始并維持腫瘤生長的生物學(xué)上獨特的細(xì)胞(即癌癥引發(fā)細(xì)胞)。術(shù)語“可切割的綴合物”指具有至少一個可切割的接頭或連接的綴合物，其通過水解或氧化還原反應(yīng)可容易地釋放連接的治療性藥物/活性劑。術(shù)語“不可切割的綴合物”指具有至少一個不可切割的接頭或連接的綴合物，其不能通過水解或氧化還原反應(yīng)容易地釋放連接的治療性藥物/活性劑。術(shù)語“重組血紅蛋白蛋白質(zhì)”指分子大小為至少約65KDa且通過任何標(biāo)準(zhǔn)分子化學(xué)技術(shù)合成的而非從任何動物或人來源分離或純化的血紅蛋白分子。在本發(fā)明中，重組血紅蛋白蛋白質(zhì)可包括但不限于本發(fā)明的重組血紅蛋白四聚體、二聚體和亞基(單體)(具有或不具有血紅素)或者可與重組血紅蛋白四聚體互換使用。術(shù)語“重組血紅蛋白四聚體”指分子大小為至少約64KDa且通過任何標(biāo)準(zhǔn)分子化學(xué)技術(shù)合成的而非從任何動物或人來源分離或純化的血紅蛋白分子。在本發(fā)明中，重組血紅蛋白四聚體可包含本文中所述的任意四個重組血紅蛋白亞基(具有或不具有血紅素)或者包含通過任何標(biāo)準(zhǔn)分子化學(xué)技術(shù)合成的而非從任何動物或人來源分離或純化的任意四個血紅蛋白亞基。術(shù)語“重組血紅蛋白二聚體”指分子大小為至少約32KDa且通過任何標(biāo)準(zhǔn)分子化學(xué)技術(shù)合成的而非從任何動物或人來源分離或純化的血紅蛋白分子。在本發(fā)明中，重組血紅蛋白二聚體可包含本文中所述的任意兩個重組血紅蛋白亞基或者包含通過任何標(biāo)準(zhǔn)分子化學(xué)技術(shù)合成的而非從任何動物或人來源分離或純化的任意兩個血紅蛋白亞基。術(shù)語“重組血紅蛋白亞基”指分子大小為約16KDa或更小且通過標(biāo)準(zhǔn)分子化學(xué)技術(shù)合成的而非從動物或人來源分離或純化的血紅蛋白亞基或其片段，其可被修飾成具有或不具有血紅素基團。發(fā)明詳述由于大多數(shù)的癌組織(例如癌性腫瘤)是缺氧的，因此其可變得對常規(guī)的化學(xué)治療劑/放射治療劑具有抗性。本發(fā)明的重組血紅蛋白蛋白質(zhì)或者重組血紅蛋白四聚體或二聚體或亞基可用于減輕這一缺氧性病癥。本發(fā)明的重組血紅蛋白蛋白質(zhì)或者重組血紅蛋白四聚體或二聚體或亞基由于與人紅細(xì)胞相比其氧親和力更高、粘度更低并且平均直徑更小而允許將更多的氧輸送至缺氧組織，從而導(dǎo)致降低癌細(xì)胞中的對化學(xué)治療性藥物/放射治療性藥物/其他抗癌藥物-抗性。在本發(fā)明的一個實施方案中，制備了重組血紅蛋白蛋白質(zhì)或四聚體或二聚體或亞基。所述重組血紅蛋白蛋白質(zhì)或四聚體或二聚體或亞基具有氧輸送特征并且可靶向人體或動物體中的癌細(xì)胞或癌組織。對作為氧載體的本發(fā)明的重組血紅蛋白蛋白質(zhì)或者重組血紅蛋白四聚體或二聚體或亞基進(jìn)行化學(xué)修飾并且使其與至少一種類型的治療性藥物(例如，化學(xué)治療劑)連接，所述治療性藥物能夠觸發(fā)受體介導(dǎo)的機理并且引導(dǎo)組合的/綴合的化學(xué)治療劑與重組血紅蛋白蛋白質(zhì)或者重組血紅蛋白四聚體或二聚體或亞基一起定位于至少癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中以提高重組血紅蛋白蛋白質(zhì)或四聚體或二聚體或亞基和化學(xué)治療劑二者減小腫瘤尺寸的效力從而導(dǎo)致治療癌癥。優(yōu)選地，所述癌癥對單獨施用時的常規(guī)治療性藥物(例如化學(xué)治療劑和/或放射治療劑)具有抗性。圖1A和圖1B中示出了用于構(gòu)建基于重組血紅蛋白蛋白質(zhì)或者重組血紅蛋白四聚體或二聚體或亞基的治療性藥物的設(shè)計。使一種或多種活性劑(或者“治療性藥物”可在本文中互換使用)與重組血紅蛋白蛋白質(zhì)或者重組血紅蛋白四聚體或二聚體或亞基連接以形成本發(fā)明要求保護的基于重組血紅蛋白蛋白質(zhì)或亞基的治療劑。一種或多種具體活性劑的選擇可根據(jù)所靶向癌組織的類型以及生成的經(jīng)化學(xué)修飾的物質(zhì)的所需分子大小。此外，在多于一種活性劑的情況下，所選擇的活性劑可以是相同的或不同的。即，只要生成的分子保留效力并且還能夠與本發(fā)明用于靶向癌細(xì)胞的重組血紅蛋白蛋白質(zhì)或四聚體或二聚體或亞基連接的活性劑(或“治療性藥物”)等。本發(fā)明的重組血紅蛋白蛋白質(zhì)或四聚體或二聚體或亞基可通過可切割的(圖1A)或不可切割的連接或接頭(圖1B)與治療性藥物/活性劑化學(xué)連接，或者可替選地在所述連接或接頭不存在下可與活性劑直接綴合。在本發(fā)明中可使用不同的化學(xué)基團來對重組血紅蛋白蛋白質(zhì)或四聚體或二聚體或亞基進(jìn)行化學(xué)修飾，并且可使重組血紅蛋白蛋白質(zhì)或四聚體或二聚體或亞基通過這些化學(xué)基團與治療性藥物/活性劑連接。在一個實施方案中，可切割的接頭可以是但不限于甲醇胺、二硫化物、尿素、縮醛胺、碳酸酯、酯、氨基甲酸酯、磷酸酯、酰胺、乙縮醛、亞胺、肟、醚和磺胺基團；不可切割的接頭可以是但不限于烷基和芳基。圖2示出了不同血紅蛋白亞基(α、β、γ1、γ2)的氨基酸序列比對以及重組血紅蛋白單體、二聚體和四聚體的設(shè)計。重組血紅蛋白可使用來自多種物種的序列來制備，所述序列包括但不限于人、牛、豬、馬和犬血紅蛋白。在該實例中，選擇具有約141至146個氨基酸的不同智人血紅蛋白亞基氨基酸序列(即，α、β、γ1和γ2(SEQIDNo.1至4))來設(shè)計DNA構(gòu)建體，將所述DNA構(gòu)建體插入表達(dá)載體中并任選地用His-sumo/Poly-His序列標(biāo)記以用于在轉(zhuǎn)化有攜帶相應(yīng)DNA構(gòu)建體的表達(dá)載體的宿主(例如，細(xì)菌)中表達(dá)之后進(jìn)行分離和純化。用于制備重組血紅蛋白蛋白質(zhì)/亞基的方法在圖3的流程圖中進(jìn)行了概述。任意兩種亞基(例如α和β亞基或者α和γ1亞基)可通過使用攜帶表達(dá)α和β亞基或者α和γ1亞基的相應(yīng)DNA序列的另一表達(dá)載體來表達(dá)。在根據(jù)圖3流程圖中所示的方法純化之后，可分別形成二聚體αβ、αγ1、αγ2、βγ1和βγ2。還可使用類似的方法來形成兩個以上亞基的進(jìn)一步重組，例如兩個α亞基和兩個β亞基，或者兩個α亞基和兩個γ1亞基，或者兩個α亞基和兩個γ2亞基以形成四聚體，即分別為2αβ2、2αγ12、2αγ22、2βγ12、2βγ22。可在四聚體中的兩個血紅蛋白亞基之間進(jìn)行進(jìn)一步修飾，例如交聯(lián)。重組血紅蛋白亞基、二聚體和四聚體的氨基酸序列的設(shè)計示意圖分別示于圖2A、圖2B和圖2C中。圖3中描繪的方法基于用于在轉(zhuǎn)化有表達(dá)載體設(shè)計的宿主系統(tǒng)中表達(dá)重組蛋白的標(biāo)準(zhǔn)分子化學(xué)技術(shù)，所述表達(dá)載體設(shè)計攜帶用于表達(dá)本發(fā)明的相應(yīng)血紅蛋白亞基、二聚體或四聚體的相應(yīng)DNA構(gòu)建體。還可使用可表達(dá)重組蛋白的其他可能方法來表達(dá)本發(fā)明的重組血紅蛋白蛋白質(zhì)/四聚體/二聚體/亞基。首先，(301)制備具有經(jīng)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的種子培養(yǎng)物用于進(jìn)行發(fā)酵(302)，所述宿主細(xì)胞攜帶用于表達(dá)相應(yīng)血紅蛋白亞基的DNA構(gòu)建體。通過離心收獲細(xì)胞(302)。然后，將收獲的細(xì)胞裂解以分離粗制蛋白質(zhì)(303)。然后，使用親和色譜來純化粗制蛋白質(zhì)(304)。通過脫鹽柱和/或超濾來除去來自親和色譜的洗脫液中的鹽(305)。將半純化的蛋白質(zhì)通過離子交換柱色譜進(jìn)一步純化(306)以除去蛋白質(zhì)雜質(zhì)和內(nèi)毒素(307)。本發(fā)明的方法適用于重組單體血紅蛋白、二聚體血紅蛋白和四聚體血紅蛋白的大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。另外，與藥用載體(例如，水、生理緩沖劑，在膠囊劑中)組合的重組血紅蛋白蛋白質(zhì)/四聚體/二聚體/亞基適用于哺乳動物使用。不同重組血紅蛋白或者重組血紅蛋白亞基的構(gòu)建和表達(dá)在大腸桿菌中進(jìn)行。例如，接種轉(zhuǎn)化有攜帶用于表達(dá)γ1亞基的DNA構(gòu)建體的表達(dá)載體的大腸桿菌JM109(DE3)，并培養(yǎng)約16小時以收獲細(xì)胞用于細(xì)胞裂解和蛋白質(zhì)提取。圖4中示出了用于表達(dá)γ1亞基的大腸桿菌JM109(DE3)的生長曲線。然后，通過柱色譜方法來純化重組血紅蛋白蛋白質(zhì)/四聚體/二聚體/亞基。根據(jù)本發(fā)明方法表達(dá)并純化的重組血紅蛋白亞基(α、β、γ1、γ2)示于圖5A中，并且根據(jù)本發(fā)明方法表達(dá)并純化的重組血紅蛋白二聚體和四聚體示于圖5B中。圖6示出了未經(jīng)純化但經(jīng)熒光標(biāo)記的具有或不具有血紅素的亞基。測量受試化合物的p50值(在本發(fā)明中意指產(chǎn)生50％血紅蛋白飽和度所必需的氧分壓)并且結(jié)果示于圖7中。天然人血紅蛋白的p50值大約為約23mmHg至30mmHg。圖7示出了(A)重組血紅蛋白四聚體(2αβ2)和(B)重組血紅蛋白四聚體(2αγ12)的氧平衡曲線。如圖7中所示，重組血紅蛋白四聚體2αβ2的p50值大約為約15mmHg，重組血紅蛋白四聚體2αγ12的p50值大約為約21mmHg。與p50值大約為23mmHg至30mmHg的天然人血紅蛋白相比，形成具有相對更高氧親和力和小于約23mmHg的更低p50值的重組血紅蛋白。在由大量血液損失引起的組織缺氧(例如失血性休克)的情況下，當(dāng)期望快速氧合時，使用氧親和力較低的包含血紅蛋白基氧載體的組合物。較低的氧親和力意指，與氧親和力較高的物質(zhì)相比，所述物質(zhì)可更易于向靶標(biāo)“卸載”氧。在癌癥治療中具有較高氧親和力的組合物作為氧合輔助治療是有用的，在這種情況下期望較慢的氧遞送速率。對于治療缺氧病癥的用途和心臟保存，本發(fā)明的具有較低氧親和力的包含血紅蛋白基氧載體的藥物組合物向靶器官或受試者提供氧。本發(fā)明的具有較低氧親和力的重組血紅蛋白蛋白質(zhì)或四聚體或二聚體或亞基可用于需要快速組織氧合的應(yīng)用(例如，失血性休克和離體器官保存)。對于在癌癥治療中的應(yīng)用，本發(fā)明的具有較高氧親和力的包含血紅蛋白基氧載體的藥物組合物充當(dāng)組織氧合劑以改善腫瘤組織中的氧合，從而增強化學(xué)和放射敏感性。本發(fā)明的具有相對較高氧親和力的重組血紅蛋白可用于需要較緩慢氧合速率的應(yīng)用(例如癌癥輔助治療)。ESI-MS能夠?qū)Ψ浅４蟮姆肿舆M(jìn)行分析。ESI-MS是一種電離技術(shù)，其通過使蛋白質(zhì)電離來分析高分子量化合物，然后基于質(zhì)量/電荷比來分離電離的蛋白質(zhì)。因此，可精確地確定分子量和蛋白質(zhì)相互作用。在本發(fā)明中使用電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)來分析和表征重組血紅蛋白單體、二聚體和四聚體。圖8描繪了對重組血紅蛋白二聚體(αβ)的電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)分析。α亞基的大小為15,189Da，β亞基的大小為15,899Da。圖9描繪了對重組血紅蛋白四聚體(2αβ2)的電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)分析。β亞基的大小為15,899Da，2α的大小為30,356Da。根據(jù)該分析，2αβ2的估算總分子大小為約46KDa。ESI-MS對重組血紅蛋白四聚體(2αγ12)、其他重組血紅蛋白二聚體和單體也有用。本發(fā)明的重組血紅蛋白蛋白質(zhì)/四聚體/二聚體/亞基用于制備用于組織氧合、用于癌癥治療、用于治療缺氧病癥(例如失血性休克)的藥物并且用于低含氧量環(huán)境下的心臟保存(例如，心臟移植物)。本發(fā)明的重組血紅蛋白四聚體的劑量選擇為以下濃度范圍：大約0.03g/kg動物體重或更低，或者0.0024g/kg人體重或更低(人劑量，根據(jù)FDA工業(yè)界指南和綜述：EstimatingtheSafetyStartingDoseinClinicalTrialsforTherapeuticsinAdultHealthyVolunteers，2002年11月18日，通過用于小鼠的劑量除以系數(shù)12.3來確定)。對于用于癌癥治療的藥物，本發(fā)明的包含血紅蛋白基氧載體的藥物組合物充當(dāng)組織氧合劑以改善腫瘤組織中的氧合，從而增強化學(xué)敏感性(例如，對化學(xué)治療的敏感性)和放射敏感性。本發(fā)明的藥物組合物包含能夠靶向并殺死癌細(xì)胞的基于重組血紅蛋白或者重組血紅蛋白四聚體或二聚體或亞基的治療劑。圖6示出了經(jīng)熒光染料標(biāo)記的具有或不具有血紅素的經(jīng)純化重組血紅蛋白亞基(α、β、γ1、γ2)。經(jīng)熒光標(biāo)記的重組血紅蛋白亞基也可進(jìn)入癌細(xì)胞(例如，肝癌細(xì)胞，HepG2)中并定位在其中，并且結(jié)果示于圖10中?？梢灶A(yù)期，經(jīng)化學(xué)修飾的基于重組血紅蛋白蛋白質(zhì)或四聚體或二聚體或亞基的治療劑也可有效地殺死癌細(xì)胞和祖細(xì)胞/癌干細(xì)胞。一些常規(guī)的治療性藥物(例如，化學(xué)治療性藥物，5FU)由于高毒性而不能以高劑量使用。在本發(fā)明中，化學(xué)治療劑(例如，5FU)與重組血紅蛋白蛋白質(zhì)或者重組血紅蛋白四聚體或二聚體或者其任意亞基或者重組血紅蛋白亞基自身化學(xué)連接。與其他單獨施用用于癌癥的常規(guī)方法/藥劑相比，與本發(fā)明要求保護的重組血紅蛋白蛋白質(zhì)或四聚體或二聚體或者其亞基連接的化學(xué)治療劑可具有較低的劑量，因為本發(fā)明要求保護的重組血紅蛋白蛋白質(zhì)或四聚體或二聚體或亞基有利于化學(xué)治療劑定位在癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中以提高本發(fā)明重組血紅蛋白蛋白質(zhì)或四聚體或二聚體或亞基和化學(xué)治療劑二者的效力。本發(fā)明的重組血紅蛋白蛋白質(zhì)或四聚體或二聚體或亞基還可提高放射治療劑和/或其他抗癌藥物對癌細(xì)胞或腫瘤的效力，尤其是對用于癌癥治療的這些常規(guī)治療性藥物更具抗性的缺氧的癌細(xì)胞或腫瘤的效力。圖11示出了(A)5FU連接的重組血紅蛋白四聚體(2αβ2)和(B)5FU連接的重組血紅蛋白四聚體(2αγ12)的液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)結(jié)果。5FU成功地與重組血紅蛋白四聚體化學(xué)連接。其還適用于其他化學(xué)連接的重組血紅蛋白二聚體和重組血紅蛋白亞基(或單體)。重組血紅蛋白蛋白質(zhì)或四聚體或二聚體或者其亞基在與治療性藥物連接之前可被不同的官能團化學(xué)修飾?？赏ㄟ^以下一種或多種化合物或反應(yīng)對重組血紅蛋白蛋白質(zhì)或四聚體或二聚體或者其亞基進(jìn)行修飾：(1)對于胺反應(yīng)：酸酐；乙烯酮；NHS酯；異硫氰酸酯；異氰酸酯；包括氟苯基酯和羰基疊氮化物的活性酯；磺酰氯；羰基化合物，之后被還原性胺化；環(huán)氧化物；碳酸酯；氟苯；亞氨酸酯；羥甲基膦衍生物；曼尼?？s合；重氮基衍生物；4-磺基-2,3,5,6-四氟苯酚；羰基二咪唑；磺基-NHS，和通過吡哆醛-5-磷酸基仿生轉(zhuǎn)氨基的N端修飾；(2)對于硫醇反應(yīng)：馬來酰亞胺、鹵代烷、鹵代乙酰胺、二硫化物、硫代硫酸酯、含氮丙啶試劑、丙烯?；苌?、芳基化劑和乙烯基砜衍生物；(3)對于羧酸酯反應(yīng)：重氮烷和重氮基乙酰基化合物、羰基二咪唑和碳二亞胺；(4)對于羥基反應(yīng)：環(huán)氧化物和環(huán)氧乙烷、羰基二咪唑、碳酸酯、氯甲酸酯、化學(xué)和酶促氧化、烷基鹵素和異氰酸酯；(5)使用硫酯的天然化學(xué)連接；(6)N-端修飾，利用N-端絲氨酸或蘇氨酸的高碘酸鹽氧化來生成用于與羥胺、肼或酰肼、碳二亞胺偶聯(lián)的醛；(7)對于生物正交官能團的引入：包括發(fā)生后續(xù)生物正交綴合反應(yīng)的炔烴和疊氮化物，所述后續(xù)生物正交綴合反應(yīng)包括炔烴和疊氮化物的偶極加成Huisgen1,3-偶極加成、疊氮化物和三芳基膦的施陶丁格連接、炔烴和四嗪的Diels-alder反應(yīng)，以及炔烴和四唑的偶聯(lián)；(8)對于光化學(xué)反應(yīng)：光親和標(biāo)記劑、二氮丙啶衍生物、二苯甲酮和蒽醌；(9)對于金屬介導(dǎo)的反應(yīng)：金屬類卡賓和鈀活化的烯丙基試劑。與血流(約1當(dāng)量)相比，癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中具有遠(yuǎn)遠(yuǎn)更高的谷胱甘肽(GSH)水平(約1000當(dāng)量)。具有二硫鍵的治療性藥物在具有高GSH濃度的癌細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中更容易被裂解。圖12中示出了具有二硫鍵的模型化合物(N-(2-巰基乙基)苯甲酰胺)在還原條件下的裂解的高效液相色譜(HPLC)分析。在具有不同濃度的谷胱甘肽(GSH)(0.4當(dāng)量至1000當(dāng)量)的PBS緩沖液(pH7.4)中在37℃下觀察模型化合物的裂解。在高GSH濃度(>50當(dāng)量)下，模型化合物的裂解較好。在本發(fā)明中，制備通過二硫鍵與治療性藥物(例如，化學(xué)治療劑、放射治療劑、抗癌蛋白質(zhì)藥物)連接的重組血紅蛋白或者重組血紅蛋白四聚體或二聚體或亞基用于進(jìn)行癌癥治療。市場上尚沒有基于重組血紅蛋白蛋白質(zhì)或者重組血紅蛋白四聚體或二聚體或亞基的治療劑可供利用。本發(fā)明中提供的包含經(jīng)化學(xué)修飾的基于重組血紅蛋白蛋白質(zhì)或者重組血紅蛋白四聚體或二聚體或亞基的治療劑的藥物組合物可靶向癌細(xì)胞并具有治療效果。對于在癌癥治療中的用途，本發(fā)明的包含經(jīng)化學(xué)修飾的基于重組血紅蛋白蛋白質(zhì)或者重組血紅蛋白四聚體或二聚體或亞基的治療劑的藥物組合物充當(dāng)抗癌劑以殺死癌細(xì)胞。經(jīng)化學(xué)修飾的基于重組血紅蛋白蛋白質(zhì)或者重組血紅蛋白四聚體或二聚體或亞基的治療劑是以較低劑量使用的良好候選物并且可與其他分子靶向劑或細(xì)胞毒劑組合。實施例通過描述本發(fā)明的一些具體實施方案的方式提供了以下實施例，而并非旨在以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實施例1(a)構(gòu)建具有重組血紅蛋白蛋白質(zhì)和/或四聚體和/或二聚體和/或其亞基的表達(dá)載體合成人源的α/β/γ1/γ2鏈的DNA序列，并克隆在PUC57載體中。通過PCR方法擴增α/β/γ1/γ2鏈。PCR中使用的引物基于兩條α/β/γ1/γ2鏈來設(shè)計。PCR在梯度熱循環(huán)儀(Lifesci)中進(jìn)行。反應(yīng)在25μl反應(yīng)混合物中進(jìn)行，反應(yīng)混合物包含：Taq緩沖液、10mMdNTP、25mMMgCl2、10μM引物、2.5UTaqDNA聚合酶和100ng模板DNA。梯度PCR條件包括：95℃下3分鐘的初始變性步驟；接著是25個擴增循環(huán)，擴增循環(huán)由在95℃下變性30秒，在50℃至55℃下引物退火30秒以及在72℃下延伸45秒組成；之后在72℃下最后延伸5分鐘。通過1.5％瓊脂糖凝膠電泳與標(biāo)準(zhǔn)參照物一起分離PCR產(chǎn)物并用凝膠紅染色。切下預(yù)期大小的產(chǎn)物帶并用PCR清潔凝膠提取試劑盒根據(jù)生產(chǎn)商的說明提取DNA片段。將經(jīng)純化的DNA片段克隆到pSumo載體或PUC19載體中。將連接混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a菌株中，并在包含100ng/ml氨芐青霉素的LB瓊脂上篩選轉(zhuǎn)化株。通過核苷酸測序來驗證假定克隆。使用BLAST算法程序來進(jìn)行cDNA序列的分析。(b)不同的重組血紅蛋白蛋白質(zhì)和/或四聚體和/或二聚體和/或亞基如圖2和表1中所示產(chǎn)生七種重組血紅蛋白蛋白質(zhì)和/或四聚體和/或二聚體和/或亞基。α/β/γ1/γ2鏈的蛋白質(zhì)序列示于圖2中。對于重組血紅蛋白單體，將α/β/γ1/γ2鏈克隆到pSumo載體中并且由T7啟動子來控制融合蛋白的表達(dá)。對于重組血紅蛋白異二聚體，將α鏈和β/γ1鏈在pUC19載體中共表達(dá)并使其處于pTac啟動子的控制之下。對于重組血紅蛋白四聚體，將兩條α鏈通過甘氨酸接頭連接并與β/γ1鏈在pUC19載體中共表達(dá)且使其處于pTac啟動子的控制之下。表1：不同的重組血紅蛋白蛋白質(zhì)和/或四聚體和/或二聚體和/或亞基實施例2重組蛋白的表達(dá)將用于表達(dá)重組血紅蛋白蛋白質(zhì)/四聚體/二聚體/亞基的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109(DE3)或大腸桿菌BL21(DE3)中。將大腸桿菌細(xì)胞在補充有氨芐青霉素(100mg/ml)的LB培養(yǎng)基中在37℃下培養(yǎng)。對于搖瓶式表達(dá)，將過夜培養(yǎng)物以1:100添加到包含100mg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中。在搖瓶中在37℃下培養(yǎng)細(xì)胞直至600nm下的光密度達(dá)到0.6。通過添加異丙基b-硫代半乳糖苷至0.4mM來誘導(dǎo)重組血紅蛋白蛋白質(zhì)/四聚體/二聚體/亞基的表達(dá)。然后，向培養(yǎng)物補充血紅素(20mg/L)，并在28℃下繼續(xù)生長至少16小時。對于發(fā)酵罐培養(yǎng)物，用于表達(dá)重組血紅蛋白蛋白質(zhì)/四聚體/二聚體/亞基的培養(yǎng)基包含1.28％細(xì)菌用胰蛋白胨、0.8％細(xì)菌用酵母提取物、1％甘油、25mMKH2PO4、25mMNa2HPO4、45mMNH4Cl、5mM(NH4)2SO4和100mg/L氨芐青霉素。將細(xì)胞在2L發(fā)酵罐(Sartorius,B)中在30℃下培養(yǎng)直至600nm下的光密度達(dá)到8。通過添加異丙基b-硫代半乳糖苷(Sigma)至mM來誘導(dǎo)重組血紅蛋白蛋白質(zhì)/四聚體/二聚體/亞基的表達(dá)。然后，向培養(yǎng)物補充血紅素(50mg/L)，并在25℃下繼續(xù)生長至少16小時。通過離心收獲細(xì)胞并將其冷凍儲存在-80℃下直至需要進(jìn)行純化。實施例3重組血紅蛋白在搖瓶和發(fā)酵罐中的蛋白質(zhì)產(chǎn)量重組血紅蛋白蛋白質(zhì)和/或四聚體和/或二聚體和/或亞基的蛋白質(zhì)產(chǎn)量總結(jié)于表2中。發(fā)酵方法的蛋白質(zhì)產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)更高，可高達(dá)180mg/L。表2：重組人血紅蛋白通過搖瓶和發(fā)酵的蛋白質(zhì)產(chǎn)量蛋白質(zhì)培養(yǎng)方法蛋白質(zhì)產(chǎn)量單體-α搖瓶20mg/L至40mg/L單體-β?lián)u瓶20mg/L至40mg/L單體-γ1搖瓶20mg/L至40mg/L單體-γ2搖瓶20mg/L至40mg/L二聚體-αβ?lián)u瓶5mg/L至10mg/L二聚體-αγ1搖瓶5mg/L至10mg/L四聚體-2αβ2搖瓶5mg/L至10mg/L單體-γ1發(fā)酵180mg/L四聚體-2αβ2發(fā)酵30mg/L至40mg/L實施例4用于癌細(xì)胞系的培養(yǎng)和試劑將癌細(xì)胞(HepG2)在具有10％胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的DMEM(Invitrogen)中在37℃下進(jìn)行培養(yǎng)。對于常氧條件，在環(huán)境O2濃度和5％CO2下孵育細(xì)胞；對于缺氧條件，在0.1％至0.5％O2(QuorumFC-7自動CO2/O2/N2氣體混合器)和5％CO2下孵育細(xì)胞。實施例5癌細(xì)胞中的活細(xì)胞縮時顯微術(shù)將癌細(xì)胞(例如HepG2肝癌細(xì)胞)接種到玻璃底微孔培養(yǎng)皿(MatTekCorporation)上。使用裝備有氣氛/溫度控制室和用于多位置采集的電動平臺的ZeissObserverZ1寬視野顯微鏡來采集在限定變焦(63x、20x)下的活細(xì)胞。在經(jīng)0.1％O2和5％CO2(預(yù)先混合)凈化的封閉活細(xì)胞成像系統(tǒng)中進(jìn)行孵育。使細(xì)胞暴露于經(jīng)熒光標(biāo)記的重組血紅蛋白亞基(α、β、γ1、γ2)持續(xù)15分鐘，之后每隔3分鐘采集圖像，持續(xù)2小時的時間。使用MetaMorph軟件(MolecularDevice)將圖像去卷積并壓制成縮時影片。圖像示于圖10中。實施例6(a)重組血紅蛋白四聚體(2αβ2)對癌細(xì)胞異種移植物的體內(nèi)效力在該實施例中使用裸balb/c小鼠(5周至7周)，并且在實驗之前允許其適應(yīng)一周。向小鼠皮下接種在100μl新鮮培養(yǎng)基中的2x106個癌細(xì)胞。10天之后，將小鼠隨機分成對照組和處理組。對照組接受100μlPBS，處理組(第2至6組)每周(每周兩次，持續(xù)4周)腹膜內(nèi)接受藥物。吉西他濱是一種抗癌(“抗腫瘤性”或“細(xì)胞毒性”)化學(xué)治療性藥物，并且在第2組、第4組和第6組中使用。通過卡尺測量腫瘤尺寸并使用下式計算腫瘤體積：(長度x寬度2)/2。結(jié)果示于圖13中。結(jié)果顯示，重組血紅蛋白四聚體(2αβ2)可抑制腫瘤細(xì)胞的生長。(b)重組血紅蛋白四聚體(2αγ12)對癌細(xì)胞異種移植物的體內(nèi)效力在該實施例中使用裸balb/c小鼠(5周至7周)，并且在實驗之前允許其適應(yīng)一周。向小鼠皮下接種在100μl新鮮培養(yǎng)基中的2x106個癌細(xì)胞。10天之后，將小鼠隨機分成對照組和處理組。對照組接受100μlPBS，處理組(第2至6組)每周(每周兩次，持續(xù)4周)腹膜內(nèi)接受藥物。吉西他濱是一種抗癌(“抗腫瘤性”或“細(xì)胞毒性”)的化學(xué)治療性藥物，并且在第2組、第4組和第6組中使用。通過卡尺測量腫瘤尺寸并使用下式計算腫瘤體積：(長度x寬度2)/2。結(jié)果示于圖14中。結(jié)果顯示，重組血紅蛋白四聚體(2αγ12)可抑制腫瘤細(xì)胞的生長。當(dāng)與其他化學(xué)治療性藥物(吉西他濱)組合時，重組血紅蛋白四聚體還產(chǎn)生更好的結(jié)果。觀察到對癌癥治療、抑制轉(zhuǎn)移和/或降低復(fù)發(fā)的協(xié)同效應(yīng)。工業(yè)適用性本發(fā)明的重組血紅蛋白蛋白質(zhì)和/或四聚體和/或二聚體和/或亞基可用于氧合，在靶向可能對用于癌癥的常規(guī)治療性藥物具有抗性的癌細(xì)胞或組織或腫瘤中是有用的。本發(fā)明經(jīng)化學(xué)修飾的重組血紅蛋白蛋白質(zhì)、四聚體和/或二聚體和/或亞基在體內(nèi)還能夠被裂解或者在體內(nèi)是可降解的，使得對所施用的受試者不產(chǎn)生細(xì)胞毒效應(yīng)。配置成與一種或多種常規(guī)治療性藥物連接的重組血紅蛋白蛋白質(zhì)和/或四聚體和/或二聚體和/或亞基可克服患者中一些類型的癌癥中或者癌癥的某些階段中的抗性問題。重組血紅蛋白蛋白質(zhì)和/或四聚體和/或二聚體和/或亞基易于配制成藥物組合物，并且包含治療有效量的連接有或未連接有一種或多種治療性藥物的重組血紅蛋白蛋白質(zhì)和/或四聚體和/或二聚體和/或亞基的所述藥物組合物可用于多種應(yīng)用，包括使組織氧合、治療失血性休克和缺氧疾病，和/或靶向抗藥性癌細(xì)胞/組織。序列表<110>黃炳镠<120>用于癌癥靶向治療的包含基于重組血紅蛋白蛋白質(zhì)或亞基的治療劑的藥物組合物<130>P7797US01<150>US62/019,925<151>2014-07-02<150>US14752999<151>2015-06-28<160>4<170>PatentIn版本3.5<210>1<211>141<212>PRT<213>智人<400>1ValLeuSerProAlaAspLysThrAsnValLysAlaAlaTrpGlyLys151015ValGlyAlaHisAlaGlyGluTyrGlyAlaGluAlaLeuGluArgMet202530PheLeuSerPheProThrThrLysThrTyrPheProHisPheAspLeu354045SerHisGlySerAlaGlnValLysGlyHisGlyLysLysValAlaAsp505560AlaLeuThrAsnAlaValAlaHisValAspAspMetProAsnAlaLeu65707580SerAlaLeuSerAspLeuHisAlaHisLysLeuArgValAspProVal859095AsnPheLysLeuLeuSerHisCysLeuLeuValThrLeuAlaAlaHis100105110LeuProAlaGluPheThrProAlaValHisAlaSerLeuAspLysPhe115120125LeuAlaSerValSerThrValLeuThrSerLysTyrArg130135140<210>2<211>146<212>PRT<213>智人<400>2ValHisLeuThrProGluGluLysSerAlaValThrAlaLeuTrpGly151015LysValAsnValAspGluValGlyGlyGluAlaLeuGlyArgLeuLeu202530ValValTyrProTrpThrGlnArgPhePheGluSerPheGlyAspLeu354045SerThrProAspAlaValMetGlyAsnProLysValLysAlaHisGly505560LysLysValLeuGlyAlaPheSerAspGlyLeuAlaHisLeuAspAsn65707580LeuLysGlyThrPheAlaThrLeuSerGluLeuHisCysAspLysLeu859095HisValAspProGluAsnPheArgLeuLeuGlyAsnValLeuValCys100105110ValLeuAlaHisHisPheGlyLysGluPheThrProProValGlnAla115120125AlaTyrGlnLysValValAlaGlyValAlaAsnAlaLeuAlaHisLys130135140TyrHis145<210>3<211>146<212>PRT<213>智人<400>3GlyHisPheThrGluGluAspLysAlaThrIleThrSerLeuTrpGly151015LysValAsnValGluAspAlaGlyGlyGluThrLeuGlyArgLeuLeu202530ValValTyrProTrpThrGlnArgPhePheAspSerPheGlyAsnLeu354045SerSerAlaSerAlaIleMetGlyAsnProLysValLysAlaHisGly505560LysLysValLeuThrSerLeuGlyAspAlaThrLysHisLeuAspAsp65707580LeuLysGlyThrPheAlaGlnLeuSerGluLeuHisCysAspLysLeu859095HisValAspProGluAsnPheLysLeuLeuGlyAsnValLeuValThr100105110ValLeuAlaIleHisPheGlyLysGluPheThrProGluValGlnAla115120125SerTrpGlnLysMetValThrAlaValAlaSerAlaLeuSerSerArg130135140TyrHis145<210>4<211>146<212>PRT<213>智人<400>4GlyHisPheThrGluGluAspLysAlaThrIleThrSerLeuTrpGly151015LysValAsnValGluAspAlaGlyGlyGluThrLeuGlyArgLeuLeu202530ValValTyrProTrpThrGlnArgPhePheAspSerPheGlyAsnLeu354045SerSerAlaSerAlaIleMetGlyAsnProLysValLysAlaHisGly505560LysLysValLeuThrSerLeuGlyAspAlaIleLysHisLeuAspAsp65707580LeuLysGlyThrPheAlaGlnLeuSerGluLeuHisCysAspLysLeu859095HisValAspProGluAsnPheLysLeuLeuGlyAsnValLeuValThr100105110ValLeuAlaIleHisPheGlyLysGluPheThrProGluValGlnAla115120125SerTrpGlnLysMetValThrGlyValAlaSerAlaLeuSerSerArg130135140TyrHis145當(dāng)前第1頁1 2 3