本發(fā)明涉及5-氨基酮戊酸及其衍生物的鹽化合物的制備和應用，屬于藥物制備技術領域。
背景技術：
光動力學治療法(PDT，又稱光化學治療法)是利用光激活光敏性生物分子或光敏劑，產(chǎn)生治療作用的醫(yī)學技術。被光激活的光敏性分子或光敏劑可產(chǎn)生活性氧，造成對致病細胞或組織的破壞，達到治療的目的。光動力學療法是日益重要的新興療法，用途廣泛，包括用于治療和診斷多種癌癥和皮膚疾病，還能用于美容等。它的特點為局部性，安全性，高效性和多樣性，光動力學療法將在醫(yī)療領域占有不可或缺的重要地位。
在光動力學治療中，5-氨基酮戊酸(5-ALA)和它的酯類衍生物，如甲酯和己酯，是應用最廣泛的光敏劑或光敏劑前體。人體大部份細胞都能吸收5-氨基酮戊酸和它的酯類衍生物，并通過體內(nèi)血紅素生物合成途徑將其轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂袕姽饷粜缘脑策鳬X(PpIX)。癌細胞，癌前病變細胞，及病變細胞組織積累PpIX的濃度比正常細胞高，在氧的存在下，光照或光活化使PpIX激發(fā)到高能量的激發(fā)態(tài)，產(chǎn)生單線態(tài)氧和氧自由基，造成對病灶細胞或組織的損傷，導致病變細胞組織的凋亡和壞死。
作為在光動力學療法中應用最廣泛的光敏藥物，5-氨基酮戊酸，其甲酯和己酯己應用于臨床診斷和治療癌癥，癌前病變和非腫瘤性疾病。例如5-氨基酮戊酸用于治療日光性角化癥和尖銳濕疣，其甲酯在臨床上用于治療日光性角化癥和淺表性基底細胞癌等。5-氨基酮戊酸己酯用于膀胱癌手術輔助治療以及對膀胱癌和宮頸癌檢測診斷(Jichlinski等，J Urol，2003，170:226－229)。此外，5-氨基酮戊酸和其甲酯在治療中度和重度痤瘡的臨床試驗中，已取得了令人滿意的療效。5-氨基酮戊酸和其酯已在臨床試驗中用于腸鏡和胃鏡的檢測診斷，與常規(guī)方法合用能顯著提高檢測診斷效果。臨床和臨床前研究還發(fā)現(xiàn)，5-氨基酮戊酸和其酯的光動力學療法具有治療多種皮膚病的活性，包括治療細菌(Fotinos等，Antimicrob Agents Chemother，2008，52:1366-1373)和真菌感染(Calzavara-Pinton等，Photochem Photobiol，2012，88:512－522)，抗炎癥(如光化性唇炎，硬皮病)，治療與病毒和癌癥相關的皮膚病。同時還發(fā)現(xiàn)，5-氨基酮戊酸類藥物可用于美容(Jeffry等，Arch Dermatol，2005，141:1247－1252)。
光動力學治療的療效取決于光敏劑和光源對病灶組織的滲透能力，而光敏劑滲透活性尤為關鍵。因此，改進5-氨基酮戊酸類藥物對病灶組織的滲透性能進一步提高這類藥物的臨床療效和應用范圍(Donnelly等，Photochem Photobiol，2014，90:641-647)。
三氯乙酸(TCA)是小分子有機酸，具有極好的皮膚滲透性和化學侵蝕活性，被廣泛地應用于治療多種皮膚病和皮膚美容。三氯乙酸對皮膚有多種作用，可凝固表皮蛋白，破壞和消除受損的皮膚細胞；刺激皮膚表層細胞分裂，促進新細胞的生成，使天然皮膚色素均勻分布；它還具有抗菌和抗炎活性。在臨床上的三氯乙酸化學去皮(又稱化學剝離)療法，就是利用其極好的皮膚滲透腐蝕活性。三氯乙酸的皮膚滲透活性和滲透深度，與其濃度相關，不同濃度的三氯乙酸用于治療不同的皮膚病癥。低濃度的三氯乙酸(10-20%)用于淺皮或表皮的去皮治療，三氯乙酸可滲透和影響到表皮和真皮-表皮的交界處，用于治療輕度皮膚光老化，黃褐斑，粉刺性痤瘡和炎癥后紅斑。中度滲透的去皮治療法使用濃度為20-50%的三氯乙酸，三氯乙酸可從真皮滲透進入真皮乳頭層，中度滲透用于治療中度皮膚光老化，日光性角化癥和輕度痤瘡疤痕(Di Nuzzo等，Photodermatol Photoimmunol Photomed，2015，31:233-238)。高濃度的三氯乙酸(50%或更高)可滲透到真皮網(wǎng)狀層，用于治療外部尖銳濕疣(Yanofsky等，Expert Rev Dermatol，2013，8:321-332)和痤瘡疤痕(Abdel等，Dermatol Surg，2015，41:1398－404；Agarwal等，Dermatol Surg，2015，41:597-604)。
5-氨基酮戊酸光動力學療法和三氯乙酸去皮療法都已廣泛用于多種相同的皮膚疾病的治療，而且常顯示出不同的治療效果。例如，在治療痤瘡時，5-氨基酮戊酸光動力學療法對丘疹膿皰型痤瘡(炎癥性)的療效顯著，而對粉刺性痤瘡(非炎癥性)的治療效果卻不佳(Wan等，Clin Cosm Invest Dermat，2014，7:145-163)。與之相反，三氯乙酸對粉刺性痤瘡(非炎癥性)的療效良好，而對丘疹膿皰痤瘡(炎癥性)的療效不顯著(Meguid等，Dermatol Surg，2015，41:1398－1404)。這種差異可從兩種療法的不同機制得到很好的解釋。光動療法能夠選擇性地破壞皮脂腺體。而三氯乙酸能減少角質(zhì)細胞的凝聚和堵塞。因此，如將這兩種不同機制的療法有機地結(jié)合在一起，取長補短，相互協(xié)同，增強療效，這對治療多種常見性皮膚病如痤瘡和尖銳濕疣等的臨床意義和價值是顯而易見的。
5-氨基酮戊酸是內(nèi)源性活性分子，在體外不穩(wěn)定，臨床上均以其鹽酸鹽的形式來使用。例如，Levulan?(20% 5-氨基酮戊酸鹽酸鹽，DUSA Pharmaceuticals，Wilmington，美國)用于治療光化性角化癥；艾拉(20% 5-氨基酮戊酸鹽酸鹽，上海復旦張江生物)用于治療外部尖銳濕疣；Metvix?(16% 5-氨基酮戊酸甲酯鹽酸鹽，PhotoCure ASA，Oslo，挪威)用于治療淺表型基底細胞癌，鱗狀細胞癌和光化性角化癥；Hexvix?(5-氨基酮戊酸己酯鹽酸鹽，PhotoCure ASA，Oslo，挪威)用于膀胱癌的檢測；Gliolan?(5-氨基酮戊酸鹽酸鹽，Medac GmbH，Wedel，德國)用于腦外科手術中對惡性腦膠質(zhì)瘤組織的診斷。亦有臨床報道應用5-氨基酮戊酸及其酯的鹽酸鹽治療宮頸上皮內(nèi)瘤樣增生，痤瘡，鮮紅斑病，紅斑狼瘡，腸鏡和胃鏡的檢測等。
5-氨基酮戊酸鹽酸鹽有諸多缺陷：對皮膚組織滲透性較差，影響療效(Szeimies等，Photochem Phorobiol，1994，59:73-76)；光照時產(chǎn)生較強的疼痛感；對皮膚有刺激性；鹽酸鹽有吸濕性，不利于生產(chǎn)和儲存；其制劑產(chǎn)品不夠穩(wěn)定，故制劑多需臨時配制使用(Gadmar等，J Photochem Photobiol B：Biol，2002，67:187-193)。
因此，有必要開發(fā)新的5-氨基酮戊酸類衍生物以克服上述缺陷。新的5-氨基酮戊酸類衍生物，不僅要提高其皮膚滲透活性，同時也需要降低用藥引起的疼痛和刺激(Grapengiesse等，Clin Exp Dermatol，2002，27:493-497)，優(yōu)化其物理化學性質(zhì)如吸濕性和穩(wěn)定性等。我們的方法是以成鹽的形式將三氯乙酸或其衍生物引入到5-氨基酮戊酸及其衍生物(例如酯)的藥物中，成為該光敏劑或光敏劑前體藥物的一部分。與鹽酸鹽相比，5-氨基酮戊酸及其衍生物的三氯乙酸鹽可減少對皮膚的刺激；三氯乙酸制備的鹽具有易于結(jié)晶的特性，可使5-氨基酮酸及其衍生物的三氯乙酸鹽易于結(jié)晶純化和制備，不易吸潮，有利于質(zhì)量控制，貯存和提高穩(wěn)定性。三氯乙酸良好的皮膚滲透性，有利于提高5-氨基酮戊酸及其衍生物的滲透性，產(chǎn)生協(xié)同治療作用，增強臨床療效。
技術實現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的是提供一種對皮膚組織滲透性好，有協(xié)同治療作用，可用于光動力學治療，診斷和美容，對皮膚無刺激性，利于生產(chǎn)和儲存，其制劑產(chǎn)品穩(wěn)定的5-氨基酮戊酸和其衍生物的鹽化合物。
本發(fā)明的另一目的是提供5-氨基酮戊酸和其衍生物的鹽化合物在治療身體內(nèi)表面或外表面癌癥，癌前病癥，非癌癥或異常癥狀的光動力學療法的藥物或治療劑中的應用;在制備光動力學療法的診斷劑中的應用;在制備光動力學療法的美容劑中的應用。
本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的：5-氨基酮戊酸和其酯類衍生物與乙酸衍生物構(gòu)成鹽化合物，這類乙酸衍生物可以和5-氨基酮戊酸衍生物有協(xié)同的治療作用，例如，三氯乙酸具有治療皮膚病和美容的作用。除此之外，本發(fā)明所述的鹽化合物對皮膚刺激性及吸潮性低于其相對應的臨床上使用的鹽酸鹽類化合物。新鹽化合物能被細胞吸收并經(jīng)卟啉生物合成的途徑轉(zhuǎn)變成強光敏劑PpIX，可用于光動力學治療，診斷和美容。
本發(fā)明所述的鹽化合物由堿基化合物與乙酸衍生物制成，其結(jié)構(gòu)如通式(1)和(2)所示:
NH2CH2COCH2CH2COOR·X-COOH 或 NH3+CH2COCH2CH2COOR·X-COO- (1)
NH2CH2COCH2CH2CONR1R2·X-COOH 或 NH3+CH2COCH2CH2CONR1R2·X-COO- (2)
其中R可選自氫，有取代或沒有取代的烷基、環(huán)烷基、芳基；X分別代表R3YCH、R3(Y)2C或(Y)3C，其中Y選自Cl，Br，I或F；R3可選自氫、有取代或沒有取代的烷基、環(huán)烷基、或芳基；R1和R2可以相同或不同，可獨立或分別選自氫、有取代或沒有取代的烷基、環(huán)烷基、或芳基。
R、R1和R2可獨立或分別選自氫，含有1至20個碳原子的有取代或沒有取代的直鏈烷基、支鏈烷基、或環(huán)烷基；優(yōu)選為1至10個碳原子(如1至8個碳原子)，特別優(yōu)選的是甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、異丙基、異丁基、叔丁基、異戊基、異己基、環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基或環(huán)己基。其中，R、R1、R2可分別任選有一個或多個相同的或不同的，親水性或非親水性取代基。親水性取代基可選自羥基、硫醇、羧基、氨基甲酰、酯基、氨基、烷胺基、酰胺。非親水性基團可選自鹵素、硝基、氰基和芳基。所述芳基可含有一個或多個取代基，取代基選自一個或多個鹵素、羥基、硫醇、氨基、烷氨基、羰基、酯、酰胺、烷基、鹵代烷基、烷氧基(如C1－5烷氧基)，羥烷基(如C1－5羥烷基)、硝基或氰基。
通式1和2中所述酸X-COOH是乙酸衍生物，其中X代表R3YCH、R3(Y)2C或(Y)3C，Y選自Cl、Br、I或F；R3可選自氫，含有1至20個碳原子的有取代或沒有取代的直鏈烷基、支鏈烷基、或環(huán)烷基；優(yōu)選為1至10個碳原子(如1至8個碳原子)，特別優(yōu)選的是甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、異丙基、異丁基、叔丁基、異戊基、異己基、環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基或環(huán)己基。其中，R3可以任選地有一個或多個相同的或不同的，親水性或非親水性取代基。親水性取代基選自羥基、硫醇、羧基、氨基甲酰、酯基、氨基、烷氨基、酰胺。非親水性取代基選自鹵素、硝基、氰基和芳基。所述芳基可含有一個或多個取代基，取代基可選自一個或多個鹵素、羥基、硫醇、氨基、烷氨基、羰基、酯、酰胺、烷基、鹵代烷基、烷氧基（如C1－5烷氧基），羥烷基（例如C1－5羥烷基）、硝基或氰基。
所使用的術語“鹵素”，指的是氟、氯、溴或碘。術語“烷基”，除非另有說明，指的是飽和烴或不飽和烴，其目的是覆蓋任何長鏈或短鏈，直鏈或支鏈的烴基。術語“親水性取代基”表示能夠形成氫鍵的取代基。術語“非親水性取代基”表示可能或不能夠形成氫鍵的取代基。術語“芳基”指5到7元芳香族含0-4雜原子，雜原子選自氮、氧或硫。
以下是本發(fā)明所述5-氨基酮戊酸和其衍生物的新鹽化合物中優(yōu)選的乙酸衍生物:
2-氯乙酸，
2,2,2-三氯乙酸，
以下是本發(fā)明優(yōu)選的新鹽化合物:
5-氨基酮戊酸 2-氯乙酸鹽，
5-氨基酮戊酸 2,2,2-三氯乙酸鹽，
5-氨基酮戊酸甲酯 2-氯乙酸鹽，
5-氨基酮戊酸甲酯 2,2,2-三氯乙酸鹽，
5-氨基酮戊酸乙酯 2-氯乙酸鹽，
5-氨基酮戊酸乙酯 2,2,2-三氯乙酸鹽，
5-氨基酮戊酸丙酯 2-氯乙酸鹽，
5-氨基酮戊酸丙酯 2,2,2-三氯乙酸鹽，
5-氨基酮戊酸丁酯 2-氯乙酸鹽，
5-氨基酮戊酸丁酯 2,2,2-三氯乙酸鹽，
5-氨基酮戊酸戊酯 2-氯乙酸鹽，
5-氨基酮戊酸戊酯 2,2,2-三氯乙酸鹽，
5-氨基酮戊酸己酯 2-氯乙酸鹽，
5-氨基酮戊酸己酯 2,2,2-三氯乙酸鹽，
5-氨基酮戊酸芐酯 2-氯乙酸鹽，
5-氨基酮戊酸芐酯 2,2,2-三氯乙酸鹽，
5-氨基酮戊酸2-甲基芐酯 2-氯乙酸鹽，
5-氨基酮戊酸2-甲基芐酯 2,2,2-三氯乙酸鹽，
5-氨基酮戊酸4-甲基芐酯 2-氯乙酸鹽，
5-氨基酮戊酸4-甲基芐酯 2,2,2-三氯乙酸鹽，
5-氨基酮戊酸4-氯芐酯 2-氯乙酸鹽，
5-氨基酮戊酸4-氯芐酯 2,2,2-三氯乙酸鹽，
5-氨基酮戊酸4-硝基芐酯 2-氯乙酸鹽，
5-氨基酮戊酸4-硝基芐酯 2,2,2-三氯乙酸鹽，
5-氨基酮戊酸4-異丙基芐酯 2-氯乙酸鹽，
5-氨基酮戊酸4-異丙基芐酯 2,2,2-三氯乙酸鹽，
根據(jù)可釆用的起始原料，本發(fā)明提供了5-氨基酮戊酸及其酯衍生物的新鹽化合物的制備方法。一種方法是以 Cl-NH3+CH2COCH2CH2COOR 或 Cl-NH3+CH2COCH2CH2CONR1R2 鹽酸鹽(或其他鹽，如磷酸鹽)為起始物，其中R、R1和R2如權(quán)利要求1和2所述，先用堿中和，然后加入一種本發(fā)明所述的酸而得到目的鹽化合物。另一種方法是以帶氨基保護基的NH2CH2COCH2CH2COOR 或NH2CH2COCH2CH2CONR1R2 為起始原料，其中R、R1和R2如權(quán)利要求1和2所述，在一種本發(fā)明所述酸的存在下，除去保護基即得目的化合物，此方法為一步合成法。所用氨基保護基包括但不限于叔丁氧羰基(Boc)，芐基(Bn)或芐氧羰基(Cbz)。Boc保護基可在酸性條件下除去，Bn或Cbz保護基可催用化氫解除去，所用的催化劑包括鈀或鉑類催化劑，亦可釆用Rany鎳或其它已報道的催化劑或方法。
另一種制備方法是離子交換樹脂法，可使用酸性或堿性離子交換樹脂，優(yōu)選的樹脂是堿性離子交換樹脂。如使用Amberlyst 26(OH)柱層析方法，5-氨基酮戊酸酯或其衍生物鹽酸鹽(或磷酸鹽)的Cl一離子被0H一離子交換，得到的流出液與一種本發(fā)明所述的酸混合而得到相應的鹽化合物。另外，亦可將適量的Amberlyst 26(OH)樹脂和5-氨基酮戊酸酯或其衍生物的鹽酸鹽(或磷酸鹽)在溶劑中攪拌，濾除樹脂后，將濾液和一種本發(fā)明所釆用的酸混合，得到目的鹽化合物。離子交換樹脂法釆用的樹脂均有市場供應。
在上述的制備過程中，釆用本領域熟知的操作方法，反應可在-20到100oC條件下進行，可根據(jù)所用溶劑和反應完成程度，優(yōu)化反應條件。反應溶劑可以是本領域熟知的一種或混合溶劑，包括但不限于甲醇，乙醇，丙醇，異丙醇，丁醇，異丁醇，叔丁醇，丙酮，乙醚，乙酸乙酯，乙腈，四氫呋喃，二氯甲烷，石油醚，正己烷，環(huán)己烷，N，N－二甲酰胺和水等。本發(fā)明所述的5-氨基酮戊酸及其衍生物(例如酯)的鹽化合物可用上述的一種或混合溶劑進行重結(jié)晶純化。
本發(fā)明所述的鹽化合物可被細胞吸收，并轉(zhuǎn)化成具有高光敏活性的原卟啉IX，顯示這些新鹽化合物可用于光動力學治療，診斷和美容。本發(fā)明所述鹽化合物可直接應用，或優(yōu)選地制成藥物制劑或藥物組合物使用。由此，本發(fā)明的另一個方面是關于藥物組合或藥物制劑及美容制劑的制備，其中含有該發(fā)明所述的一個鹽化合物以及至少一個藥學上可接受的或美容上可接受的輔料，添加劑，溶解介質(zhì)，載體或賦形劑，還可任選地加入一個或多個其它治療劑，或增效劑等。
本發(fā)明所述的化合物可用于身體的內(nèi)部表面和外部表面的患病處或美容部位，施以有效劑量以提高給藥部位細胞內(nèi)PpIX的生成和聚集，然后用適當?shù)墓庠凑丈渲委煵课换虮┞吨委煵课挥谌展?，誘發(fā)產(chǎn)生光動力學反應，引起患病細胞組織的凋亡和壞死，達到治療目的。
本發(fā)明提供的鹽化合物與對應的用在臨床的鹽酸鹽相比，有諸多優(yōu)點。本發(fā)明所述的鹽化合物比對應鹽酸鹽的吸濕性低，由此可以降低因含水量高引起的不穩(wěn)定性和分解，有利于生產(chǎn)中的質(zhì)量控制和儲存。另外，本發(fā)明公布的鹽化合物對皮膚的刺激比其相對應的鹽酸鹽小。當給藥部位是皮膚敏感處時，如尿道和宮頸，降低藥物刺激性十分重要，特別是在需要多次給藥的情況下，可使病人完成治療。在細胞熒光的測試中，本發(fā)明所述的鹽化合物引發(fā)PpIX生成的活性與其相對應的鹽酸鹽相當。更重要的是，本發(fā)明提供的鹽化合物組成中的三氯乙酸本身具有治療皮膚病和美容的多種生物活性，及極好的皮膚滲透性，可與5-氨基酮戊酸及其酯衍生物協(xié)同地損壞治療部位的患病細胞和組織，同時還可提高5-氨基酮戊酸及其酯衍生物的皮膚滲透能力，增強療效。
本發(fā)明提供的5-氨基酮戊酸及其酯衍生物的鹽化合物或藥物制劑可外用，口服和注射。外用是指施藥于身體外表面和內(nèi)表面。優(yōu)選的使用方法是用于治療身體外表面和內(nèi)表面疾病和失調(diào)的光動力學療法，治療癌癥(如非黑色素瘤皮膚癌)，癌前病變和非腫瘤性疾病。這些疾病和失調(diào)包括但不限于基底細胞癌，宮頸上皮內(nèi)瘤變、光化性角化病、脂溢性角化病、鱗狀細胞癌、Bowen病、外陰佩吉特病、痤瘡、銀屑病、鮮紅斑痣、紅斑狼瘡、尖銳濕疣、難治性掌跖疣、皮膚T細胞淋巴瘤；細菌感染（如革蘭氏陰性株大腸桿菌，銅綠假單胞菌，革蘭氏陽性菌耐甲氧西林金黃色葡萄球菌)，真菌感染（如白色念珠菌，T癬菌)，與炎癥疾病和病毒感染相關的疾病(如病毒疣、皰疹等)。本發(fā)明公布的鹽化合物及其藥物制劑也可用于各種腫瘤的光動力學檢測診斷或治療診斷，包括但不限于治療診斷檢測膀胱癌，腸癌，胃癌，肺癌，腦癌，肝癌，胰腺癌，宮頸癌，前列腺癌，卵巢癌，乳腺癌，皮膚癌，口腔癌，鼻癌，咽喉癌和囊腫等。病變和失調(diào)的細胞組織積累PpIX的濃度比正常細胞高，可通過熒光強度的檢測進行病癥診斷。
這里所描述的身體的內(nèi)表面和外表面是皮膚，所有上皮和黏膜表面。包括但不限于皮膚和結(jié)膜，口腔，鼻腔，鼻竇，氣管、支氣管的內(nèi)壁；咽喉、食道、胃、腸、直腸、膽管和肛門管的內(nèi)壁；輸尿管、膀胱和尿道的內(nèi)膜，陰道、子宮頸和子宮的內(nèi)壁等。
本發(fā)明公布的鹽化合物和藥物制劑亦可用于光動力學美容，包括但不限于治療痤瘡、彌漫性或斑點色素沉著、酒渣鼻、皮脂腺增生、嫩膚、光老化、皺紋、擴大的毛孔和皮膚紋理、太陽照射引起的皮膚粗糙、觸覺粗糙、灰黃和晦暗皮膚、疤痕等。
本發(fā)明所述的鹽化合物可與至少一種藥學上或美容上可接受的藥物輔料，添加劑，載體或賦形劑制得藥物制劑或美容劑，其形式可以是藥物制劑中任何常規(guī)形式的制劑，適合于皮膚和身體的內(nèi)表面給藥，全身給藥或口服?？诜?，皮下或靜脈注射藥物的形式包括片劑，膠囊，懸浮液和溶液等。優(yōu)選的劑型是外用(皮膚和身體的內(nèi)表面)，可以是水劑，油劑，貼劑，透皮吸收劑，霜劑，粉劑，滴劑，噴霧劑，軟膏，油膏，陰道栓劑，栓劑，納米制劑。所用載體和賦形劑包括但不限于水或油基、增稠劑、膠凝劑、水凝膠、乳化劑，納米乳化劑、增溶劑、分散劑、穩(wěn)定劑、懸浮劑、色劑或推進劑、防腐劑、潤滑劑、增滲劑、以及pH調(diào)節(jié)劑等。這些劑型和制劑的制備方法及技術都是本領域所熟知的。所需輔料，添加劑，賦型劑或載體均可從市場購得，其使用方法和技術也是本領域所熟知的，并且出版在文獻中(例如，Hoepfner等，F(xiàn)iedler Encyclopedia of Excipients for Pharmaceuticals，Cosmetics and Related Areas，Edition Cantor，Munich，2002）。
本發(fā)明所述的鹽化合物可以制成片劑、膠囊、懸浮液或溶液用于口服或注射（如皮下、肌肉、腹腔或靜脈注射)，在此所述的劑型中含有一個本發(fā)明所述的鹽化合物和一個或多個載體或稀釋劑。載體和稀釋劑包括但不限于水，乙醇，甘油，山梨糖醇，玉米淀粉，乳糖，蔗糖，微晶纖維素，硬脂酸鎂，聚乙烯吡咯烷酮、檸檬酸、酒石酸、丙二醇，硬脂醇，聚乙二醇，羧甲基纖維素，脂肪物質(zhì)，生理鹽水或緩沖溶液。以上所述制劑可釆用本專業(yè)人員熟知的或已發(fā)表的方法制得。
在藥物組合或藥物制劑中，本發(fā)明所述的新鹽化合物的重量含量可在0.01-95%(w/w或w/v)范圍，優(yōu)選的含量為0.1-50%，例如0.1-30%。有效使用劑量可受多種因素影響，如年齡，體重，所治療的疾病，不同的用途(治療，診斷或美容)等，有效使用劑量范圍可在每天0.001-5克，優(yōu)選的劑量為每天0.01-2克。
本發(fā)明所述的鹽化合物或藥物組合或藥物制劑在用藥后，用特定波長的光照射用藥部位，使PpIX激發(fā)到高能量激發(fā)態(tài)，產(chǎn)生單線態(tài)氧和氧自由基，造成病變細胞組織的凋亡和壞死。光照射的操作可按本領域熟知的技術方法進行實施，所需光的波長和強度是本領域熟知的。光源選自燈，激光，發(fā)光二極管燈或日光(Rubel等，British J Dermat，2014，171:1164－1171)，不易達到的部位可使用光導纖維。處理部位的用藥時間為0.01-12小時，優(yōu)選為0.5-4小時。所選用的光源波長在300-1200納米范圍，優(yōu)選波長范圍在380-800納米。照射的劑量可在5-150焦耳/cm2范圍，優(yōu)選劑量為20-120焦耳/cm2。在光動力學診斷中，首先用白光（例如600-750納米）觀測，然后用藍光（如380-440納米）照射檢測熒光強度，診斷出病變部位。
本發(fā)明所述的鹽化合物及其藥物制劑可以與任何己在文獻中發(fā)表的其它光敏劑合用（如Photofrin，竹紅菌素等），以提高藥效；與任何己在文獻中發(fā)表的螯合劑合用（如CDTA，EDTA等），用以螯合亞鐵離子，阻斷從PpIX到血紅素的轉(zhuǎn)變，提高PpIX的聚集和吸收；以及與己在文獻中發(fā)表的任何表面滲透劑合用(如DMSO，表面活性劑或非表面活性劑脂肪酸，膽鹽等)，以提高本發(fā)明所述鹽的滲透吸收。本發(fā)明所述的鹽化合物亦可與其它治療皮膚病癥的藥物合并使用(如三氯乙酸，抗生素等)。
本發(fā)明提供應用試劑盒供光動力學治療，診斷或美容使用，包括單瓶包裝：含有有效劑量的任何一個本發(fā)明所述鹽化合物或藥物制劑。亦可是雙瓶包裝：A瓶含有有效劑量的任何一個本發(fā)明提供的鹽化合物或其藥物制劑；B瓶含有溶解介質(zhì)(如水，緩沖液，軟膏，油膏，乳霜，凝膠等常規(guī)使用的溶解介質(zhì))，或一個或多個載體或賦形劑、螯合劑、表面滲透劑，治療劑，或其他光敏劑等。
本發(fā)明的另一方面涉及通過檢測體液和組織樣本的熒光強度進行疾病的檢測和診斷，即在避光的條件下，將本發(fā)明的鹽化合物與體液或組織樣本混合和孵化，然后用適當?shù)墓庹丈浠旌衔?如藍光380-440納米)，病變細胞可引起熒光強度增加。所述的體液和組織包括但不限于唾液、尿液、血液、糞便、精液、眼淚、脊髓液和活檢標本等。
本發(fā)明還涉及用于協(xié)助外科醫(yī)生切除腫瘤組織的體內(nèi)檢測和診斷方法，即在腫瘤手術前口服或手術過程中局部施予本發(fā)明提供的鹽化合物或藥物制劑，因為腫瘤細胞產(chǎn)生的PpIX比正常細胞產(chǎn)生的多，當用藍光照射時(如380-440納米)，可以根據(jù)熒光強度的差別直觀地鑒別和區(qū)分腫瘤組織和正常組織，更準確地切除腫瘤組織。
具體實施方式：
以下實施例是非限制地對本發(fā)明的說明，任何修改變換均在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
縮寫：
5-ALA：5-氨基酮戊酸，
Bn：芐基，
Boc：叔丁氧羰基，
Cbz：芐氧羰基，
CDTA：1，2-環(huán)己二胺四乙酸，
DMSO：二甲基亞砜，
EDTA：乙二胺四乙酸，
HCl：鹽酸，
PBS：磷酸緩沖生理鹽水，
PDT：光動力學療法，
PpIX：原卟啉IX，
TCA：三氯乙酸，
NMR：核磁共振，
ppm：百萬分率，
mM：毫摩爾。
實施例 1：
5-氨基酮戊酸三氯乙酸鹽：將5-N-Cbz-氨基酮戊酸(2.7克，10毫摩爾)溶解于甲醇(35毫升)中，加入鈀碳(10%，0.5克)和三氯乙酸(1.6克，10毫摩爾)。攪拌下常壓氫化24小時。反應液過濾，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，得到5-氨基酮戊酸三氯乙酸鹽白色固體(2.7克，92%)。1H NMR(D2O，360MHz)δppm：2.65（t，j=6Hz，2H），2.85（t，j=6Hz，2H)，4.03(s，2H）。
實施例2：
5-氨基酮戊酸甲酯三氯乙酸鹽：將5-氨基酮戊酸甲酯鹽酸鹽(1.8克，10毫摩爾)加至乙酸乙酯(50毫升)和水(20毫升)的混合液中，加入碳酸氫鈉（1.7克，20毫摩爾）后振搖。分出有機相，水相用乙酸乙酯萃取(30毫升x2)，合并萃取液并用無水硫酸鈉干燥，過濾除去硫酸鈉，向濾液中加入三氯乙酸(1.6克，10毫摩爾)，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到白色固體5-氨基酮戊酸甲酯三氯乙酸鹽(1.7克，55%)。1H NMR(D2O，360MHz)δppm：2.62(t，j=6Hz，2H)，2.82(t，j=6Hz，2H)，3.60(s，3H)，4.03(s，2H)。
實施例3：
5-氨基酮戊酸乙酯三氯乙酸鹽：將5-N－Boc-氨基酮戊酸乙酯（2.6克，10毫摩爾)溶解在四氫呋喃（20毫升)中，加入三氯乙酸（1.6克，10毫摩爾)。攪拌下60oC反應2小時，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到固體5-氨基酮戊酸乙酯三氯乙酸鹽(2.5克，78%)。1H NMR(D2O，360MHz）δppm：1.23(t，j=7Hz，3H)，2.64(t，j=6Hz，2H)，2.83(t，j=6Hz，2H)，4.03(m，4H)。
實施例4：
5-氨基酮戊酸己酯三氯乙酸鹽：將5-氨基酮戊酸己酯鹽酸鹽(2.5克，10毫摩爾)溶于50%乙醇水溶液(10毫升)中，該溶液通過5克Amberlyst 26(OH)的填充柱，用50%乙醇水溶液(20毫升)洗滌，流出液加至三氯乙酸(1.6克，10毫摩爾)的乙醇溶液(5毫升)中。減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到白色固體5-氨基酮戊酸己酯三氯乙酸鹽(2.1克，56%)。1H NMR(D2O，360MHz)δppm：0.77(t，j=6Hz，3H)，1.21(br，6H)，1.53(m，2H），2.62（t，j=6Hz，2H），2.83（t，j=6Hz，2H），4.03（m，4H）。
本發(fā)明所述的下列鹽化合物可用實施例1-4方法制備：
5-氨基酮戊酸 2-氯乙酸鹽，
5-氨基酮戊酸甲酯 2-氯乙酸鹽，
5-氨基酮戊酸乙酯 2-氯乙酸鹽，
5-氨基酮戊酸丙酯 2-氯乙酸鹽，
5-氨基酮戊酸丙酯 2,2,2-三氯乙酸鹽，
5-氨基酮戊酸丁酯 2-氯乙酸鹽，
5-氨基酮戊酸丁酯 2,2,2-三氯乙酸鹽，
5-氨基酮戊酸戊酯 2-氯乙酸鹽，
5-氨基酮戊酸戊酯 2,2,2-三氯乙酸鹽，
5-氨基酮戊酸己酯 2-氯乙酸鹽。
本發(fā)明所述的下列鹽化合物可優(yōu)選使用實施例2-4方法制備：
5-氨基酮戊酸芐酯 2-氯乙酸鹽，
5-氨基酮戊酸芐酯 2,2,2-三氯乙酸鹽，
5-氨基酮戊酸2-甲基芐酯 2-氯乙酸鹽，
5-氨基酮戊酸2-甲基芐酯 2,2,2-三氯乙酸鹽，
5-氨基酮戊酸4-甲基芐酯 2-氯乙酸鹽，
5-氨基酮戊酸4-甲基芐酯 2,2,2-三氯乙酸鹽，
5-氨基酮戊酸4-氯芐酯 2-氯乙酸鹽，
5-氨基酮戊酸4-氯芐酯 2,2,2-三氯乙酸鹽，
5-氨基酮戊酸4-硝基芐酯 2-氯乙酸鹽，
5-氨基酮戊酸4-硝基芐酯 2,2,2-三氯乙酸鹽，
5-氨基酮戊酸4-異丙基芐酯 2-氯乙酸鹽，
5-氨基酮戊酸4-異丙基芐酯 2,2,2-三氯乙酸鹽。
實施例5：
吸濕性測定：用樣品重量和外觀的變化測定了本發(fā)明所述的鹽化合物的吸濕和潮解能力，并與其相對應的鹽酸鹽做了比較。將測定鹽化合物(0.2-0.4克)放置在濕度為70-85%的密閉容器中，室溫24小時后，觀察重量和外觀的變化。5-氨基酮戊酸，甲酯和己酯的鹽酸鹽和5-氨基酮戊酸三氯乙酸鹽均有吸濕現(xiàn)象，重量增加25-50%，且潮解成液態(tài)。而5-氨基酮戊酸甲酯三氯乙酸鹽重量增加<5%，5-氨基酮戊酸己酯三氯乙酸鹽的重量保持不變，甲酯和己酯的三氯乙酸鹽的固體外觀未發(fā)生変化。結(jié)果表明，三氯乙酸鹽吸潮性低，有利于生產(chǎn)中的質(zhì)量控制，亦可在長期儲存中減小因吸濕而造成的分解。
實施例 6：
皮膚刺激實驗：釆用對舌頭表面的刺激測定了本發(fā)明所述新鹽化合物對皮膚的刺激，并與其相對應的鹽酸鹽進行了比較。將3毫克樣品放置受試者舌頭表面，3到5分鐘之后記錄受試者的感受，測試結(jié)果列于表1中。結(jié)果表明，5-氨基酮戊酸(或酯)的三氯乙酸鹽引起的對皮膚的刺激顯著低于其相對應的鹽酸鹽。
表 1. 皮膚刺激實驗(A:無刺激，B:有刺激，C:較強刺激，D:強刺激)
實施例 7：
誘導細胞生成PpIX的活性測定：使用人肺癌A549細胞(ATCC，Rockville，MD，USA)測定了熒光生成和強度，將本發(fā)明所述三氯乙酸鹽誘導原卟啉IX生成的活性與對應的鹽酸鹽進行了比較。化合物的測定濃度(表2)：5-氨基酮戊酸鹽酸鹽，5-氨基酮戊酸甲酯鹽酸鹽，5-氨基酮戊酸三氯乙酸鹽和5-氨基酮戊酸甲酯三氯乙酸鹽為10毫摩爾；5-氨基酮戊酸己酯鹽酸鹽和5-氨基酮戊酸己酯三氯乙酸鹽為0.5毫摩爾或1毫摩爾。待測化合物用無菌生理鹽水制成原料液，測試前以碳酸鈉調(diào)pH到7-7.5，用新鮮培養(yǎng)液稀釋至所需測試濃度。用含10％胎小牛血清的F12培養(yǎng)液(Gibco)將A549細胞配成單個細胞懸液，以5×104/ml接種到48或96孔培養(yǎng)板，將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱，在37oC和5%CO2的潮濕環(huán)境中培養(yǎng)24小時，至細胞匯集率60-70%。測試前用PBS洗細胞兩次，加入含有測試化合物的新鮮培養(yǎng)液，每個測定3個復孔，以錫箔紙包裹避光培養(yǎng)。分別在4，8和24小時檢測生成PpIX的水平。除去培養(yǎng)液，用PBS洗細胞兩次，測定PpIX生成含量(CytoFluor Series 4000，Multi-Well Plate Reader，PerSeptive Biosystems，F(xiàn)ramingham，MA，USA)，激發(fā)光源為360±40納米，檢測光源為620±40納米。
結(jié)果顯示(表2)，5-氨基酮戊酸三氯乙酸鹽，其甲酯三氯乙酸鹽和己酯三氯乙酸鹽均具有與其相對應的鹽酸鹽相似的誘導細胞生成PpIX的活性。此外，當己酯的三氯乙酸鹽和其鹽酸鹽的測定濃度提高至2-5mM時，兩種鹽的活性相似，且比5-氨基酮戊酸和其甲酯的鹽(三氯乙酸鹽和鹽酸鹽)的活性高70-100倍。
表 2. A549細胞測定PpIX的生成：
*誘導PpIX生成的相對活性
實施例8：
溶液制劑1：將5-氨基酮戊酸己酯三氯乙酸鹽（250毫克）溶解在0.9%的氯化鈉溶液（5毫升)中，制得含量為5%的5-氨基酮戊酸己酯三氯乙酸鹽生理鹽水制劑。可以根據(jù)不同的治療要求(如治療檢測診斷膀胱癌，腸癌，胃癌)，使用不同的緩沖液如磷酸緩沖生理鹽水(PBS)，制得類似的溶液制劑。
實施例 9：
溶液制劑2：將5-氨基酮戊酸己酯三氯乙酸鹽（250毫克）溶解在含三氯乙酸(0.1克)的0.9%的氯化鈉水溶液(5毫升)中，制得含2%三氯乙酸和5%5-氨基酮戊酸己酯三氯乙酸鹽的生理鹽水溶液制劑。可使用不同的緩沖液如磷酸緩沖生理鹽水(PBS)，制得類似的溶液制劑。
實施例 10：
凝膠制劑1：將羥乙基纖維素凝膠（4.37g，1-2%，MW 725,000或250,000）加到5-氨基酮戊酸三氯乙酸鹽（630毫克)中，混合均勻，得到透明凝膠，5-氨基酮戊酸三氯乙酸鹽的含量為126毫克/克。
實施例 11：
凝膠制劑2：將羥乙基纖維素凝膠(4.37g，1-2%，MW 725,000或250,000）加到三氯乙酸(50毫克)和5-氨基酮戊酸三氯乙酸鹽（630毫克）的混合物中，混合均勻，制得含1%三氯乙酸和125毫克/克5-氨基酮戊酸三氯乙酸鹽的透明凝膠。
實施例 12：
乳霜制劑1：將5-氨基酮戊酸甲酯三氯乙酸鹽(1.5克)與默克軟膏(8.5克，Unguentum Merck)完全混合，得到含量為150毫克/克的5-氨基酮戊酸甲酯三氯乙酸鹽乳霜制劑。
實施例 13：
乳霜制劑2：將5-氨基酮戊酸甲酯三氯乙酸鹽(1.5克)和三氯乙酸(0.3克)的混合物與默克軟膏(8.2克，Unguentum Merck)完全混合，得到含有3%三氯乙酸和150毫克/克5-氨基酮戊酸甲酯三氯乙酸鹽的乳霜制劑。