本發(fā)明屬于細胞免疫學領域，尤其是涉及TLR7配體GD聯合CEA抗原制備特異性GD-DC-CTL的方法和抗腫瘤過繼性免疫細胞治療應用。

背景技術：

近年來腫瘤已成為嚴重威脅人類健康的重要疾病之一。腫瘤免疫治療是臨床上繼手術、放療與化療后，用于腫瘤治療的第四大療法。其中免疫細胞治療對提高生命質量、延長生存期有顯著的效果，備受國內外推崇，是目前全身治療的最佳手段之一，臨床潛力巨大。

樹突狀細胞(DC)是人體內功能強大的主要的專職抗原提呈細胞，成熟DC表面高表達MHC-Ⅰ/Ⅱ分子、共刺激分子(CD40、CD80、CD83、CD86等)和黏附分子(LFA-3、ICAM-1等)，能誘導出抗原特異性細胞毒性淋巴細胞(CTL)反應。CTL細胞是CD3⁺CD8⁺CD28⁺的T細胞亞群，為一種特異性T細胞，對腫瘤細胞具有直接殺傷作用。

Toll樣受體(TLRs)是天然免疫系統(tǒng)中不可或缺的一部分，廣泛地表達于DC，能夠特異識別病原體表面的病原相關的分子模式(PAMPs)。在TLRs家族中，TLR7是首先被發(fā)現可以由小分子化合物激活的Toll樣受體。TLR7通過MyD88依賴的信號通路活化DC，促進DC的成熟和抗原肽的呈遞，從而活化CTL細胞，啟動獲得性免疫。本發(fā)明使用自主研發(fā)合成的小分子TLR7配體GD，9-丙酰氧基-8-羥基-2-(2-甲氧基乙氧基)-腺嘌呤，能特異性激活TLR7，有很強的佐劑作用，并具有穩(wěn)定結構、低毒性以及低成本等優(yōu)點。將TLR7配體應用于腫瘤免疫治療中，從而制備出更有效的CTL細胞。經TLR7配體刺激活化的CTL細胞，能分泌更多的細胞因子產生協同作用，提高殺瘤活性。

癌胚抗原(CEA)是一種廣為人知的廣譜腫瘤標志物。CEA是免疫球蛋白超基因家族的成員之一，不只是一種單純的腫瘤標志物，而且是與腫瘤惡性化有關的分子，在多種腫瘤中表達，可以作為腫瘤免疫治療的有效靶抗原。人們把有CEA表達的腫瘤稱為CEA陽性腫瘤，CEA陽性腫瘤包括90％以上的胃癌，腸癌，胰腺癌，70％以上的非小細胞肺癌等，目前臨床上常把CEA作為大腸癌和消化道惡性腫瘤的輔助診斷指標。

目前還沒有文獻報道過TLR7配體GD聯合CEA抗原制備特異性GD-DC-CTL的方法。

技術實現要素：

本發(fā)明的目的在于克服現有技術的不足，通過LR7配體GD(結構式如下式所示)聯合CEA抗原優(yōu)化DC-CTL細胞培養(yǎng)方案，提供一種制備時間短、擴增倍數高、CTL純度高且殺傷效果好的CEA抗原特異性GD-DC-CTL細胞的制備方法。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ12.084(brs,1H),9.954(s,1H),6.486(s,2H),4.249(t,J＝3.60Hz,2H),3.693(t,J＝5.20Hz,2H),3.584(t,J＝3.60Hz,2H),3.266(s,3H),2.205(t,J＝6.00Hz,2H),1.844(t,J＝5.60Hz,2H).¹³C NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ174.15,160.09,152.67,149.75,147.88,98.61,70.62,65.65,58.45,38.86,31.14,23.80.MS(ESI)calculated for C₁₂H₁₇N₅O₅,m/z[M+1]312.1230；found 334.1120(M+Na)⁺.

本發(fā)明所提供的CEA抗原特異性CTL細胞，是指CD3⁺CD8⁺CD28⁺T淋巴細胞為主的效應細胞，檢測其對CEA陽性的腫瘤細胞的殺傷活性可達90％左右，與對照組非特異性的CTL細胞相比顯著增強。

為實現上述目的，設計一種TLR7配體GD聯合CEA抗原制備特異性GD-DC-CTL的方法，包括如下步驟：

1)采集外周血，分離提取單個核細胞；

2)誘導活化DC細胞與CTL細胞；

3)使用TLR7配體聯合CEA抗原刺激未成熟DC細胞；

4)進一步通過細胞因子誘導未成熟DC細胞成為成熟DC細胞；

5)將成熟DC細胞與CTL細胞共培養(yǎng)，獲得具有CEA抗原特異性GD-DC-CTL細胞。

作為優(yōu)選，所述步驟1)為將血細胞用Ficoll淋巴細胞分離液進行密度梯度離心獲得單個核細胞；所述步驟2)為通過貼壁法將上述單個核細胞進一步分離獲得單核細胞和淋巴細胞。

進一步地，所述步驟1)具體為采用Ficoll密度梯度離心法分離收集，

并用生理鹽水洗滌2次，低速離心后獲得PBMCs。

所述步驟2)具體為將獲取的PBMCs重懸于AIM-V^TM培養(yǎng)基中，然后于37℃，5％C0₂和飽和濕度的培養(yǎng)箱內靜止2h,吸取其中懸浮細胞另行CTL細胞誘導培養(yǎng)，貼壁細胞則為單核細胞。

作為優(yōu)選，所述步驟3)具體包括：將含有8-10％自體滅活血漿、800-1000IU/ml GM-CSF、800-1000IU/ml IL-4、10mM TLR配體的AIM-V^TM培養(yǎng)基加入獲取的單核細胞中，繼續(xù)培養(yǎng)；培養(yǎng)2-3天后，更換新鮮培養(yǎng)基，并在新鮮培養(yǎng)基中加入10μM TLR7配體和1-2g/ml的CEA抗原，繼續(xù)培養(yǎng)；培養(yǎng)1-2天后，加入TNF-α；繼續(xù)培養(yǎng)1-2天，進行DC成熟度。

作為優(yōu)選，所述步驟3)中加入的TNF-α終濃度為8-15ng/ml；GM-CSF濃度為800IU/ml、IL-4濃度為1000IU/ml；所述的DC成熟度的檢測方法為流式細胞術。

進一步地，所述步驟3)中加入的TNF-α終濃度為10ng/ml。

作為優(yōu)選，所述步驟2)具體包括：將收集的淋巴細胞重懸于含8-10％自體滅活血漿的AIM-V^TM培養(yǎng)基中，調整細胞密度(1-2)×10⁶/ml左右，并加入IFN-γ至終濃度500-1500IU/ml,最后轉移入培養(yǎng)瓶內進行培養(yǎng)；培養(yǎng)20-28小時后加入抗CD3單抗、抗CD28單抗、IL-1α、IL-2，培養(yǎng)6、7天，其中每2-3天補加含有IL-2的新鮮培養(yǎng)基，使補加培養(yǎng)基后的細胞密度控制在(1-2)×10⁶/ml。

作為優(yōu)選，所述步驟2)中所加入的抗CD3單抗?jié)舛葹?0-500ng/ml,抗CD28單抗的濃度為50-500ng/ml,IL-1α的濃度為0.5-5ng/ml,IL-2的濃度為50-1000IU/ml。

進一步地，所述步驟2)中IFN-γ的濃度為1000IU/ml,培養(yǎng)20-28小時候加入抗CD3單抗?jié)舛葹?00ng/ml,抗CD28單抗的濃度為200ng/ml,IL-1α的濃度 為1ng/ml,IL-2的濃度為1000IU/ml。

作為優(yōu)選，所述步驟5)具體包括：將步驟4)及步驟2)中培養(yǎng)的DC和CTL收集并重懸于含有50-1000IU/ml的IL-2的AIM-V^TM培養(yǎng)基中在進行培養(yǎng)至第14-21天，每2-3天進行補加含有50-10001U/ml的IL-2的AIM-V^TM培養(yǎng)基。

進一步優(yōu)選地，所述IL-2終濃度為1000IU/ml。

本發(fā)明所制備的人GD-DC-CTL細胞主要應用于癌癥病人的治療。

本發(fā)明所用的原料和試劑除有特殊說明外，均市售可得。

本發(fā)明同現有技術相比：本發(fā)明所制備的GD-DC-CTL細胞與常規(guī)培養(yǎng)制備的CIK相比，其對CEA陽性的腫瘤細胞的殺瘤活性明顯增加，體外實驗時殺瘤活性達到90％以上，明顯高于常規(guī)方法培養(yǎng)的CIK細胞。同時也具有制備成本低廉、工序簡單、條件易控、對設備的要求較低、易于規(guī)模化生產等優(yōu)勢。

附圖說明

圖1：成熟DC形態(tài)。培養(yǎng)第7天，成熟DC在倒置顯微鏡下的形態(tài)，放大倍率為40×；

圖2：培養(yǎng)第7天流式細胞術進行DC成熟度檢測；

圖3：不同培養(yǎng)方式培養(yǎng)的外周血來源PBMCs生長曲線(n＝8)。外周血來源的PBMCs通過不同方式培養(yǎng)，在第0、7、11、15天分別用細胞計數板和細胞計數儀進行計數，將當前細胞總數除以開始培養(yǎng)時(第0天)的細胞總數，所得數值即為細胞增殖倍數。CIK組：指采用斯坦福大學應用的培養(yǎng)法培養(yǎng)的CIK細胞；DC-CTL組：指采用常規(guī)培養(yǎng)法培養(yǎng)的DC-CTL細胞；GD-DC-CTL組：指本發(fā)明所采用的培養(yǎng)方式。

圖4：采用流式細胞儀進行免疫表型檢測(n＝8)。外周血來源的PBMCs，通過不同方式培養(yǎng)，在第14天取細胞進行流式熒光抗體：抗CD3-FITC、CD8-PerCP、CD28-BV510進行表面染色并檢測。CIK組：指采用斯坦福大學應用的培養(yǎng)法培養(yǎng)的CIK細胞；DC-CTL組：指采用常規(guī)培養(yǎng)法培養(yǎng)的DC-CTL細胞；GD-DC-CTL組：指本發(fā)明所采用的培養(yǎng)方式。

圖5：采用CCK-8細胞毒活性檢測試劑盒對不同培養(yǎng)方式培養(yǎng)的外周血來源PBMCs進行細胞毒性檢測(n＝8)。通過不同方式培養(yǎng)，在第15天取細胞通過 CCK-8試劑盒進行細胞毒活性檢測。CIK組：指采用斯坦福大學應用的培養(yǎng)法培養(yǎng)的CIK細胞；DC-CTL組：指采用常規(guī)培養(yǎng)法培養(yǎng)的DC-CTL細胞；GD-DC-CTL組：指本發(fā)明所采用的培養(yǎng)方式。橫坐標：表示效靶細胞比值，E：T＝10：1表示效應細胞與靶細胞的比值為10：1，E：T＝20：1表示效應細胞與靶細胞的比值為20：1，E：T＝40：1表示效應細胞與靶細胞的比值為40：1。

圖6：GD分子結構式。

具體實施方式

下面用實例來具體說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。下面實例中凡未注明具體條件的實驗方法，均為遵照常規(guī)方法和廠家提供的操作說明執(zhí)行。

實施例1

本實施例1是分離獲得的PBMCs并進行GD-DC-CTL細胞的培養(yǎng)。包括以下步驟：

1.采集患者外周血80-100ml,經Ficoll密度梯度離心獲得單個核細胞。具體步驟為：1500轉/分，離心10分鐘，吸取上層血漿層，56℃滅活30分鐘后離心備用，用生理鹽水對倍稀釋沉淀的血細胞，人淋巴細胞分離液與稀釋血液按1：2的比例加入離心管中，2000轉/分，離心20分鐘，小心吸取白膜層，用生理鹽水洗滌2次，轉速分別為1600轉/分，1300轉/分，均離心7分鐘，即得到PBMCs。

2.通過貼壁法將上述PBMCs進一步分離獲得單核細胞和懸浮細胞。具體步驟為：將上述分離的PBMCs重懸于AIM-V^TM培養(yǎng)基中，調整細胞密度為(5-10)×10⁶/ml,總體積為10m1加入T75cm²的細胞培養(yǎng)瓶內，于37℃、5％C0₂和飽和濕度的培養(yǎng)箱內貼壁2h；輕輕晃動培養(yǎng)瓶，使未貼壁細胞重新懸??；然后收集懸浮的未貼壁細胞，則留下的貼壁細胞即為單核細胞。

3.單核細胞誘導分化為成熟的DC。具體步驟為：將20ml含有10％自體血漿、800IU/ml GM-CSF、10001U/mlIL-4的AIM-V^TM培養(yǎng)基加入上述T75cm²的培養(yǎng)瓶內，然后置于37℃、5％C0₂和飽和濕度的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。第三天(72h)吸棄10ml培養(yǎng)瓶內的培養(yǎng)基，并補加10ml新鮮的含有10％自體血漿、8001U/ml GM-CSF、10001U/mlIL-4、10μM TLR7配體GD和1-2g/ml的CEA抗原的AIM-V^TM培養(yǎng)基，其中腫瘤抗原優(yōu)選的濃度為10g/ml。在細胞培養(yǎng)的第五天，加入TNF-α(10ng/mL)。細胞培養(yǎng)的第6、7天，分別通過倒置顯微鏡和流式細胞術進行 DC形態(tài)(見圖1)和成熟度(見圖2)檢測。

4.CTL細胞的誘導培養(yǎng)。具體步驟為：將實施例1步驟2中收集的懸浮細胞重懸于含10％自體滅活血漿的AIM-V^TM培養(yǎng)基中，調整細胞密度2×10⁶/ml左右，并加入IFN-γ至終濃度1000IU/ml,最后轉移入培養(yǎng)瓶內進行培養(yǎng)。培養(yǎng)24小時后加入抗CD3單抗、IL-Iα、IL-2，培養(yǎng)6、7天，其中每2-3天補加含有IL-2的新鮮培養(yǎng)基，使補加培養(yǎng)基后的細胞密度控制在(1-2)×10⁶/ml。其中，抗CD3單抗?jié)舛葹?00ng/ml,IL-1α的濃度為1ng/ml,IL-2的濃度為10001U/ml。

5.DC-CTL細胞的誘導培養(yǎng)。具體步驟為：將實施例1步驟3、4中培養(yǎng)6-7天的DC和CTL收集并重懸于含有10001U/m1的IL-2的AIM-V^TM培養(yǎng)基中在進行培養(yǎng)至第14-21天(PBMCs分離為第0天計算)，以后每2-3天進行補加含有1000IU/ml的IL-2的AIM-V^TM培養(yǎng)基。

實施例2

本實施例2是對GD-DC-CTL細胞進行形態(tài)學和增值能力檢測。包括以下步驟：

1.DC和CTL共培養(yǎng)24小時即可見細胞沉于培養(yǎng)瓶的底部，有大量的大小不一的集落和不規(guī)則的單個核細胞。取培養(yǎng)15天的細胞100ul，加入100ul 0.4％臺盼藍染色液，活細胞不染色，死細胞染成藍色，顯微鏡下計數。本發(fā)明制備的細胞活力大于95％。

2.在第0、7、13、15天分別用細胞計數板和細胞計數儀進行計數，將當前細胞總數除以開始培養(yǎng)時的細胞總數，所得數值即為細胞增殖倍數，以此進行動態(tài)觀察細胞增殖情況并作為細胞補加新鮮培養(yǎng)基時的參考，細胞增殖倍數見圖3、表1。

表1：不同培養(yǎng)方式培養(yǎng)的外周血來源PBMCs擴增倍數(n＝8)

結果顯示，隨著培養(yǎng)時間的延長，三組細胞均在增長，第15天,DC-CTL組和GD-DC-CTL組細胞擴增倍數明顯高于CIK組，差異有統(tǒng)計學意義(P<O.05)。

實施例3

本實施例3是對GD-DC-CTL細胞進行免疫表型檢測。步驟如下：

取第15天的細胞，用含5％新生牛血清的PBS洗滌2次，調整細胞密度為1×10⁶/ml,每個檢測管內加入50ul細胞懸液，加入熒光標記抗體(抗CD3-FITC、CD8-PerCP、CD28-BV510)染色，4℃避光孵育30分鐘，用上述PBS洗滌2次，加入含有1％多聚甲醛的PBS溶液固定后，用流式細胞儀進行檢測，數據文件采用Flow Jo軟件分析，結果見圖4、表2。

表2：不同培養(yǎng)方式對外周血來源PBMCs表型影響(n＝8)

結果顯示，培養(yǎng)第15天，三組細胞中CD3⁺細胞之間差異無統(tǒng)計學意義；CD3⁺CD8⁺CD28⁺細胞中，DC-CTL組和GD-DC-CTL組均明顯高于CIK組，且差異均有統(tǒng)計學意義(P<O.05)；CD3⁺CD8⁺CD28^-細胞中,DC-CTL組和GD-DC-CTL組明顯低于CIK組，差異有統(tǒng)計學意義(P<O.05)。

實施例4

本實施例4是對GD-DC-CTL細胞進行細胞毒活性檢測。包括以下步驟：

1.取培養(yǎng)第15天的GD-DC-CTL細胞，檢測對CEA陽性腫瘤細胞株的殺傷活性。

2.調整CEA陽性腫瘤細胞密度為4×10⁴/孔，96孔板，每孔100ul,按1：10、1：20、1：40的比例與GD-DC-CTL細胞混合，各濃度均設置3復孔，同時設置單獨靶細胞(腫瘤細胞)對照、單獨效應細胞(效應細胞)對照和單獨培養(yǎng)基空白對照。

3.置于37℃、5％C02和飽和濕度的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)4小時后，每孔加入10 I 的CCK-8溶液，再培養(yǎng)4h，然后用酶標儀于450nm波長處測定吸光度OD值。

4.根據公式：殺傷率(％)：[1一(實驗組OD值一效應細胞組OD值/(腫瘤細胞組OD值)×100％計算殺傷效率。其中，公式中各OD值均為減去空白對照組OD值后的值。結果見圖5、表3。

表3：不同培養(yǎng)方式對外周血來源PBMCs細胞毒活性影響(n＝8)

結果顯示，不同效靶比之下，CIK組與DC-CTL組、GD-DC-CTL組之間差異具有統(tǒng)計學意義(P<O.05)。