本方法涉及天冬氨酸的修飾,抑制天冬酰亞胺形成的方法。
背景技術(shù):
蛋白質(zhì)的化學(xué)合成作為當今世界重要的科學(xué)前沿領(lǐng)域,很多國家在這個領(lǐng)域投入了大量的人力物力財力。而我國在蛋白質(zhì)化學(xué)合成的領(lǐng)域工作還比較少。本項研究將從蛋白質(zhì)的合成方法入手,開展相關(guān)研究。
基于Fmoc保護的固相多肽合成技術(shù)是目前應(yīng)用比較廣泛的合成多肽的方法。當多肽合成儀出現(xiàn)以后,大大提高了合成多肽的效率。但是,固相多肽合成技術(shù)還有許多制約其應(yīng)用的缺陷,比如在堿性條件下去除Fmoc保護基的時候會產(chǎn)生副產(chǎn)物天冬酰亞胺(aspartimide)。
如機理1所示,在堿性條件下,肽鏈中β羧基位叔丁基保護的天冬氨酸,其臨近的氨基酸為甘氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、蛋氨酸、精氨酸時容易生成含有天冬酰亞胺的副產(chǎn)物。這種副產(chǎn)物極易消旋,且在后處理過程中可能進一步開環(huán)生成消旋的多肽或異構(gòu)的β多肽,以及相應(yīng)的哌啶衍生物。在合成較長多肽時,這一副反應(yīng)愈加明顯。隨著合成多肽序列的增長,這些副產(chǎn)物不僅大大降低了目標多肽產(chǎn)物的產(chǎn)率,更因為副產(chǎn)物與目標產(chǎn)物相似的理化性質(zhì),極大的增加了分離的難度和成本。通常情況下,在長度大于30個氨基酸的多肽序列中混入相應(yīng)的天冬亞酰胺副產(chǎn)物,用液相色譜難以純化出相應(yīng)的目標多肽產(chǎn)物。
為了解決這一問題,研究者們提出了一系列的解決方案:包括保護α氨基、加入添加劑中和去除Fmoc保護基必須的堿性條件以及增大β羧酸保護基體積等。這些方法對某些多肽的合成取得了良好的效果,但是同時也存在著脫保護基困難、添加劑價格昂貴,且脫Fmoc效率低下、相應(yīng)天冬氨酸衍生物制備困難且易分解,效果受氨基酸序列影響較大等局限性。找到抑制天冬酰亞胺副產(chǎn)物生成的更好方案,是高效高產(chǎn)率制備出含更多氨基酸的多肽片斷和蛋白質(zhì)、并進行更深入研究所必須的物質(zhì)保障。為了蛋白質(zhì)合成的進一步研究,我們將從抑制天冬酰亞胺生成的角度研究提高目標多肽序列產(chǎn)率和純度的解決方案。
技術(shù)實現(xiàn)要素:
本發(fā)明在天冬氨酸的β位引入一個較大體積的巰基基團來阻止天冬酰亞胺的形成。本發(fā)明的解決方案從分子構(gòu)象對化學(xué)反應(yīng)活性的影響這一角度出發(fā),設(shè)計出β位含巰基取代的天冬氨酸衍生物,通過位阻及分子構(gòu)象抑制天冬酰亞胺的形成。
本發(fā)明的結(jié)構(gòu)式
縮寫為
本發(fā)明的機理如機理2所示,從易得的天冬氨酸衍生物a出發(fā)合成得到化合物b(R為體積較大的基團)。衍生物b在多肽合成中縮合得到殘基c,在后續(xù)反應(yīng)條件中若要形成天冬酰亞胺,需經(jīng)過位阻極大的構(gòu)象A,這一副反應(yīng)將被大大抑制??紤]到取代基可能對肽鍵形成造成的影響,我們將選擇不同的巰基保護基并從中篩選出效果最好的衍生物。
得到化合物b后,本發(fā)明將選擇一系列易形成天冬酰亞胺的序列,例如H-Lys-Asp-Gly-Tyr-Ile-OH,,充分評估抑制天冬酰亞胺形成的效果。
附圖說明
圖1是Fmoc-Lys-Xaa-Gly-Tyr-Ile-OH(Xaa是化合物1)LC-MS的紫外吸收圖,
圖2是Fmoc-Lys-Xaa-Gly-Tyr-Ile-OH(Xaa是化合物1)LC-MS的豐度圖,
圖3是Fmoc-Lys-Xaa-Gly-Tyr-Ile-OH(Xaa是化合物1)LC-MS22.65分鐘的MS圖,其中938.15是化合物8的分子量,
圖4是Fmoc-Lys-Xaa-Gly-Tyr-Ile-OH(Xaa是化合物1)LC-MS25.02分鐘的MS圖,其中920.12是天冬酰亞胺的分子量,
實施例
(1)化合物5的合成:將化合物1(1g,3mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(10ml)中,加入N,N-二異丙基乙胺(0.8ml,4.5mmol)和丙烯基溴(0.34ml,4.44mmol)。室溫反應(yīng)攪拌過夜,用薄層層析監(jiān)測反應(yīng),待反應(yīng)完成后加入酸終止反應(yīng)。加入乙酸乙酯稀釋反應(yīng),分別用水和飽和食鹽水洗滌有機層,用無水硫酸鎂干燥有機相,抽濾,旋干后過硅膠柱,洗脫劑為石油醚:乙酸乙酯(9:1),最終得到無色油狀,產(chǎn)率95%。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.87(dddd,J=5.3,5.6,10.2,16.9Hz,1H),5.48(br d,J=8.4Hz,1H),5.31(dq,J=16.8,1.5Hz,1H),5.22(dq,J=10.5,1.1Hz,1H),4.65(ddt,J=13.0,5.5,1.5Hz,1H),4.63(ddt,J=13.4,
5.7,1.5Hz,1H),4.54(dt,J=4.5,8.8Hz,1H),2.92(dd,J=4.6,17.1Hz,1H),2.91(dd,J=4.6,16.9Hz,1H),1.46(s,9H),1.45(s,9H)ppm;13C NMR(100MHz,CDCl3)δ171.1,170.2,155.6,131.7,118.6,81.7,80.1,66.2,50.3,38.0,28.4,28.1ppm;
(2)化合物3的合成:將化合物2(0.26ml,1.33mmol)溶于乙醚中,將反應(yīng)體系降到0℃,滴加磺酰氯(0.11ml,1.33mmol)。在0℃反應(yīng)10分鐘后,將溶于丙酮的4-甲基-硫代苯磺酸鉀鹽(617.7mg,2.66mmol)滴加于反應(yīng)體系中。逐步升溫至室溫,并反應(yīng)45分鐘。用薄層層析監(jiān)測反應(yīng),待反應(yīng)完成后加入乙酸乙酯稀釋反應(yīng),分別用水和飽和食鹽水洗滌有機層,用無水硫酸鎂干燥有機相,抽濾,旋干后過硅膠柱,洗脫劑為石油醚:乙酸乙酯(14:1),最終得到無色油狀,產(chǎn)率76%。1H NMR,13C NMR來自DOI:10.1021/jacs.6b01202。
(3)化合物6的合成:將化合物5(520.8mg,1.58mmol)溶于超干四氫呋喃中,氬氣保護,并將溫度降至-78℃。滴加LiHMDS(5.16mmol)并反應(yīng)1小時。將溶于超干四氫呋喃的化合物3(437.2mg,1.58mmol)滴加在反應(yīng)溶液中并反應(yīng)2小時。用薄層層析監(jiān)測反應(yīng),待反應(yīng)完成后加入1M鹽酸終止反應(yīng)。加入乙酸乙酯稀釋反應(yīng),分別用1M鹽酸、水和飽和食鹽水洗滌有機層,用無水硫酸鎂干燥有機相,抽濾,旋干后過硅膠柱,洗脫劑為石油醚:乙酸乙酯(9:1),最終得到黃色油狀,產(chǎn)率71%。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.00–5.81(m,1H),5.67(d,J=9.6Hz,1H),5.38(d,J=16.4Hz,1H),5.32–5.20(m,1H),,4.96–4.78(m,1H),4.65(qt,J=18.0,8.9Hz,2H),3.94(d,J=4.3Hz,1H),1.47(s,9H),1.43(s,9H),1.32(s,9H);13C NMR(101MHz,CDCl3)δ169.84,169.48,154.96,131.47,118.77,83.11,81.59,66.33,54.83,54.48,48.41,29.75(三碳重疊),28.26(三碳重疊),27.90(三碳重疊)。
(4)化合物7的合成:將化合物6(313.3mg,0.58mmol)和四三苯基膦鈀(33.4mg,0.029mmol)溶于超干四氫呋喃中,氬氣保護,加入N-甲基苯胺(0.13ml,1.16mmol)。室溫反應(yīng)。。用薄層層析監(jiān)測反應(yīng),待反應(yīng)完成后直接旋干并過硅膠柱,洗脫劑為石油醚:乙酸乙酯(3:1,1%AcOH),最終得到黃色油狀,產(chǎn)率76%。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.81(5.39)*(d,J=8.5Hz,1H),4.86(4.79)*(d,J=5.7Hz,1H),3.98(3.93)*(d,J=3.2Hz,1H),1.47(s,9H),1.41(s,9H),1.36(s,9H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ174.31(173.85)*,169.86(168.10)*,156.05,83.91(83.11)*,80.64,59.01(57.41)*,55.03(54.37)*,48.57,29.75,28.24,27.88.帶有“*”表示有一對旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體。
(5)化合物1的合成:將化合物7(153.6mg,0.29mmol)溶于二氧六環(huán)(含4MHCl)中,并加入三乙基硅烷(0.46ml,2.9mmol),室溫反應(yīng)4小時。用氬氣將二氧六環(huán)(含4MHCl)和三乙基硅烷吹干。用二氯甲烷溶解中間產(chǎn)物。加入Fmoc-OSu(391.3mg,1.16mmol)和三乙胺(0.16ml,1.16mmol),室溫反應(yīng)過夜。用薄層層析監(jiān)測反應(yīng),待反應(yīng)完成后加入1M鹽酸終止反應(yīng)。加入乙酸乙酯稀釋反應(yīng),分別用1M鹽酸、水和飽和食鹽水洗滌有機層,用無水硫酸鎂干燥有機相,抽濾,旋干后過硅膠柱,洗脫劑為石油醚:乙酸乙酯(1:1,1%AcOH),最終得到黃色油狀,產(chǎn)率63%。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.75(d,J=12.9Hz,2H),7.63(d,J=7.3Hz,2H),7.40(d,J=7.3Hz,2H),7.31(d,J=14.1Hz,2H),6.10(d,J=9.3Hz,1H),5.04(d,J=6.5Hz,1H),4.42(d,J=7.2Hz,2H),4.08(s,1H),1.50(s,,9H),1.35(s,9H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ174.48,169.37,156.51,143.73(兩碳重疊),141.24(兩碳重疊),129.00(兩碳重疊),128.19(兩碳重疊),127.67(兩碳重疊),125.24(兩碳重疊),84.05,67.64,57.46,54.57,48.72,47.04,29.77,27.88。
(6)化合物8的合成:通過多肽固相合成法(solid phase peptide synthesis簡寫為SPPS)合成Fmoc-Lys-Xaa-Gly-Tyr-Ile-OH(Xaa是化合物1)。
根據(jù)LC-MS,圖1是LC-MS的紫外吸收圖,圖2是LC-MS的豐度圖,圖3是22.65分鐘的MS圖,其中938.15是化合物11的分子量,圖4是25.02分鐘的MS圖,其中920.12是天冬酰亞胺的分子量,根據(jù)化合物的豐度,可以斷定此方法部分有效的抑制了天冬酰亞胺的形成。