本發(fā)明涉及一種從長春花中高效提取長春質(zhì)堿的方法，具體涉及一種利用酶輔助絡(luò)合萃取法從長春花中提取分離長春質(zhì)堿的方法。
背景技術(shù)：
：長春花(Catharanthusroseus)是夾竹桃科長春花屬一種重要的藥用植物，原產(chǎn)南亞、非洲東部及美洲熱帶。在我國主要分布于江蘇、浙江、福建、江西、四川及河南等地。長春花全草均可入藥，含有長春堿、文多靈、長春質(zhì)堿、阿瑪堿、蛇根堿、長春新堿等多種萜類吲哚生物堿，具有很高的藥用價值。其中，長春質(zhì)堿不僅具有抗腫瘤活性，還具有降血糖、血壓、鎮(zhèn)痛等作用，同時，長春質(zhì)堿還是合成長春瑞濱、長春氟寧等長春堿類抗腫瘤藥物的中間體。國內(nèi)外對提取分離長春花生物堿的研究由來已久，但是由于長春花中吲哚生物堿種類較多，且在植物中的含量很低，一般都在萬分之幾，因此長春花中吲哚生物堿的提取分離成為制約長春堿類藥物工業(yè)化發(fā)展的瓶頸。目前，我國相關(guān)企業(yè)的提取技術(shù)得率低、資源浪費大，且產(chǎn)品質(zhì)量達不到國際標(biāo)準(zhǔn)(純度>98％)，只能生產(chǎn)純度較低的粗提物或原料藥，很難滿足國際市場的需求。少數(shù)企業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量雖能達到要求，但得率低，造成了大量的資源浪費和嚴(yán)重的環(huán)境污染。此外，由于我國野生長春花的過度采收，長春花的資源儲量大量銳減，已經(jīng)處于瀕危的邊緣，長春花生物原料的匱乏也嚴(yán)重制約長春堿類藥物產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此如何提高長春花生物資源的利用率，開發(fā)高效分離純化長春花類生物堿的方法，已經(jīng)成為當(dāng)務(wù)之急。在植物活性成分提取過程中，由于植物細胞外存在較厚細胞壁，細胞內(nèi)部的目標(biāo)產(chǎn)物不容易釋放到溶劑中，阻礙了有效成分的提取率。利用生物酶等可以破壞植物細胞外結(jié)構(gòu)，提升目標(biāo)成分的溶出率。萃取分離法以其分離效率高、生產(chǎn)能力大，便于快速連續(xù)和安全操作以及能耗低等優(yōu)點被廣泛研究。根據(jù)萃取原理，在萃取操作中，萃取劑與溶質(zhì)之間不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的萃取稱為物理萃??；萃取劑和溶質(zhì)之間發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的萃取成為化學(xué)萃取。根據(jù)溶質(zhì)與萃取劑之間發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)機理，化學(xué)萃取還可大致分為五類：絡(luò)合反應(yīng)、陽離子交換反應(yīng)、離子締合反應(yīng)、加和反應(yīng)和帶同萃取反應(yīng)等。絡(luò)合萃取是基于可逆絡(luò)合反應(yīng)的原理，溶液中待分離溶質(zhì)與含有絡(luò)合劑的萃取劑接觸，絡(luò)合劑與待分離溶質(zhì)發(fā)生反應(yīng)形成絡(luò)合物，并使其轉(zhuǎn)移至萃取相內(nèi)。然后，根據(jù)溶劑擺動效應(yīng)，進行反萃，溶質(zhì)得以回收，萃取劑循環(huán)使用。因此，絡(luò)合萃取法具有高效性、高選擇性和成本低的優(yōu)點，可以用于長春花中長春堿類生物堿的分離純化。技術(shù)實現(xiàn)要素：為了解決上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種簡單、高效的利用酶輔助絡(luò)合萃取法從長春花中提取分離長春質(zhì)堿的方法。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：利用酶輔助絡(luò)合萃取法從長春花中提取分離長春質(zhì)堿的方法，包括以下步驟：(1)酶輔助超聲提取取長春花地上部分陰干并粉碎，得到長春花干粉，加入混合酶液孵化，過濾，留長春花粉末，在長春花粉末中加入乙醇，并用鹽酸調(diào)節(jié)pH至5.6-6.8，超聲提??；過濾，留提取液，將提取液減壓濃縮，得到濃縮液；(2)絡(luò)合萃取富集以二(2-乙基己基)磷酸作為絡(luò)合劑，石油醚作為稀釋劑，組成萃取體系，對濃縮液進行絡(luò)合萃取，分離上層液，得到富含長春質(zhì)堿的萃取液；(3)反萃分離將富含長春質(zhì)堿的萃取液用稀鹽酸反萃，稀鹽酸層減壓濃縮后，冷凍干燥，得到長春質(zhì)堿粗品；(4)純化將所得的長春質(zhì)堿粗品進行重結(jié)晶，即得。步驟(1)中的混合酶液包括：纖維素酶3-6U/ml、果膠酶4-8U/ml和半纖維素酶6-9U/ml。步驟(1)中的混合酶液pH為4.0-7.0，混合酶液中還包括金屬離子Fe2+、Co2+、Mn2+、Ca2+中的一種或多種，金屬離子的總質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％。所述孵化的溫度為25-50℃，時間為4-6h。所述乙醇的加入量為5倍過濾得到的長春花粉末的重量，乙醇的體積分?jǐn)?shù)為70-80％。步驟(1)中超聲提取3-4次，每次4-6h。步驟(1)和(3)中減壓濃縮的真空度為﹣0.9MPa，轉(zhuǎn)速為150-180轉(zhuǎn)/秒。步驟(2)中二(2-乙基己基)磷酸和石油醚的體積比為1:1-3，萃取體系和濃縮液的體積比為1-3:1，萃取次數(shù)為3-5次。步驟(3)中稀鹽酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1-3％，稀鹽酸與萃取液的體積比為1-3:1，反萃次數(shù)為3-5次。步驟(4)長春質(zhì)堿粗品進行重結(jié)晶的具體方法為：將長春質(zhì)堿粗品用超純水溶解，用氨水將pH調(diào)至8-9后，在20-25℃下攪拌5-6h，然后靜置12-24h，即得。步驟(4)中長春質(zhì)堿粗品用超純水溶解至終濃度為4-6g/L。本發(fā)明的有益效果：1、長春質(zhì)堿的結(jié)構(gòu)中包含胺基，顯示堿性。本發(fā)明根據(jù)長春質(zhì)堿的結(jié)構(gòu)特點，利用酸性的絡(luò)合劑二(2-乙基己基)磷酸，對其進行絡(luò)合萃取，使長春質(zhì)堿和絡(luò)合劑反應(yīng)形成絡(luò)合物，并轉(zhuǎn)移至萃取相內(nèi)。然后，根據(jù)擺動效應(yīng)，利用稀鹽酸進行反萃，使長春質(zhì)堿得以回收，萃取劑循環(huán)使用。2、由于植物細胞外存在較厚細胞壁，細胞內(nèi)部的目標(biāo)產(chǎn)物不容易釋放到溶劑中，阻礙了有效成分的提取。因此本發(fā)明利用纖維素酶、果膠酶、半纖維素酶等破壞植物細胞外結(jié)構(gòu)，提高目標(biāo)成分的溶出率。另外，本發(fā)明還在混合酶液中添加了金屬離子，能夠提高混合酶液中酶的活性，進一步提高目標(biāo)成分的溶出率。3、本發(fā)明能夠從長春花中高效分離長春質(zhì)堿，有效提高了長春花的資源利用率，且絡(luò)合萃取的萃取劑能夠循環(huán)利用，不會造成環(huán)境的污染。4、本發(fā)明的方法分離純化的長春質(zhì)堿純度能夠達到99％以上，回收率可達92％以上，是長春堿類提取物分離純化的一大創(chuàng)新，具有很高的研究和推廣價值。5、本發(fā)明的方法簡單、操作方便、生產(chǎn)成本低，易于工業(yè)化推廣，具有很好的社會和經(jīng)濟效益。附圖說明圖1為本發(fā)明的長春質(zhì)堿純化產(chǎn)物的紫外光譜圖。圖2為長春質(zhì)堿標(biāo)準(zhǔn)品的紫外光譜圖。圖3為本發(fā)明的長春質(zhì)堿純化產(chǎn)物的質(zhì)譜圖。圖4為本發(fā)明的萃取液在230nm下HPLC色譜圖。圖5為本發(fā)明的長春質(zhì)堿純化產(chǎn)物在230nm下HPLC色譜圖。具體實施方式以下結(jié)合實施例對本發(fā)明的具體實施方式作進一步詳細說明。本發(fā)明減壓濃縮所用的設(shè)備為旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器。實施例1利用酶輔助絡(luò)合萃取法從長春花中提取分離長春質(zhì)堿的方法，包括以下步驟：(1)酶輔助超聲提取取100g長春花地上部分陰干并粉碎成粉末，得到長春花干粉，加入400ml混合酶液孵化，孵化的溫度為25℃，時間為6h；孵化結(jié)束后，過濾，留長春花粉末，加入長春花粉末5倍重量的體積分?jǐn)?shù)70％乙醇，并用鹽酸調(diào)節(jié)pH至5.6，超聲提取3次，每次6h；過濾，留提取液，將提取液減壓濃縮，得到濃縮液；所述的混合酶液包括：纖維素酶3U/ml，果膠酶4U/ml，半纖維素酶6U/ml；混合酶液的pH為4.0，混合酶液中還包括金屬離子Ca2+，Ca2+的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％；減壓濃縮的真空度為﹣0.9MPa，轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/秒；(2)絡(luò)合萃取富集以二(2-乙基己基)磷酸(D2EHPA)作為絡(luò)合劑，石油醚作為稀釋劑，組成萃取體系，對濃縮液進行絡(luò)合萃取，D2EHPA和石油醚的體積比為1:1，分離上層液，得到富含長春質(zhì)堿的萃取液；萃取體系和濃縮液的體積比為1:1，萃取次數(shù)為3次；(3)反萃分離將富含長春質(zhì)堿的萃取液用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3％稀鹽酸反萃，稀鹽酸與萃取液的體積比為1:1，反萃次數(shù)為4次，稀鹽酸層減壓濃縮后，冷凍干燥，得到長春質(zhì)堿粗品；減壓濃縮的真空度為﹣0.9MPa，轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/秒；(4)純化將所得的長春質(zhì)堿粗品進行重結(jié)晶，具體方法為：將長春質(zhì)堿粗品用超純水溶解至終濃度為4g/l，用氨水將pH調(diào)至9后，在25℃下攪拌6h，然后靜置24h，即得。實施例2利用酶輔助絡(luò)合萃取法從長春花中提取分離長春質(zhì)堿的方法，包括以下步驟：(1)酶輔助超聲提取取100g長春花地上部分陰干并粉碎成粉末，得到長春花干粉，加入400ml混合酶液孵化，孵化的溫度為30℃，時間為6h；孵化結(jié)束后，過濾，留長春花粉末，加入長春花粉末5倍重量的體積分?jǐn)?shù)70％乙醇，并用鹽酸調(diào)節(jié)pH至5.8，超聲提取4次，每次5h；過濾，留提取液，將提取液減壓濃縮，得到濃縮液；所述的混合酶液包括：纖維素酶4U/ml，果膠酶5U/ml，半纖維素酶7U/ml；混合酶液的pH為5.0；減壓濃縮的真空度為﹣0.9MPa，轉(zhuǎn)速為180轉(zhuǎn)/秒；(2)絡(luò)合萃取富集以D2EHPA作為絡(luò)合劑，石油醚作為稀釋劑，組成萃取體系，對濃縮液進行絡(luò)合萃取，D2EHPA和石油醚的體積比為1:2，分離上層液，得到富含長春質(zhì)堿的萃取液；萃取體系和濃縮液的體積比為2:1，萃取次數(shù)為4次；(3)反萃分離將富含長春質(zhì)堿的萃取液用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3％稀鹽酸反萃，稀鹽酸與萃取液的體積比為2:1，反萃次數(shù)為3次，稀鹽酸層減壓濃縮后，冷凍干燥，得到長春質(zhì)堿粗品；減壓濃縮的真空度為﹣0.9MPa，轉(zhuǎn)速為180轉(zhuǎn)/秒；(4)純化將所得的長春質(zhì)堿粗品進行重結(jié)晶，具體方法為：將長春質(zhì)堿粗品用超純水溶解至終濃度為5g/l，用氨水將pH調(diào)至8后，在20℃下攪拌6h，然后靜置20h，即得。實施例3利用酶輔助絡(luò)合萃取法從長春花中提取分離長春質(zhì)堿的方法，包括以下步驟：(1)酶輔助超聲提取取100g長春花地上部分陰干并粉碎成粉末，得到長春花干粉，加入400ml混合酶液孵化，孵化的溫度為40℃，時間為5h；孵化結(jié)束后，過濾，留長春花粉末，加入長春花粉末5倍重量的體積分?jǐn)?shù)80％乙醇，并用鹽酸調(diào)節(jié)pH至6.2，超聲提取3次，每次5h；過濾，留提取液，將提取液減壓濃縮，得到濃縮液；所述的混合酶液包括：纖維素酶5U/ml，果膠酶8U/ml，半纖維素酶9U/ml；混合酶液的pH為6.0，混合酶液中還包括金屬離子Mn2+，Mn2+的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％；減壓濃縮的真空度為﹣0.9MPa，轉(zhuǎn)速為160轉(zhuǎn)/秒；(2)絡(luò)合萃取富集以D2EHPA作為絡(luò)合劑，石油醚作為稀釋劑，組成萃取體系，對濃縮液進行絡(luò)合萃取，D2EHPA和石油醚的體積比為1:2，分離上層液，得到富含長春質(zhì)堿的萃取液；萃取體系和濃縮液的體積比為3:1，萃取次數(shù)為4次；(3)反萃分離將富含長春質(zhì)堿的萃取液用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％稀鹽酸反萃，稀鹽酸與萃取液的體積比為2:1，反萃次數(shù)為5次，稀鹽酸層減壓濃縮后，冷凍干燥，得到長春質(zhì)堿粗品；減壓濃縮的真空度為﹣0.9MPa，轉(zhuǎn)速為160轉(zhuǎn)/秒；(4)純化將所得的長春質(zhì)堿粗品進行重結(jié)晶，具體方法為：將長春質(zhì)堿粗品用超純水溶解至終濃度為6g/l，用氨水將pH調(diào)至9后，在25℃下攪拌5h，然后靜置12h，即得。實施例4利用酶輔助絡(luò)合萃取法從長春花中提取分離長春質(zhì)堿的方法，包括以下步驟：(1)酶輔助超聲提取取100g長春花地上部分陰干并粉碎成粉末，得到長春花干粉，加入400ml混合酶液孵化，孵化的溫度為50℃，時間為4h；孵化結(jié)束后，過濾，留長春花粉末，加入長春花粉末5倍重量的體積分?jǐn)?shù)80％乙醇，并用鹽酸調(diào)節(jié)pH至6.8，超聲提取4次，每次4h；過濾，留提取液，將提取液減壓濃縮，得到濃縮液；所述的混合酶液包括：纖維素酶6U/ml，果膠酶7U/ml，半纖維素酶8U/ml；混合酶液的pH為7.0，混合酶液中還包括金屬離子Fe2+，F(xiàn)e2+的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％；減壓濃縮的真空度為﹣0.9MPa，轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/秒；(2)絡(luò)合萃取富集以D2EHPA作為絡(luò)合劑，石油醚作為稀釋劑，組成萃取體系，對濃縮液進行絡(luò)合萃取，D2EHPA和石油醚的體積比為1:3，分離上層液，得到富含長春質(zhì)堿的萃取液；萃取體系和濃縮液的體積比為3:1，萃取次數(shù)為5次；(3)反萃分離將富含長春質(zhì)堿的萃取液用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2％稀鹽酸反萃，稀鹽酸與萃取液的體積比為3:1，反萃次數(shù)為3次，稀鹽酸層減壓濃縮后，冷凍干燥，得到長春質(zhì)堿粗品；減壓濃縮的真空度為﹣0.9MPa，轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/秒；(4)純化將所得的長春質(zhì)堿粗品進行重結(jié)晶，具體方法為：將長春質(zhì)堿粗品用超純水溶解至終濃度為4g/l，用氨水將pH調(diào)至9后，在25℃下攪拌6h，然后靜置24h，即得。對照例1從長春花中提取分離長春質(zhì)堿的方法，包括以下步驟：(1)無酶輔助超聲提取取100g長春花地上部分陰干并粉碎成粉末，得到長春花干粉，加入長春花干粉5倍重量的體積分?jǐn)?shù)80％乙醇，并用鹽酸調(diào)節(jié)pH至6.8，超聲提取4次，每次6h；過濾，留提取液，將提取液減壓濃縮，得到濃縮液；減壓濃縮的真空度為﹣0.9MPa，轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/秒；(2)絡(luò)合萃取富集以D2EHPA作為絡(luò)合劑，石油醚作為稀釋劑，組成萃取體系，對濃縮液進行絡(luò)合萃取，D2EHPA和石油醚的體積比為1:1，分離上層液，得到富含長春質(zhì)堿的萃取液；萃取體系和濃縮液的體積比為2:1，萃取次數(shù)為4次；(3)反萃分離將富含長春質(zhì)堿的萃取液用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3％稀鹽酸反萃，稀鹽酸與萃取液的體積比為2:1，反萃次數(shù)為4次，稀鹽酸層減壓濃縮后，冷凍干燥，得到長春質(zhì)堿粗品；減壓濃縮的真空度為﹣0.9MPa，轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/秒；(4)純化將所得的長春質(zhì)堿粗品進行重結(jié)晶，具體方法為：將長春質(zhì)堿粗品用超純水溶解至終濃度為4g/l，用氨水將pH調(diào)至9后，在25℃下攪拌6h，然后靜置24h，即得。對照例2從長春花中提取分離長春質(zhì)堿的方法，包括以下步驟：(1)酶輔助超聲提取取100g長春花地上部分陰干并粉碎成粉末，得到長春花干粉，加入400ml混合酶液孵化，孵化的溫度為50℃，時間為4h；孵化結(jié)束后，過濾，留長春花粉末，加入長春花粉末5倍重量的體積分?jǐn)?shù)80％乙醇，并用鹽酸調(diào)節(jié)pH至6.8，超聲提取4次，每次4h；過濾，留提取液，將提取液減壓濃縮，得到濃縮液；所述的混合酶液包括：纖維素酶6U/ml，果膠酶7U/ml，半纖維素酶8U/ml；混合酶液的pH為7.0，混合酶液中還包括金屬離子Fe2+，F(xiàn)e2+的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％；減壓濃縮的真空度為﹣0.9MPa，轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/秒；(2)普通萃取富集調(diào)節(jié)濃縮液pH至7.8，以氯仿為萃取劑，對濃縮液進行萃取，萃取劑和濃縮液的體積比為2:1，萃取次數(shù)為4次，分離上層液，得到富含長春質(zhì)堿的萃取液，減壓濃縮，冷凍干燥，得到長春質(zhì)堿粗品；減壓濃縮的真空度為﹣0.9MPa，轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/秒；(3)純化將所得的長春質(zhì)堿粗品進行重結(jié)晶，具體方法為：將長春質(zhì)堿粗品用超純水溶解至終濃度為4g/l，用氨水將pH調(diào)至9后，在25℃下攪拌6h，然后靜置24h，即得。對照例3從長春花中提取分離長春質(zhì)堿的方法，包括以下步驟：(1)無酶輔助超聲提取取100g長春花地上部分陰干并粉碎成粉末，得到長春花干粉，加入長春花干粉5倍重量的體積分?jǐn)?shù)80％乙醇，并用鹽酸調(diào)節(jié)pH至6.8，超聲提取4次，每次6h；過濾，留提取液，將提取液減壓濃縮，得到濃縮液；減壓濃縮的真空度為﹣0.9MPa，轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/秒；(2)普通萃取富集調(diào)節(jié)濃縮液pH至7.8，以氯仿為萃取劑，對濃縮液進行萃取，萃取劑和濃縮液的體積比為2:1，萃取次數(shù)為4次，分離上層液，得到富含長春質(zhì)堿的萃取液，減壓濃縮，冷凍干燥，得到長春質(zhì)堿粗品；減壓濃縮的真空度為﹣0.9MPa，轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/秒；(3)純化將所得的長春質(zhì)堿粗品進行重結(jié)晶，具體方法為：將長春質(zhì)堿粗品用超純水溶解至終濃度為4g/L，用氨水將pH調(diào)至9后，在25℃下攪拌6h，然后靜置24h，即得。實驗例1、產(chǎn)物分析1.1、紫外光譜分析采用紫外光譜儀對本發(fā)明實施例1的純化產(chǎn)物與長春質(zhì)堿標(biāo)準(zhǔn)品同時進行檢測，結(jié)果見圖1和2。結(jié)果表明，本發(fā)明的純化產(chǎn)物與長春質(zhì)堿標(biāo)準(zhǔn)品的紫外光譜結(jié)果一致。1.2、質(zhì)譜分析采用質(zhì)譜儀對本發(fā)明實施例1的結(jié)晶產(chǎn)物進行檢測，結(jié)果見圖3。將本發(fā)明的純化產(chǎn)物質(zhì)譜數(shù)據(jù)與已知長春質(zhì)堿標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜數(shù)據(jù)對比，結(jié)果表明，本發(fā)明的純化產(chǎn)物與已知長春質(zhì)堿質(zhì)譜數(shù)據(jù)一致。1.3、HPLC法檢測產(chǎn)物的HPLC檢測：采用WatersSymmetry300C18液相色譜柱，以乙腈：水(乙腈和水均含1％甲酸)為流動相，流速1ml/min，梯度洗脫(30-90％，30min)，檢測波長230nm，可以得到較好的色譜分析結(jié)果。檢測對象：富含長春質(zhì)堿的萃取液、純化產(chǎn)物。結(jié)果分析：HPLC分析結(jié)果見圖4、5。圖4表明，萃取液中有較高含量的目標(biāo)物，萃取具有較高選擇性；圖5表明，通過重結(jié)晶，純化產(chǎn)物純度達到99％以上。1.4、回收率以實施例1-4和對照例1-3的萃取液為樣品，研究不同提取純化方法對長春質(zhì)堿的提取分離效果，采用高效液相色譜技術(shù)檢測各個樣品濃度，計算各個方法的得率(表1)。表1目標(biāo)產(chǎn)物得率的結(jié)果分析實施例1實施例2實施例3實施例4對照例1對照例2對照例3得率(％)93.292.392.493.182.180.170.1從表1中可以看出，本發(fā)明采用酶輔助超聲提取和絡(luò)合萃取相結(jié)合的方法，從長春花中提取分離長春質(zhì)堿，其長春質(zhì)堿的得率明顯高于單獨采用酶輔助超聲提取或絡(luò)合萃取的提取方法，更是遠遠高于既沒有采用酶輔助超聲提取，也沒有采用絡(luò)合萃取的提取方法，因此可以說明，本發(fā)明的酶輔助絡(luò)合萃取法能夠顯著提高從長春花中提取分離長春質(zhì)堿的得率，有效提高了長春花的資源利用率。當(dāng)前第1頁1 2 3