本發(fā)明涉及一種通過(guò)固態(tài)發(fā)酵鐮孢菌Fusarium sp.B10.1(CGMCC No.11819)產(chǎn)生新抗菌劑sambacide的方法；具體來(lái)說(shuō)是發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新抗菌劑sambacide。屬微生物代謝產(chǎn)物分離分析領(lǐng)域，

本發(fā)明使用的微生物：鐮孢菌Fusarium sp.B10.1(保藏號(hào)：CGMCC No.11819)保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏單位地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)；保藏時(shí)間：2016年1月15日。

背景技術(shù)：
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鐮刀菌屬(Fusarium)又稱鐮孢霉屬，在分類(lèi)學(xué)上，鐮刀菌屬無(wú)性時(shí)期原屬于半知菌亞門(mén)，瘤座菌目。有性時(shí)期為子囊菌亞門(mén)，有性態(tài)常為赤霉屬(Gibberella)。

鐮刀菌屬的各個(gè)種廣泛地分布在土壤和有機(jī)體內(nèi)，并且曾從北極的永久凍土中和撒哈拉大沙漠的砂土中分離到。它們?cè)跍貛Ш蜔釒У貐^(qū)的耕作土壤中生長(zhǎng)良好，是經(jīng)常被植物病理學(xué)家分離到的真菌之一。鐮刀菌也可以造成人類(lèi)和動(dòng)物的疾病，大量的貯存物的腐爛，常常產(chǎn)生有毒物質(zhì)，污染人們的食物和牲畜的飼料。正如其他許多土壤真菌一樣，它們適應(yīng)于在土壤中存活，其機(jī)能之一是能夠在形態(tài)學(xué)和生理學(xué)上對(duì)于新的環(huán)境具有很快的變化和適應(yīng)的能力。它們能夠生活在廣闊范圍的深層底土之中，也可以從許多貯存的食物和化學(xué)物品中分離出來(lái)，甚至在飛機(jī)的油箱內(nèi)，也曾同樹(shù)脂芽枝霉一道被分離出來(lái)。

鐮刀菌屬?gòu)V泛分布與自然界中，鐮刀菌能產(chǎn)生植物刺激素(赤霉素)，可使農(nóng)作物增產(chǎn)；有些種可產(chǎn)生纖維酶、脂肪酶、果膠酶等；還有些種可產(chǎn)生毒素，污染糧食、蔬菜和飼料，人畜誤食會(huì)中毒；鐮刀菌也能侵染多種經(jīng)濟(jì)作物，引起水稻、小麥、玉米、蠶豆、蔬菜等的赤霉病，棉花的枯萎病，香蕉枯萎病等。

Integracides是一類(lèi)4,4-二甲基麥角甾烷化合物，是能夠非常有效的選擇HIV-1整合酶的抑制劑，具有各類(lèi)生物活性包括抗菌抗真菌活性，和細(xì)胞毒活性。HIV-1整合酶抑制劑的構(gòu)效關(guān)系研究表明，integracides的相關(guān)天然產(chǎn)物3-硫酸酯類(lèi)比初始化合物有更強(qiáng)的活。

三萜類(lèi)化合物(例如：integracides)已報(bào)道從Vesonder和Burmeister的Fusarium活性代謝產(chǎn)物分離Fusarium，尋找潛在的植物毒性的次級(jí)代謝產(chǎn)物。因此，從Fusarium spp.尋找integracides的相關(guān)化合物具有顯著的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的旨在通過(guò)鐮孢菌Fusarium sp.B10.1固體發(fā)酵產(chǎn)生新抗菌劑sambacide的方法。本發(fā)明提供一種轉(zhuǎn)化率高，設(shè)備要求低，簡(jiǎn)便易操作，綠色無(wú)污染，適合產(chǎn)業(yè)化產(chǎn)生sambacide的方法。

本發(fā)明的目的是通過(guò)以下具體技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：一種通過(guò)鐮孢菌Fusarium sp.B10.1發(fā)酵產(chǎn)生新抗菌劑sambacide，其特征在于通過(guò)鐮孢菌Fusarium sp.B10.1固體發(fā)酵產(chǎn)生一個(gè)新化合物為sambacide，其化學(xué)結(jié)構(gòu)為：

本發(fā)明通過(guò)鐮孢菌Fusarium sp.B10.1發(fā)酵產(chǎn)生新抗菌劑sambacide的方法，其特征在于按如下步驟進(jìn)行固體發(fā)酵：

(1)將擬用微生物鐮孢菌Fusarium sp.B10.1首先進(jìn)行活化，即將Fusarium sp.B10.1接種到經(jīng)過(guò)121℃高溫滅菌處理的PDA斜面培養(yǎng)基后，于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-7d后，置于4℃冰箱中；

(2)將活化的菌種接到PDB種子培養(yǎng)基中，于恒溫?fù)u床中培養(yǎng)3-7d；

(3)取洗凈的土豆切成丁后，取適量的土豆丁置于組織培養(yǎng)瓶中；將裝有土豆的組織培養(yǎng)瓶加蓋包裝后置于121℃高溫滅菌箱中滅菌30min，取出后將組織培養(yǎng)瓶冷卻；

(4)將步驟(2)的種子培養(yǎng)基在無(wú)菌環(huán)境下接種到經(jīng)過(guò)步驟(3)前處理的土豆上，加蓋后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5-40d后取出；

(5)經(jīng)微生物鐮孢菌Fusarium sp.B10.1發(fā)酵后的土豆培養(yǎng)基經(jīng)過(guò)甲醇超聲提取、過(guò)濾和濃縮得到粗提物；分離粗提物得到的sambacide的結(jié)構(gòu)式如下：

(6)經(jīng)TLC薄層層析法檢測(cè)，然后經(jīng)過(guò)硅膠柱進(jìn)行分離，分離過(guò)程采用梯度洗脫，洗脫劑為氯仿和甲醇混合物，其中氯仿：甲醇按20:1—5:1混合，然后經(jīng)分離得到的化合物上凝膠柱純化，通過(guò)1D/2D NMR以及HRESIMS鑒定得到新化合物結(jié)構(gòu)；

(7)采用如下HPLC色譜條件測(cè)定sambacide的產(chǎn)量。

所述發(fā)酵方法為固態(tài)發(fā)酵。

所述發(fā)酵時(shí)間為5-40d。

所述發(fā)酵溫度為20-30℃。

所述提取溶劑為甲醇。

按如下HPLC條件進(jìn)行含量測(cè)定：

(1)色譜柱：ODS高效液相色譜柱；

(2)梯度洗脫程序：0–10min,30–60％乙腈；10–20min,60％乙腈；20–25,60–30％乙腈；

(3)檢測(cè)波長(zhǎng)：247nm；

(4)流速：1.5mL/min；

(5)柱溫：25℃。

本發(fā)明土豆培養(yǎng)基經(jīng)鐮刀霉菌Fusarium sp.B10.1發(fā)酵，經(jīng)過(guò)合適的溶劑超聲提取，過(guò)濾，濃縮后，經(jīng)硅膠和凝膠柱層析分離得到一個(gè)新的化合物sambacide。結(jié)合TLC薄層層析法以及高效液相色譜法，可檢測(cè)到大量的sambacide的產(chǎn)生。Sambacide對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有顯著的抗菌作用，是一個(gè)新抗菌劑。

本發(fā)明方法是一種高效的，具有創(chuàng)新性的，反應(yīng)條件溫和的，綠色無(wú)污染的，易擴(kuò)大化生產(chǎn)的，操作設(shè)備簡(jiǎn)單的大量產(chǎn)生抗菌化合物sambacide的方法，不僅滿足了現(xiàn)代環(huán)境保護(hù)和低碳經(jīng)濟(jì)的需求，而且為后期工業(yè)化量產(chǎn)的進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明中新化合物sambacide的¹H-NMR；

圖2為本發(fā)明中新化合物sambacide的¹³C-NMR；

圖3為本發(fā)明中新化合物sambacide的HPLC色譜圖；

圖4為本發(fā)明中Fusarium sp.B10.1甲醇浸膏的HPLC色譜圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明，但本發(fā)明不局限于該具體實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明涵蓋了權(quán)利要求范圍內(nèi)的所有可能的備選方案、改進(jìn)方案和等效方案。

本發(fā)明具體技術(shù)方案是：

(1)將擬用微生物Fusarium sp.B10.1首先進(jìn)行活化，即將Fusarium sp.B10.1接種到經(jīng)過(guò)121℃高溫滅菌處理的PDA斜面培養(yǎng)基后，于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-7d后，置于4℃冰箱中；

(2)將活化的菌種接到PDB種子培養(yǎng)基中，于恒溫?fù)u床中培養(yǎng)3-7d；

(3)取洗凈的土豆切成丁后，取適量的土豆丁置于組織培養(yǎng)瓶中；將裝有土豆的組織培養(yǎng)瓶加蓋包裝后置于121℃高溫滅菌箱中滅菌30min，取出后將組織培養(yǎng)瓶冷卻；

(4)將步驟(2)的種子培養(yǎng)基在無(wú)菌環(huán)境下接種到經(jīng)過(guò)步驟(3)前處理的土豆上，加蓋后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5-40d后取出。

(5)經(jīng)微生物Fusarium sp.B10.1發(fā)酵后的土豆培養(yǎng)基經(jīng)過(guò)甲醇超聲提取、過(guò)濾和濃縮得到粗提物；分別分離粗提物得到的sambacide的結(jié)構(gòu)式如下：

(6)經(jīng)TLC薄層層析法檢測(cè)，然后經(jīng)過(guò)硅膠柱進(jìn)行分離，分離過(guò)程采用梯度洗脫，洗脫劑為氯仿：甲醇(20:1—5:1)，然后經(jīng)分離得到的化合物上凝膠柱純化，通過(guò)1D/2D NMR以及HRESIMS鑒定得到新化合物結(jié)構(gòu)。

(7)采用二倍梯度稀釋法對(duì)化合物sambacide進(jìn)行抗菌活性測(cè)試。結(jié)果顯示：sambacide金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有顯著的抑菌作用(MIC≤16μg/mL)。

(8)采用如下HPLC色譜條件測(cè)定sambacide的產(chǎn)量。

a、色譜柱：ODS高效液相色譜柱；

b、梯度洗脫程序：0–10min,30–60％乙腈；10–20min,60％乙腈；20–25,60–30％乙腈；

c、檢測(cè)波長(zhǎng)：247nm；

d、流速：1.5mL/min；

e、柱溫：25℃。

實(shí)施例1

(1)將擬用微生物鐮刀霉菌Fusarium sp.B10.1首先進(jìn)行活化，即將Fusarium sp.B10.1接種到經(jīng)過(guò)121℃高溫滅菌處理的PDA斜面培養(yǎng)基后，于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d后，置于4℃冰箱中；

(2)將活化的菌種接到PDB種子培養(yǎng)基中，于恒溫?fù)u床中培養(yǎng)3d；

(3)取洗凈的土豆切成丁后，取適量的土豆丁置于組織培養(yǎng)瓶中；將裝有土豆的組織培養(yǎng)瓶加蓋包裝后置于121℃高溫滅菌箱中滅菌30min，取出后將組織培養(yǎng)瓶冷卻；

(4)將步驟(2)的種子培養(yǎng)基在無(wú)菌環(huán)境下接種到經(jīng)過(guò)步驟(3)前處理的土豆上，加蓋后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30d后取出；

(5)經(jīng)微生物鐮孢菌Fusarium sp.B10.1發(fā)酵后的土豆培養(yǎng)基經(jīng)過(guò)甲醇超聲提取、過(guò)濾和濃縮得到粗提物；分別分離粗提物得到的sambacide的結(jié)構(gòu)式如下：

(6)經(jīng)TLC薄層層析法檢測(cè)，然后經(jīng)過(guò)硅膠柱進(jìn)行分離，分離過(guò)程采用梯度洗脫，洗脫劑為氯仿：甲醇(20:1—5:1)，然后經(jīng)分離得到的化合物上凝膠柱純化，通過(guò)1D/2D NMR以及HRESIMS鑒定得到化合物結(jié)構(gòu)；

(7)采用如下HPLC色譜條件測(cè)定sambacide的產(chǎn)量為17.27±0.52g/Kg

a、色譜柱：ODS高效液相色譜柱；

b、梯度洗脫程序：0–10min,30–60％乙腈；10–20min,60％乙腈；20–25,60–30％乙腈；

c、檢測(cè)波長(zhǎng)：247nm；

d、流速：1.5mL/min；

e、柱溫：25℃。

實(shí)施例2

(1)將擬用微生物鐮刀霉菌Fusarium sp.B10.1首先進(jìn)行活化，即將Fusarium sp.B10.1接種到經(jīng)過(guò)121℃高溫滅菌處理的PDA斜面培養(yǎng)基后，于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d后，置于4℃冰箱中；

(2)將活化的菌種接到PDB種子培養(yǎng)基中，于恒溫?fù)u床中培養(yǎng)3d；

(3)取洗凈的土豆切成丁后，取適量的土豆丁置于組織培養(yǎng)瓶中；將裝有土豆的組織培養(yǎng)瓶加蓋包裝后置于121℃高溫滅菌箱中滅菌30min，取出后將組織培養(yǎng)瓶冷卻；

(4)將步驟(2)的種子培養(yǎng)基在無(wú)菌環(huán)境下接種到經(jīng)過(guò)步驟(3)前處理的土豆上，加蓋后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20d后取出。

(5)經(jīng)微生物鐮刀霉菌Fusarium sp.B10.1發(fā)酵后的土豆培養(yǎng)基經(jīng)過(guò)甲醇超聲提取、過(guò)濾和濃縮得到粗提物；分別分離粗提物得到的sambacide的結(jié)構(gòu)式如下：

(6)經(jīng)TLC薄層層析法檢測(cè)，然后經(jīng)過(guò)硅膠柱進(jìn)行分離，分離過(guò)程采用梯度洗脫，洗脫劑為氯仿：甲醇(20:1—5:1)，然后經(jīng)分離得到的化合物上凝膠柱純化，通過(guò)1D/2D NMR以及HRESIMS鑒定得到化合物結(jié)構(gòu)。

(7)采用如下HPLC色譜條件測(cè)定sambacide的產(chǎn)量為19.045±0.819g/Kg

a、色譜柱：ODS高效液相色譜柱；

b、梯度洗脫程序：0–10min,30–60％乙腈；10–20min,60％乙腈；20–25,60–30％乙腈.；

c、檢測(cè)波長(zhǎng)：247nm；

d、流速：1.5mL/min；

e、柱溫：25℃。

實(shí)施例3

(1)將擬用微生物鐮刀霉菌Fusarium sp.B10.1首先進(jìn)行活化，即將Fusarium sp.B10.1接種到經(jīng)過(guò)121℃高溫滅菌處理的PDA斜面培養(yǎng)基后，于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d后，置于4℃冰箱中；

(2)將活化的菌種接到PDB種子培養(yǎng)基中，于恒溫?fù)u床中培養(yǎng)3d；

(3)取洗凈的土豆切成丁后，取適量的土豆丁置于組織培養(yǎng)瓶中；將裝有土豆的組織培養(yǎng)瓶加蓋包裝后置于121℃高溫滅菌箱中滅菌30min，取出后將組織培養(yǎng)瓶冷卻；

(4)將步驟(2)的種子培養(yǎng)基在無(wú)菌環(huán)境下接種到經(jīng)過(guò)步驟(3)前處理的土豆上，加蓋后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40d后取出。

(5)經(jīng)微生物鐮刀霉菌Fusarium sp.B10.1發(fā)酵后的土豆培養(yǎng)基經(jīng)過(guò)甲醇超聲提取、過(guò)濾和濃縮得到粗提物；分別分離粗提物得到的sambacide的結(jié)構(gòu)式如下：

(6)經(jīng)TLC薄層層析法檢測(cè)，然后經(jīng)過(guò)硅膠柱進(jìn)行分離，分離過(guò)程采用梯度洗脫，洗脫劑為氯仿：甲醇(20:1—5:1)，然后經(jīng)分離得到的化合物上凝膠柱純化，通過(guò)1D/2D NMR以及HRESIMS鑒定得到化合物結(jié)構(gòu)。

(7)采用如下HPLC色譜條件測(cè)定sambacide的產(chǎn)量為13.265±13.265g/Kg

a、色譜柱：ODS高效液相色譜柱；

b、梯度洗脫程序：0–10min,30–60％乙腈；10–20min,60％乙腈；20–25,60–30％乙腈；

c、檢測(cè)波長(zhǎng)：247nm；

d、流速：1.5mL/min；

e、柱溫：25℃。